Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của klebsiella pneumoniae đề kháng carbapenem qua cơ chế kpc
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.98 MB, 142 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN NHẬT PHƯƠNG
TRẦN NHẬT PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM QUA CƠ CHẾ KPC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN NHẬT PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ĐỀ KHÁNG CARBAPENEM QUA CƠ CHẾ KPC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Phản biện 1: TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện 2: TS. Nguyễn Thị Bạch Huệ
Phản biện 3: TS. Nguyễn Đỗ Phúc
Phản biện độc lập 1: TS. Ngô Thị Hoa
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Đỗ Phúc
Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC
TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN
TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi và tập thể cán bộ
hướng dẫn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công
bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Nghiên cứu sinh
TRẦN NHẬT PHƯƠNG
Trần Nhật Phương
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của
Klebsiella pneumoniae đề kháng carbapenem qua cơ chế KPC”, tôi đã được sự giúp
đỡ của Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Khoa Sinh học Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP.HCM. Tôi xin trân trọng sự giúp đỡ đó.
Em xin bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn chân thành đến GS.TS Trần Linh
Thước và TS.BS. Phạm Hùng Vân, những người Thầy tận tâm đã luôn hướng dẫn,
định hướng nghiên cứu, truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, và quan trọng
trong thời gian thực hiện đề tài. Thầy mãi là tấm gương sáng cho em trên con đường
học tập và nghiên cứu.
Xin cảm ơn TS. Nguyễn Đức Hoàng và TS. Phan Thị Phượng Trang đã quan
tâm, giúp đỡ, thảo luận và đưa ra những đề nghị cho luận án của tôi. Cảm ơn các bạn
và các em đang làm việc tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học đã luôn hỗ
trợ tôi trong q trình làm thí nghiệm.
Cảm ơn Phịng xét nghiệm Kỹ thuật cao Nam Khoa Biotek, đã tạo điều kiện
cho tôi trong khi làm thực nghiệm.
Xin cảm ơn Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU) và TS. Ngơ
Thị Hoa đã cung cấp và hổ trợ tơi có được các chủng giống chuẩn ATCC dùng trong
nghiên cứu.
Tôi muốn gởi lời đặc biệt nhất đến em, người vợ yêu quý của tôi, Nguyễn Thúy
Lan Chi, đến hai con Nguyên Cát và Nguyên Khang, đã âm thầm hy sinh và tạo điều
kiện tốt nhất để tơi hồn thành nghiên cứu luận án này;
Cảm ơn các anh em, bạn hữu đã ln khích lệ và hỗ trợ tơi trong giai đoạn
nghiên cứu thực hiện luận án.
Và trên hết, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba, Mẹ và gia đình,
những người đã ln ở bên cạnh, u thương và động viên con trong quá trình làm
việc và học tập.
Xin trân trọng cảm ơn!
Trần Nhật Phương
MỤC LỤC
MỤC LỤC ........................................................................................................................ i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... ix
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ x
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae ............................................................................ 4
1.1.1. Đặc điểm phân loại ................................................................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố .............................................................. 5
1.1.3. Các yếu tố độc lực của K. pneumoniae .................................................................. 6
1.1.4. Cấu trúc di truyền của K. pneumoniae .................................................................. 8
1.1.5. Sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K. pneumoniae ...................................... 10
1.2. Kháng sinh họ -lactam và cơ chế kháng -lactam ........................................... 12
1.2.1. Kháng sinh ........................................................................................................... 12
1.2.2. Kháng sinh họ -lactam ....................................................................................... 15
1.3. Carbapenem và các cơ chế đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae ............... 23
1.3.1. Kháng sinh Carbapenem ...................................................................................... 23
1.3.2. Cơ chế kháng carbapenem ở K. pneumoniae thông qualactamase ............... 25
1.3.3. Cơ chế kháng do sản xuất quá mức -lactamase kết hợp giảm biểu hiện porin ở
ngoài màng tế bào vi khuẩn ........................................................................................... 29
1.3.4. Cơ chế đề kháng thông qua bơm đẩy kháng sinh ................................................ 31
1.4. Tình hình nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae ............... 32
1.4.1. Nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae trên thế giới .............. 32
i
1.4.2. Nghiên cứu tính đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae tại Việt Nam .............. 33
1.5. Các thách thức trong phát hiện K. pneumoniae đề kháng carbapenem .......... 36
1.5.1. Các phương pháp phát hiện K. pneumoniae đề kháng carbapenem ................... 36
1.5.2. Khó khăn trong phát hiện các K. pneumoniae đề kháng carbapenem ................ 38
1.6. Các vấn đề cần nghiên cứu về tính kháng carbapenem ở K. pneumoniae ....... 39
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 39
2.1.1. Các chủng vi khuẩn và plasmid ............................................................................ 39
2.1.2. Mồi cho phản ứng PCR ........................................................................................ 39
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................................... 41
2.1.4. Thiết bị ................................................................................................................. 42
2.2. Phương pháp .......................................................................................................... 43
2.2.1. Phương pháp định danh vi khuẩn ........................................................................ 43
2.2.2. Phương pháp kháng sinh đồ xác định K. pneumoniae kháng kháng sinh ........... 43
2.2.3. Phương pháp phát hiện vi khuẩn có khả năng sinh carbapenemase ................... 43
2.2.4. Phương pháp xác định kiểu gen đề kháng của K. pneumoniae ........................... 46
2.2.5. Phương pháp xác định kiểu gen mã hóa KPC ..................................................... 47
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính KPC trong dịch đồng nhất sinh khối vi khuẩn 49
2.2.7. Tạo dịng và biểu hiện gen mã hóa KPC-2 bằng promoter tự nhiên ................... 49
2.2.8. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa KPC-2 với promoter T7 ........... 52
2.2.9. Kiểm tra sự biểu hiện của carbapenemase tái tổ hợp .......................................... 54
2.2.10. Phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền tính kháng carbapenem ........... 56
2.2.11. Sơ đồ nghiên cứu ................................................................................................ 57
2.3. Xử lý và phân tích số liệu ..................................................................................... 58
ii
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
3. 1. Thu nhận, khảo sát mức độ kháng thuốc của các chủng K. pneumoniae đề
kháng carbapenem ....................................................................................................... 59
3.1.1 Thu nhận, xác nhận các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem ..................... 59
3.1.2. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae .............................. 59
3.1.3. Mức độ đề kháng carbapenem của các chủng ..................................................... 61
3.2. Nghiên cứu kiểu gen đề kháng carbapenem của các chủng K. pneumoniae.... 62
3.2.1. Kiểm tra sự hiện diện của gen mã hóa KPC và NDM-1 ở các chủng ................. 62
3.2.2. Kiểm tra sự hiện diện của các gen mã hóa ESBL ở các chủng ........................... 64
3.2.3. Kiểm tra sự hiện diện của gen mã hóa -lactamase AmpC ở các chủng ............ 66
3.3. Nghiên cứu đặc điểm kháng carbapenem do KPC ở K. pneumoniae đề kháng
carbapenem ................................................................................................................... 69
3.3.1. Kiểm chứng kiểu hình sinh carbapenemase của các chủng K. pneumoniae đề
kháng carbapenem ......................................................................................................... 70
3.3.2. Giải trình tự xác định gen mã hóa KPC .............................................................. 72
3.3.3. Kiểm chứng hoạt tính enzym KPC trong dịch đồng nhất sinh khối chủng .......... 73
3.3.4. Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa KPC-2 .......................................................... 74
3.3.5. Biểu hiện thu nhận KPC-2 tái tổ hợp dùng làm kháng nguyên ........................... 77
3.3.6. Gây đáp ứng miễn dịch và thu nhận kháng huyết thanh chứa kháng thể
kháng KPC-2 ................................................................................................................ 79
3.3.7. Xác nhận biểu hiện của gen mã hóa KPC-2 ở các chủng K. pneumoniae đề
kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 bằng Western blot ................................. 80
3.4. Nghiên cứu khả năng lan truyền tính đề kháng theo chiều ngang của các
chủng K. pneumoniae kháng carbapenem theo cơ chế KPC .................................... 82
iii
3.4.1. Khả năng lan truyền tính đề kháng carbapenem của các chủng K. pneumoniae
sang E. coli in vitro ........................................................................................................ 82
3.4.2. Kiểm chứng kiểu hình kháng carbapenem các chủng tiếp hợp bằng phương
pháp kháng sinh đồ ........................................................................................................ 84
3.4.3. Kiểm chứng kiểu gen KPC-2 của các chủng E. coli tiếp hợp .............................. 85
3.4.4. Kiểm tra sự biểu hiện gen mã hóa KPC-2 ở chủng tiếp hợp ............................... 86
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 98
5.2. Đề nghị.................................................................................................................... 98
NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ACC
Ambler class C -lactamase
-lactamase nhóm C theo phân loại Ambler
ASTS
Antibiotic Sensitive Testing Surveillance
Chương trình tầm sốt độ nhạy kháng sinh
ATTC
AmericanType Culture Collection
Trung tâm chủng giống toàn cầu
BES
Brazil Extended Spectrum -lactamase
-lactamase phổ rộng phát hiện tại Bra-xin
BLAST
Basic Local Alignment Search Tools
Trang web tìm kiếm so sánh các trình tự sinh học
BLE
-lactamase producing Enterobacteria
-lactamase từ vi khuẩn đường ruột
bp
base pairs
Cặp base trong trình tự DNA
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
Trung tâm Phòng chống và Ngăn ngừa dịch bệnh (Hoa Kỳ)
CFE
Citrobacter freundii -lactamase
-lactamase từ Citrobacter freundii
CLSI
Clinical and Laboratory Standard Institute
Viện tiêu chuẩn xét nghiệm và lâm sàng (Hoa Kỳ)
CMY
Cephamicin hydrolyzing capabilities AmpC -lactamase
AmpC -lactamase có khả năng thủy phân Cephamycin
CTX-M
Cefotaximase Munich
-lactamase thủy phân Cefotaxim
DHA
Morganella morganii AmpC -lactamase
AmpC -lactamase phân lập từ Morganella morganii
DHP-1
Dehydropeptidase
v
Enzym dehydropeptidase được tạo ra ở cầu thận
DNA
Adenosyl Deoxy Nucleotide
ELISA
Enzym Linked-Immuno Absorbant Assay
Kỹ thuật xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết với enzym
ESBL
Extended Spectrum -lactamase
Enzym -lactamase phổ rộng
FOX
Cefoxitin hydrolyzing capabilities
AmpC -lactamase có khả năng thủy phân Cefoxitin
GARP
Global Antibiotic Resistance Partnership
Chương trình giám sát đề kháng kháng sinh tồn cầu
GES
Guiana Extended Spectrum carbapenemase
Enzym carbapenemase phổ rộng Guiana
GIM
Germany Imipenemase
Enzym thủy phân imipenem phát hiện tại Đức
IMI
Imipenem-hydrolysing -lactamase
Enzym thủy phân imipenem
IPTG
Isopropyl -D-thiogalactopyranoside
Hóa chất Isopropyl -D-thiogalactopyranoside
kDa
Kilo Dalton
KHM
C. freunii KHM 243 Metallo--lactamase
Enzym Metallo--lactamase từ C. freunii KHM 243
KPC
Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
Enzym thủy phân carbapenem từ Klebsiella pneumoniae
LAT
Lataxocef hydrolyzing AmpC -lactamase
-lactamase nhóm C có khả năng thủy phân Lataxocef
LB (A)
Luria-Bertani (Agar)
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani
LCMS
Liquid Chromatography – Mass Spectrophotometry
Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ
MBL(s)
Metallo--lactamase(s)
vi
-lactamase nhóm B có kẽm ở vị trí hoạt hóa
MC (A)
MacConkey (Agar)
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MacConkey
MHA
Muller Hinton Agar
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Muller Hinton
MHT
Modified Hodge Test
Phương pháp Hodge cải biên xác định hoạt tính carbapenemase
MIDAS
Microbial Diagnostic and Surveillance
Chương trình chẩn đốn và tầm sốt vi khuẩn gây bệnh
MIR
Miriam Hospital K. pneumoniae -lactamase
Enzym -lactamase từ K. pneumoniae phân lập ở Bệnh viện Miriam
MOX
Moxalactam hydrolyzing -lactamase
Enzym -lactamase thủy phân Moxalactam
MSSA
Methicillin Susceptible Staphylococus Aureus
Staphylococcus aureus nhạy cảm với kháng sinh methicillin
NMC
Not Metallo-carbapenemase
Enzym carbapenemase khơng thuộc nhóm B (Zn là nhóm hoạt hóa)
NCBI
National Center for Biotechnology Information
Trung tâm Cơng Nghệ Sinh học Quốc gia Hoa Kỳ
NDM-1
New Delhi Metallo--lactamase 1
Enzym -lactamase nhóm B phân lập được tại New Delhi
OXA
Oxacillin Hydrolying Enzym
Enzym thủy phân Oxacillin
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng khuếch đại gen
PER
Pseudomonas Extended -lactamase
Enzym -lactamase phổ rộng từ Pseudomonas
PBP
Penicillin Binding Protein
Protein gắn kết với Penicillin
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis
vii
Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
SFO
Serratia fonticola -lactamase
Enzym -lactamase phân lập từ Serratia fonticola
SHV
Sulphydryl variable
Enzym biến đổi Sulphydryl
SME
Serratia marcescens Enzym
Enzym -lactamase phân lập từ Serratia marcescens
SPM
Pseudomonas aeruginosa -lactamase IMP-1
Enzym -lactamase IMP-1 từ Pseudomonas aeruginosa
ST
Sequence Type
Trình tự di truyền
TEM
Temoneira
Enzym -lactamase đặt theo tên bệnh nhân Temoneira
TLA
plasmid-mediated cefotaxime-hydrolyzing β-lactamse (Ambler class A)
Enzym -lactamase nhóm A trên plasmid thủy phân cefotaxim
VEB
Vietnam Extended Spectrum -lactamase
Enzym -lactamase phổ rộng phát hiện tại Việt Nam
VIM
Verona Integron encoded Metallo--lactamase
Enzym Metallo--lactamase Verona
viii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại các loài trong chi Klebsiella theo các hệ thống phân loại ............. 4
Bảng 1.2. Nguồn phân lập Klebsiella ........................................................................... 5
Bảng 1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa của các lồi thuộc chi Klebsiella ..................... 7
Bảng 1.4. Tóm tắt các bộ gen K. pneumoniae đã được cơng bố trình tự ..................... 9
Bảng 1.5. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học ............................................... 13
Bảng 1.6. Phân loại kháng sinh theo cơ chế tác động ................................................ 14
Bảng 1.7. Kháng sinh -lactam và phổ kháng khuẩn .................................................. 16
Bảng 1.8. Hệ thống phân loại các -lactamase ........................................................... 18
Bảng 1.9. Các enzym -lactamases chọn lọc ở vi khuẩn gram âm ............................ 20
Bảng 1.10. Phổ hoạt động in vitro của một số loại carbapenem thông dụng .............. 24
Bảng 1.11. Đặc điểm của các carbapenemase ở các chủng vi khuẩn gram âm .......... 30
Bảng 1.12. Tỷ lệ đề kháng carbapenem ở K. pneumoniae tại các bệnh viện (%) ....... 35
Bảng 1.13. Độ nhạy kháng sinh thực hiện theo các kỹ thuật khác nhau . ................... 38
Bảng 2.1. Danh sách các mồi được dùng trong nghiên cứu ........................................ 39
Bảng 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ELISA kiểm tra biểu hiện kháng huyết thanh....... 54
Bảng 3.1. Nồng độ ức chế tối thiểu carbapenem đối với các chủng K. pneumoniae .. 61
Bảng 3.2. Kết quả xác định gen mã hóa KPC và NDM-1 ở K. pneumoniae. ............. 63
Bảng 3.3. Số gen ESBL ở các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem………..65
Bảng 3.4. Gen mã hóa AmpC -lactamase ở K. pneumoniae kháng carbapenem ...... 67
Bảng 3.5. Gen mã hóa -lactamase và MIC (g/ml) ở các chủng K. pneumoniae. .... 68
Bảng 3.6. Kiểu gen đề kháng đa kháng sinh của 27 chủng K. pneumoniae ................ 68
Bảng 3.7. Kết quả kiểm chứng kiểu hình sinh carbapenemase của các chủng ........... 71
Bảng 3.8. Kết quả biểu hiện carbapenemase ở các chủng mang plasmid tái tổ hợp ... 76
Bảng 3.9. Kết quả định danh các chủng E. coli đã tiếp hợp mọc trên mơi trường LB có
NaZ và ertapenem ........................................................................................................ 83
Bảng 3.10. Sự đề kháng kháng sinh của các chủng tiếp hợp Eco06 và Eco18 ........... 84
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm tiếp hợp in vitro các chủng kháng carbapenem. ........ 86
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hình kính hiển vi điện tử Klebsiella pneumoniae ......................................... 5
Hình 1.2. Các yếu tố độc lực của chi Klebsiella ........................................................... 8
Hình 1.3. Các con đường chuyển gen ở vi khuẩn.. ..................................................... 12
Hình 1.4. Cấu trúc Tn4401 trên các plasmid tự nhiên.. .............................................. 12
Hình 1.5. Cấu trúc carbapenem và vị trí tác động của -lactamase ............................ 24
Hình 1.6. Vị trí của gen mã hóa KPC ở K. pneumoniae và một số lồi khác. ............ 27
Hình 1.7. Sự khác biệt giữa gen mã hóa KPC-1, KPC-2 và KPC-3 ........................... 27
Hình 1.8. Tỷ lệ đề kháng của Klebsiella spp với một số kháng sinh dùng trong điều trị
tại các bệnh viện trong cả nước .................................................................................... 34
Hình 1.9. Tình hình đề kháng carbapenem của các chủng Enterobacteriaceae trên 16
bệnh viện. ..................................................................................................................... 35
Hình 2.1. Kết quả thử nghiệm Hodge cải biên (MHT) trên mơi trường MHA ........... 45
Hình 2.2. Sơ đồ plasmid pET28a …………………………………………………... 49
Hình 2.3. Sơ đồ vị trí bắt cặp của mồi lên plasmid tái tổ hợp với promoter tự nhiên. 51
Hình 2.4. Quy trình tạo dịng plasmid tái tổ hợp pKPCwt mang gen mã hóa KPC-2 52
Hình 2.5. Sơ đồ vị trí bắt cặp của mồi lên plasmid tái tổ hợp với promoter T7 ......... 53
Hình 2.6. Quy trình tạo đáp ứng miễn dịch thu nhận huyết thanh chứa kháng thể
kháng protein KPC tái tổ hợp ………………………………………………………..53
Hình 2.7. Sơ đồ nội dung và phương pháp nghiên cứu trong luận án..………………57
Hình 3.1. K. pneumoniae trên mơi trường MC và chụp dưới kính hiển vi ................. 59
Hình 3.2. Tỷ lệ kháng kháng sinh ở các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem. .. 60
Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem kháng kháng sinh. ..... 60
Hình 3.4. Kết quả đại diện chủng KP01 mang gen mã hóa NDM-1 và chủng KP03
mang gen mã hóa KPC đề kháng carbapenem. ............................................................ 63
Hình 3.5. Kết quả phát hiện các gen ESBL ở một số chủng K. pneumoniae .............. 65
Hình 3.6. Kết quả điện di phát hiện gen mã hóa AmpC -lactamase ......................... 67
Hình 3.7. Hình đại diện các chủng K. pneumoniae có kiểu hình âm tính (KP01) và
dương tính (KP02) bằng thử nghiệm Modified Hodge Test (MHT). .......................... 71
x
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự chủng chuẩn K. pneumoniae ATCC BAA 1705 ........ 72
Hình 3.9. Kết quả xác định kiểu gen blaKPC loại 2 của chủng chuẩn ATCC1705....73
Hình 3.10. Kết quả đại diện xác định hoạt tính carbapenemase từ dịch đồng nhất của
chủng KP02 mang kiểu gen mã hóa KPC (+) và MHT (+). ........................................ 74
Hình 3.11. Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm nhân bản gen mã hóa KPC-2..75
Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc của chủng E. coli mang plasmid
tái tổ hợp pKPCcc (A) và pKPCwt (B) ........................................................................ 76
Hình 3.13. Kết quả kiểm tra cảm ứng biểu hiện protein KPC với IPTG. ................... 78
Hình 3.14. Kết quả kiểm tra tính tan và tinh sạch protein KPC-2. ............................. 78
Hình 3.15. Kết quả phân tích LC-MS của protein KPC-2 tái tổ hợp sau tinh sạch. ... 79
Hình 3.16. Kết quả đánh giá kháng huyết thanh chuột được gây đáp ứng miễn dịch
với KPC-2 bằng phương pháp ELISA ......................................................................... 80
Hình 3.17. Kết quả Western blot khẳng định sự hiện diện protein KPC-2 ở các chủng
K. pneumoniae đề kháng carbapenem mang gen mã hóa KPC-2 ................................ 81
Hình 3.18. Khuẩn lạc E. coli và K. pneumoniae trên mơi trường MC. ....................... 82
Hình 3.19. Khuẩn lạc các chủng Eco06 sau tiếp hợp trên môi trường LB. ................ 83
Hình 3.20. Kết quả định danh đại diện các chủng sau tiếp hợp .................................. 83
Hình 3.21. Hình ảnh kháng sinh đồ của các chủng Eco06 sau tiếp hợp. .................... 84
Hình 3.22. Kết quả xác nhận gen mã hóa KPC-2 ở chủng tiếp hợp…...…………….85
Hình 3.23. Kết quả điện di các gen ESBL và AmpC -lactamase sau tiếp hợp của
chủng cho KP06 và KP18 và chủng nhận Eco06 và Eco18. ....................................... 85
xi
MỞ ĐẦU
Kể từ khi được phát hiện và đưa vào điều trị, thuốc kháng sinh trở thành trợ thủ
đắc lực cho con người trong cuộc chiến với các vi khuẩn gây bệnh; các kháng sinh đã
không ngừng được cải tiến và phát triển mới về số lượng và chất lượng nhằm tăng
cường hiệu quả trong điều trị lâm sàng. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi
và thiếu kiểm soát đã dẫn tới sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc với nhiều
cơ chế kháng khác nhau làm cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ngày càng trở
nên khó khăn, phức tạp và tốn kém hơn.
Cũng như các vi khuẩn đường ruột Gram âm khác, Klebsiella pneumoniae là vi
khuẩn gây bệnh quan trọng được quan tâm hàng đầu trong lâm sàng bởi khả năng đề
kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng trong điều trị.
Một trong những cơ chế đề kháng kháng sinh đáng chú ý hiện nay ở K.
pneumoniae là cơ chế tiết enzym -lactamase phổ rộng (ESBL, extended spectrum lactamase), một loại enzym có khả năng thủy phân hầu hết các kháng sinh -lactam và
các kháng sinh cephalosporin; đồng thời có khả năng đề kháng luôn cả kháng sinh
fluoroquinolone và aminoglycoside dẫn đến việc giảm sử dụng các kháng sinh này
trong điều trị.
Carbapenem là nhóm kháng sinh phổ rộng hữu hiệu nhất hiện nay để điều trị
các bệnh nhiễm khuẩn gây ra bởi K. pneumoniae và các vi khuẩn Gram âm đề kháng
đa kháng sinh. Khi carbapenem được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng, vi khuẩn đã
phát triển khả năng đề kháng carbapenem bằng cách tiết enzym carbapenemase. Gen
mã hóa cho enzym này hiện diện trên plasmid hoặc transposon nên có khả năng lan
truyền cho các vi khuẩn cùng hay khác loài. Hiện nay, có nhiều carbapenemase như
KPC, VIM, IMP, MBL, NDM-1 và OXA-48 được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới.
Trong số các cabapenemase này, KPC và NDM-1 là hai loại enzym có tính kháng
kháng sinh rất mạnh và đã lây lan ở nhiều quốc gia trên thế giới, gây nên nhiều vụ
dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao. Gen mã hóa KPC hiện diện trên nhân tố di truyền di
động là transposon Tn4401, một cấu trúc có khả năng chuyển vị các bản sao với tần
suất cao (4,4 x 10-6) các trình tự gen mã hóa enzym này. Transposon Tn4401 cũng có
khả năng chèn vào nhiều trình tự khác nhau, trên các plasmid có kích thước khác nhau
và trên những nhóm incompatible khác nhau. Do đó, gen mã hóa KPC có tính kháng
1
kháng sinh rất mạnh và đã lây lan ở nhiều quốc gia trên thế giới, gây nên nhiều vụ
dịch bệnh với tỷ lệ tử vong cao vì hiện nay chưa có kháng sinh mới để điều trị. Nói
khác đi, khi K. pneumoniae đề kháng carbapenem, chúng có thể trở thành những vi
khuẩn “bất trị”.
Tại Việt Nam, carbapenem được sử dụng trong lâm sàng đầu những năm 2000
và xu hướng sử dụng kháng sinh này ngày càng nhiều trong các cơ sở điều trị. Nhiều
công bố tại các bệnh viện cho thấy có sự gia tăng đáng kể sự đề kháng kháng sinh này
ở K. pneumoniae. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá sự
kháng thuốc dựa trên kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) bằng E-test hay
xác định tỷ lệ đề kháng carbapenem ở vi khuẩn này theo các phương pháp kháng sinh
đồ mà chưa nêu rõ được cơ chế phân tử gây nên hiện tượng đề kháng và sự lan truyền
tính kháng carbapenem ở K. pneumoniae.
Việc tìm hiểu những vấn đề cơ bản và chuyên sâu về đặc điểm sinh học phân tử
của sự đề kháng kháng sinh carbapenem ở K. pneumoniae thông qua cơ chế sinh
enzym carbapenemase thủy phân carbapenem và sự lan truyền tính kháng ở vi khuẩn
này là cần thiết và quan trọng trong giai đoạn chưa có kháng sinh thay thế hiện nay.
Dựa trên các hiểu biết này, các bác sĩ lâm sàng, các chuyên gia kiểm sốt và quản lý
dịch bệnh có thể định hướng trong điều trị bằng kháng sinh này cũng như ngăn ngừa
sự lây lan của K. pneumoniae đề kháng carbapenem gây nhiễm khuẩn bệnh viện và
ngồi cộng đồng. Do đó, một số vấn đề cần được ưu tiên giải quyết như sau:
-
Xác nhận sự hiện diện của các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem tại
các đơn vị lâm sàng;
-
Tìm hiểu các đặc điểm sinh học phân tử về kiểu hình, kiểu gen đề kháng cũng
như biểu hiện của carbapenemase KPC hay NDM-1 hiện diện trên plasmid của các
chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem;
-
Tìm hiểu cơ chế gây nên hiện tượng lan truyền các chủng vi khuẩn mang gen
đề kháng carbapenem;
-
Thử nghiệm phát hiện các chủng vi khuẩn mang gen mã hóa carbapenemase.
2
Với ý nghĩa thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của
Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem qua cơ chế KPC” được tiến hành thông
qua các nội dung nghiên cứu cụ thể sau:
1. Sàng lọc và thu nhận các chủng vi khuẩn K. pneumoniae đề kháng carbapenem,
2. Xác định kiểu gen quy định kiểu hình kháng carbapenem và ESBL của các chủng
K. pneumoniae đề kháng carbapenem,
3. Khảo sát đặc tính sinh học phân tử của gen mã hóa KPC (Nghiên cứu đặc điểm
kháng carbapenem do KPC ở các chủng K. pneumoniae đề kháng carbapenem và sự
lan truyền tính đề kháng carbapenem theo chiều ngang của các chủng K. pneumoniae
đề kháng carbapenem),
4. Tạo kháng thể xác nhận sự hiện diện của protein KPC trên các chủng K.
pneumoniae đề kháng carbapenem.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae
K. pneumoniae, thuộc họ vi khuẩn đường ruột – Enterobacteriaceae, là tác nhân
gây nhiễm khuẩn bệnh viện và cộng đồng. Vi khuẩn này có thể gây bệnh viêm phổi,
áp xe phổi, viêm màng phổi và những nhiễm khuẩn khác như viêm ruột, viêm màng
não, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiết niệu. Yếu tố nguy cơ lây nhiễm các
chủng này ở bệnh nhân là thời gian nằm viện kéo dài, hệ miễn dịch suy yếu, nằm
chung giường với người bệnh hay thực hiện những thủ thuật xâm lấn như đặt ống
thơng tiểu, đặt nội khí quản… Tuy nhiên, việc gia tăng số lượng các chủng Klebsiella
kháng thuốc trong nhiễm khuẩn bệnh viện chủ yếu là do sử dụng kháng sinh làm.
1.1.1. Đặc điểm phân loại
Do tầm quan trọng về y khoa, Klebsiella được chia thành ba phân nhóm dựa
trên các triệu chứng bệnh mà chúng gây ra: K. pneumoninae, K. ozaenae và K.
rhinoscleromatis. Khi phân loại học phát triển, các vi khuẩn thuộc nhóm này cũng
được thay đổi trong hệ thống phân loại, với ba hệ thống phân loại chính là Cowan,
Bascomb và Orskov [46] được trình bày trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phân loại các lồi trong chi Klebsiella theo các hệ thống phân loại [46]
Cowan
K. aerogens
K. edwardsii
subsp. edwardsii
subsp. atlantae
K. pneumoniae
K. ozaenae
K. rhinoscleromatis
Phân loại theo
Bascomb
K.aerogens/oxytoca/
edwardsii
K. pneumoniae sensu strict
K. pneumoniae sensu lato
K. ozaenae
K. rhinoscleromatis
K. “unnamed group”
Enterobacter aerogens
Orskov
K. pneumoniae
subsp. pneumoniae
subsp. ozaenae
subsp. rhinoscleromatis
K. oxytoca
K. terrigena
K. planticola (syn. K.trevisanii)
K. ornithinolytica
Dựa vào độ tương đồng di truyền, chi Klebsiella được chia làm 7 loài: K.
pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaena, K. rhinoscleromatis, K. planticola, K. terrigena,
K. ornithinolytica. Trong số này, K. pneumoniae là thành viên quan trọng nhất.
Đặc điểm phân loại của K. pneumoniae (Bergey’s Manual 2B)
Giới:
Bacteria
Ngành:
Proteobacteria
Lớp:
Gammaproteobacteria
4
Bộ:
Enterobacteriales
Họ:
Enterobacteriaceae
Chi:
Klebsiella
Lồi:
Klebsiella pneumoniae.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và phân bố
K. pneumoniae là trực khuẩn gram âm, kị khí tùy ý, khơng di động, có nang
polysacharide đặc trưng giúp vi khuẩn tránh được các tác nhân gây hại cho tế bào.
Hình 1.1. Hình kính hiển vi điện tử Klebsiella pneumoniae
(Nguồn: )
Vi khuẩn này có mặt khắp nơi trong tự nhiên hay ở người, có thể tìm thấy
chúng ở da, cổ họng, đường ruột, dạ dày, nước tiểu hay vết thương [46], [109]. Bảng 1.2.
Mô tả nguồn phân lập phổ biến của các loài trong chi Klebsiella.
Bảng 1.2. Nguồn phân lập Klebsiella [109]
Loài
K. pneumoniae
K. oxytoca
Nguồn phân lập
Phân lập từ các bệnh phẩm trên người như viêm phổi, apxe
phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn tiểu, nhiễm khuẩn huyết
Phân lập được từ các bệnh phẩm trên người và gây nhiều nhiễm
khuẩn khác nhau
Là tác nhân gây viêm mũi và nhiễm khuẩn mủ ở màng nhầy của
K. ozanae
mũi. Ngồi ra vi khuẩn này cịn có thể phân lập được từ các mơ
nhiễm khuẩn: máu, nước tiểu, mô mềm
K. planticola
Phân lập được từ máu, đàm, nước tiểu, vết thương
K. ornithinolytica
Phân lập được từ nước và thực vật. Ở người, vi khuẩn này
5
Lồi
Nguồn phân lập
thường được phân lập ở đường hơ hấp trên, nước tiểu, dịch não
tùy và máu
K.
Phân lập được từ màng nhầy đường hô hấp, mũi hầu, xoang
rhinoscleromatis
mũi.
Nguồn phân lập chính là đất và nước. có thể phân lập được từ
K. terrigena
phân người khỏe mạnh, đường hô hấp nhưng không gây bệnh
cho người
K. pneumoniae có quan hệ gần nhất với K. oxytoca, chúng được phân biệt nhờ
phản ứng indole: K. pneumoniae có indole âm và có khả năng tăng trưởng với cả
melezitose và 3-hydroxybutyrate
[109]
. Bảng 1.3. thống kê các thử nghiệm sinh hóa
được sử dụng trong phân tích và định danh các loài trong chi Klebsiella.
1.1.3. Các yếu tố độc lực của K. pneumoniae
Cũng như các vi khuẩn gây bệnh khác, K. pneumoniae cũng sử dụng những
phương thức chung để phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế
này tạo nên độc lực (virulence) của vi khuẩn (Hình 1.2).
a) Kháng nguyên vỏ (bề mặt)
Klebsiella thường biểu hiện 2 nhóm kháng nguyên bề mặt gồm khoảng hơn 80
kháng nguyên vỏ K có bản chất polysaccharide và 9 kháng nguyên O có bản chất
lipopolysaccharide. Cả 2 nhóm kháng nguyên này đều là yếu tố gây bệnh ở K.
pneumoniae. Các thay đổi trong cấu trúc của những kháng nguyên này là yếu tố để
phân loại thành nhiều kiểu huyết thanh khác nhau mặc dù độc tính là như nhau [46].
b) Hệ thống nhung mao (pili)
Cũng như các loài khác trong họ vi khuẩn đường ruột, Klebsiella bám dính lên
bề mặt tế bào chủ nhờ hệ thống nhung mao được cấu tạo bởi những đơn vị protein
hình cầu có khối lượng phân tử khoảng 15-26 kDa có khả năng đơng tụ hồng cầu của
nhiều loài động vật [46].
6
Bảng 1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa của các loài thuộc chi Klebsiella
KIA/TSI
Loài
OXI NO2
K. pneumoniae
-
+
+
+
+
-
-
+
-
-
+
+
-
+
+
+
K .oxytoca
-
+
+
+
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
+
+
K .ornithinolytica
-
+
+
+
+
-
-
+
+
-
+
+/-
+
+
+
+
K. planticola
-
+
+
+
+
-
-
+
-
-
+
+
+
+
+
+
K. ozanae
-
+
+
+/-
+/-
-
-
-
-
-
+/-
-
+
+/-
-
+
K. rhinoscleromatis -
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
+
-
K. terrigena
+
+
+
+
-
-
-
-
-
+/-
+
+/-
+
+
+
-
GLU LAC GAS H2S
PAD URE IND MOB CIT VP MR LDC MLO ONPG
Ghi chú: (-) thử nghiệm âm tính, (+) thử nghiệm dương tính, (+/-) trên 70% là dương tính.
(OXI): Thử nghiệm oxidase; (GLU): Khả năng lên men glucose; (LAC): Khả năng lên men lactose; (GAS): Khả năng sinh hơi;
(H2S): Khả năng sinh H2S; (PAD): Thử nghiệm phenylalanine desaminase; (UREA): Thử nghiêm urease; (IND): Thử nghiệm
indol; (MOB): thử nghiệm tính di động; (CIT): Khả năng biến dưỡng citrate; (VP): Thử nghiệm Voges-Proskauer; (MR): Thử
nghiệm methyl red; (LCD): Thử nghiệm decarboxylase; (MLO): Biến dưỡng maltose; (ONPG): Thử nghiệm ONPG.
7
Hình 1.2. Các yếu tố độc lực của chi Klebsiella [46]
c) Các yếu tố kháng huyết thanh
Để vượt qua hàng rào bảo vệ của tế bào chủ, ngồi việc thốt khỏi sự thực bào
của các bạch cầu đa nhân, vi khuẩn phải cịn phải tìm cách thốt khỏi ảnh hưởng của
các chất diệt khuẩn sẵn có trong huyết thanh. Hoạt tính diệt khuẩn chủ yếu qua trung
gian các protein bổ thể tạo ra các kênh xuyên màng ở màng ngoài tế bào vi khuẩn làm
cho Na+ được bơm vào trong, làm thay đổi ấp suất thẩm thấu bên trong tế bào vi
khuẩn. Hiện nay, cơ chế giúp vi khuẩn kháng huyết thanh vẫn chưa rõ. Đối với
Klebsiella, giả thuyết được đưa ra là do lớp vỏ polysaccharide bao bọc và che chở cho
lớp lipopolysaccharide nằm bên dưới hoặc do chuỗi bên của kháng nguyên O xuyên
qua lớp vỏ tạo thành cấu trúc bề mặt khơng hoạt hóa bổ thể [46].
d) Siderophore (chất mang ion – ion carrier)
Để tăng trưởng được trong mô tế bào chủ, vi khuẩn phải được cung cấp đủ sắt.
Đây là nhân tố thiết yếu có chức năng xúc tác các phản ứng oxi hóa khử trong chuỗi
dẫn truyền điện tử ở vi khuẩn. Vì nguồn sắt tự do trong tế bào chủ rất thấp nên vi
khuẩn phải thích ứng để đảm bảo đủ lượng sắt cho tăng trưởng bằng cách tiết ra những
chất kìm nối (chelator) phân tử lượng nhỏ, có ái lực rất cao với sắt được gọi là các
siderophore. Klebsiella có 2 loại siderophore là enterochelin và aerobactin [46].
1.1.4. Cấu trúc di truyền của K. pneumoniae
K. pneumoniae được bao bọc bên ngoài là một vùng polysaccharide dày giúp vi
khuẩn dễ dàng xâm nhập vào vật chủ. Đây là đặc tính phân biệt khá rõ rệt giữa K.
pneumoniae với các vi khuẩn khác cùng họ. Sự gần gũi về mặt di truyền với các vi
khuẩn cùng họ như Citrobacter, Escherichia, Enterobacter và Salmonella giúp K.
8
