Nghiên cứu vi nấm nội sinh sinh hoạt chất sinh học từ một số cây thuộc họ cam (rutaceae) và họ gừng (zingiberaceae)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM

VÕ THỊ NGỌC MỸ

NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH SINH HOẠT CHẤT SINH HỌC
TỪ MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ HỌ
GỪNG (ZINGIBERACEAE)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ NGỌC MỸ

NGHIÊN CỨU VI NẤM NỘI SINH SINH HOẠT CHẤT SINH HỌC
TỪ MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ CAM (RUTACEAE) VÀ HỌ
GỪNG (ZINGIBERACEAE)

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
Phản biện 2: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện 3: TS. Đinh Minh Hiệp
Phản biện độc lập 1: TS. Phạm Nguyễn Đức Hoàng
Phản biện độc lập 2: TS. Đinh Minh Hiệp

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. Nguyễn Văn Thanh

PGS.TS. Nguyễn Đinh Nga

Tp. HCM, năm 2016


Võ Thị Ngọc Mỹ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tơi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác.
Người viết cam đoan

Võ Thị Ngọc Mỹ

Trang i


Võ Thị Ngọc Mỹ

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................. ii
CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................................................v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vii
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................x
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................xi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................... xii
DANH MỤC PHỤ LỤC ......................................................................................... xiii

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Tổng quan về vi nấm nội sinh .............................................................................. 4
1.1.1. Vi sinh vật nội sinh ....................................................................................... 4
1.1.2. Vi nấm nội sinh ............................................................................................. 4
1.1.3. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật ....................................................4
1.1.4. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật phân lập vi nấm nội sinh ....................5
1.1.5. Sự đa dạng của vi nấm nội sinh ....................................................................7
1.1.6. Vi nấm nội sinh sinh các hoạt chất sinh học.................................................8
1.1.7. Tổng quan về chi Aspergillus. ....................................................................11
1.2. Hệ thống phân loại vi nấm .................................................................................18
1.3.1. Định danh vi nấm theo phương pháp truyền thống ....................................18
1.3.2. Hỗ trợ định danh vi nấm theo phương pháp sinh học phân tử ...................19
1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................................ 19
1.3.1. Nghiên cứu ở ngoài nước............................................................................19
1.3.2. Nghiên cứu ở trong nước ............................................................................20
1.4. Tổng quan về các phương pháp thực nghiệm .................................................... 22
1.4.1. Các phương pháp chiết, tách phân đoạn ..................................................... 22
1.4.2. Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học ............................................23
1.4.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất ............................... 25
1.4.4. Các phương pháp thử độc tính tế bào ......................................................... 25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 27
Trang ii


Võ Thị Ngọc Mỹ
2.1. VẬT LIỆU .........................................................................................................28
2.1.1. Nguồn mẫu phân lập ...................................................................................28
2.1.2. Vi sinh vật thử nghiệm................................................................................28
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................................30

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................30
2.2.1. Thiết kế thí nghiệm ...................................................................................300
2.2.2. Phương pháp phân lập vi nấm nội sinh từ thực vật ....................................31
2.2.3. Phương pháp sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng
nấm

......................................................................................................................322

2.2.4. Phương pháp sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất chống oxy hóa .......34
2.2.5. Phương pháp định danh vi nấm ..................................................................35
2.2.6. Chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất sinh học cao ......38
2.2.7. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu ....................................................... 40
2.2.8. Nuôi cấy chủng A. terreus R-TN3 trong môi trường tối ưu ....................... 41
2.2.9. Chiết hoạt chất có tính kháng khuẩn từ môi trường nuôi cấy chủng A.
terreus R-TN3 ...........................................................................................................41
2.2.10. Thu nhận, xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp
chất từ chủng A.terreus R-TN3 .................................................................................44
2.2.11. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu ..................................................47
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................... 50
3.1. KẾT QUẢ ..........................................................................................................51
3.1.1. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm .....................................51
3.1.2. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa .......................................................... 54
3.1.3. Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh hoạt chất
sinh học ..................................................................................................................... 53
3.1.4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao ........................ 55
3.1.5. Khảo sát điều kiện nuôi cấy của chủng A. terreus R-TN3 ......................... 59
3.1.6. Thiết kế và tối ưu hóa điều kiện ni cấy ...................................................63
3.1.7. Thu nhận, xác định cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp
chất từ chủng A.terreus R-TN3 .................................................................................63

Trang iii


Võ Thị Ngọc Mỹ
3.2. BÀN LUẬN .......................................................................................................90
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 104
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 114

Trang iv


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

AIDS

Acquired Immune Deficiency Syndrome

AO

Acridine orange

BHT

Butylated hydroxytoluene

CC

Column chromatography

CDA

Czapeck Dox agar

CFU

Colony forming unit

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

EB

Ethidium bromide

EtOAc

Ethyl acetate

GC

Gas Chromatography

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

HRMS

High Resolution Mass Spectrometry

IC

Inhibition concentration

IR

Infrared spectroscopy

IU

International Unit

MEA

Malt Extract Agar

MeOH

Methanol

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

MRSA

Methicilin Resistant Staphylococcus aureus

MS

Mass Spectrometry

NMR

Nuclear magnetic resonance

OD

Optical Density

OXH

Oxy hóa

PDA

Potato Dextrose Agar

PDB

Potato Dextrose Broth

PSB

Potato Saccharose Broth

Rf

Retention time
Trang v


Võ Thị Ngọc Mỹ
SDA

Sabouraud Dextrose Agar

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

SPE

Solid phase extraction

SRB

Sulforhodamin B

TSA

Trypticase Soy Agar

TSB

Trypticase Soy Broth

UV

Ultra violet

VLC

Vacuum Liquid Chromatography

VS

Vanillin sulfit

WHO

World Health Organization

Trang vi


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Tác động kháng sinh của một số loài vi nấm nội sinh................................ 8
Bảng 1.2. Một số vi nấm nội sinh sản sinh paclitaxel. ................................................ 9
Bảng 1.3. Tác động kháng côn trùng của một số loài vi nấm nội sinh ..................... 10
Bảng 1.4. Tác động chống oxy hóa của một số lồi vi nấm nội sinh. ...................... 10
Bảng 1.5. Các vi nấm nội sinh sinh các hoạt chất sinh học khác.............................. 11
Bảng 1.6. Hoạt chất sinh học của A. terreus cho tác động kháng vi khuẩn, kháng
virus. .......................................................................................................................... 16
Bảng 1.7. Công thức một số chất biến dưỡng được phân lập từ A. terreus .............. 17
Bảng 2.1. Danh sách cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng (Zingiberaceae) sử
dụng ........................................................................................................................... 28
Bảng 2.2. Mức độ kháng khuẩn, kháng nấm dựa theo đường kính vịng ức chế của
khoanh thạch thử ....................................................................................................... 34
Bảng 2.3. Tốc độ phát triển của nấm dựa vào đường kính khóm nấm. .................... 37
Bảng 3.1. Kết quả sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm
ở họ Cam (Rutaceae) ................................................................................................. 49
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm
ở họ Gừng (Zingiberaceae) ....................................................................................... 49
Bảng 3.3. Tác động kháng khuẩn, kháng nấm của các vi nấm nội sinh. .................. 50
Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất chống oxy hóa. ............. 51
Bảng 3.5. Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học ....... 52
Bảng 3.6. Kết quả định danh các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao
bằng phương pháp sinh học phân tử . ....................................................................... 52
Bảng 3.7. Tác động kháng khuẩn của các chủng A. terreus. .................................... 53
Bảng 3.8. Kết quả định tính khả năng chống OXH của các chủng A. terreus .......... 53
Bảng 3.9. Tác động kháng khuẩn của các chủng A. terreus trên các loại môi trường
CDA, PDA, SDA.. .................................................................................................... 54
Bảng 3.10. Các mức khảo sát của biến độc lập......................................................... 55
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen, độ thơng khí khác nhau lên sự
sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng A. terreus R-TN3 .. .................................... 56
Trang vii

Võ Thị Ngọc Mỹ
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường khác nhau lên sự sinh hoạt chất kháng
khuẩn của chủng A. terreus R-TN3 .......................................................................... 57
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn của chủng
A. terreus R-TN3 ....................................................................................................... 57
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các loại dầu thực vật lên sự sinh hoạt chất kháng khuẩn
của chủng A. terreus R-TN3 ..................................................................................... 58
Bảng 3.15. Môi trường nuôi cấy chủng A. terreus R-TN3 được thiết kế bằng phần
mềm Design Expert 6.0.6. ......................................................................................... 59
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của x1, x2 lên biến phụ thuộc y1. .......................................... 60
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của x1, x4 lên biến phụ thuộc y1 ........................................... 61
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của x2, x4 lên biến phụ thuộc y1 ........................................... 61
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của x1 lên biến phụ thuộc y2................................................. 61
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của x1, x4 lên biến phụ thuộc y2. .......................................... 62
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của x2, x4 lên biến phụ thuộc y2. .......................................... 62
Bảng 3.22. Thành phần công thức tối ưu .................................................................. 62
Bảng 3.23. Kết quả kiểm nghiệm của 3 lô công thức tối ưu. .................................... 63
Bảng 3.24. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết. ................................................... 63
Bảng 3.25. Tác động kháng khuẩn của các chất chiết của chủng A. terreus R-TN3..64
Bảng 3.26. Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết thơ. ............................................... 66
Bảng 3.27. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết thô. ............. 66
Bảng 3.28. Kết quả thăm dị hệ dung mơi phát hiện áp dụng cho tự sinh đồ và theo
dõi chất kháng khuẩn ở sắc ký cột ............................................................................ 68
Bảng 3.29. Hoạt tính kháng khuẩn của các vết trên bản mỏng sắc ký chất CT –
EtOAc ........................................................................................................................ 69
Bảng 3.30. Đặc điểm các vết trên sắc ký đồ của chất CT – EtOAc khi triển khai với
hệ dung môi CHCl3 – CH3COOH (9:1) .................................................................... 70
Bảng 3.31. Sắc ký cột cao thô ................................................................................... 72

Bảng 3.32. Kết quả chạy cột của phân đoạn 1 .......................................................... 73
Bảng 3.33. Xác định hàm lượng kháng khuẩn tối thiểu của chất Y ......................... 75
Bảng 3.34. Xác định MIC chất Y đối với chủng S. aureus và MRSA ..................... 76

Trang viii


Võ Thị Ngọc Mỹ
Bảng 3.35. Tỷ lệ (%) bắt gốc tự do DPPH ở các nồng độ khảo sát của chất X1. ..... 76
Bảng 3.36. Tỷ lệ (%) bắt gốc tự do DPPH ở các nồng độ khảo sát của Trolox. ...... 77
Bảng 3.37. Khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH của hợp chất X2 ...... 77
Bảng 3.38. Kết quả biện giải phổ của chất X1 .......................................................... 79
Bảng 3.39. Kết quả biện giải phổ của chất X1 .......................................................... 80
Bảng 3.40. Kết quả biện giải phổ của chất X2 .......................................................... 82
Bảng 3.41. Kết quả biện giải phổ của chất X2. ......................................................... 82
Bảng 3.42. Kết quả ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp chất Y........................ 83
Bảng 3.43. Kết quả ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp chất X1 ...................... 84
Bảng 3.44. Kết quả ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp chất X2. ..................... 86

Trang ix


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Các chủng thuộc lớp Ascomycetes phân lập từ lá của cây hạt kín và cây lá
kim ở Bắc Mỹ và Panama ........................................................................................... 7
Hình 1.2. Cấu tạo bộ phận sinh sản vơ tính của Aspergillus. ................................... 13
Hình 1.3. Mơ phỏng cuống bào tử đính của A. terreus ............................................. 14
Hình 3.1. Ảnh hưởng của x1, x2, x3, x4 lên y1............................................................ 60

Hỉnh 3.2. Ảnh hưởng của x1, x2, x3, x4 lên y2............................................................ 61
Hình 3.3. Tác động kháng của các chất chiết từ chủng A. terreus R-TN3 ............... 64
Hình 3.4. Sắc kí đồ SKLM chất CT – EtOAc với các hệ dung môi phát hiện bằng
soi UV 254 nm .......................................................................................................... 67
Hình 3.5. Sắc kí đồ SKLM chất CT – EtOAc với các hệ dung môi phát hiện bằng
soi UV 365 nm. ......................................................................................................... 67
Hình 3.6. Sắc kí đồ SKLM của chất CT – EtOAc khi triển khai với hệ dung mơi
CHCl3 – CH3COOH (9:1). ........................................................................................ 68
Hình 3.7. Tác động kháng S.aureus và MRSA của bảng SKLM ............................. 69
Hình 3.8. Tác động kháng S. aureus và MRSA của các vết trên bảng SKLM. ........ 70
Hình 3.9. Định tính DPPH. ....................................................................................... 71
Hình 3.10. Hiện hình các phân đoạn bằng UV254. .................................................... 72
Hình 3.11. Hợp chất X1 và hoạt tính chống oxy hóa ................................................ 73
Hình 3.12. Kết quả SKLM của hợp chất X1, X2 và Y............................................... 74
Hình 3.13. Hoạt tính kháng khuẩn của chất Y .......................................................... 74
Hình 3.14. Hoạt tính kháng S. aureus của chất Y. .................................................... 75
Hình 3.15. Hoạt tính kháng MRSA của chất Y ........................................................ 75
Hình 3.16. Xác định hàm lượng kháng khuẩn tối thiểu của chất Y .......................... 76
Hình 3.17. Các tương tác HMBC chính và CTCT của X1. ....................................... 80
Hình 3.18. Các tương tác HMBC và CTCT của X2 .................................................. 83
Hình 3.19. Kết quả thử nghiệm DNA phân mảnh. ................................................... 88
Hình 3.20. Thử nghiệm kính hiển vi huỳnh quang với thuốc nhuộm kép AO/EB ... 88

Trang x


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Quy trình thí nghiệm ................................................................................ 30

Sơ đồ 2.2. Quy trình xử lý mẫu ................................................................................. 31
Sơ đồ 2.3. Quy trình sàng lọc vi nấm nội sinh sinh hoạt chất kháng khuẩn, kháng
nấm. ........................................................................................................................... 33
Sơ đồ 2.4. Quy trình chiết sinh khối và dịch nuôi nấm A. terreus R-TN3 ............... 42
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết hoạt chất từ chủng A. terreus R-TN3 ............................. 65
Sơ đồ 3.2. Cô lập hợp chất X1, X2, Y ........................................................................ 71

Trang xi


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ biểu diễn khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH của
chất X1 ....................................................................................................................... 77
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ biểu diễn khả năng chống oxy hóa bằng thử nghiệm DPPH của
chất X2 ....................................................................................................................... 78
Biểu đồ 3.3. Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp
chất Y ........................................................................................................................ 84
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp
chất X1 ....................................................................................................................... 85
Biểu đồ 3.5. Biểu đồ biểu diễn khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư của hợp
chất X2 ....................................................................................................................... 86
Biểu đồ 3.6. Thử nghiệm Caspase-3 của hợp chất X1 .............................................. 89

Trang xii


Võ Thị Ngọc Mỹ

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Môi trường nuôi cấy............................................................................. PL-1
Phụ lục 2. Định danh các chủng vi nấm nội sinh bằng phương pháp hình thái .... PL-2
Phụ lục 3. Định danh các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao bằng
phương pháp sinh học phân tử. ........................................................................... PL-26
Phụ lục 4. Chọn lọc chủng vi nấm nội sinh tối ưu. ............................................. PL-36
Phụ lục 5. Kết quả giải cấu trúc của hợp chất X1. ............................................... PL-40
Phụ lục 6. Kết quả giải cấu trúc của hợp chất X2. ............................................... PL-48
Phụ lục 7. Kết quả thử độc tế bào các hợp chất. ................................................. PL-57

Trang xiii


Võ Thị Ngọc Mỹ

MỞ ĐẦU
Hiện nay, thực vật và các hoạt chất chiết từ thực vật đang được sử dụng rộng rãi
trong điều trị nhiều loại bệnh. Theo Balick và cộng sự năm 1996 [14], trong 119
loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, đây là các hợp chất
đang được sử dụng ở nhiều quốc gia. Trước thực tế này, một vấn đề được đặt ra là
các hoạt chất sinh học quí giá trong thực vật là do chính bản thân sinh ra hay là do
mối liên hệ tương sinh với các vi sinh vật nội sinh có ích trong mơ thực vật. Vi sinh
vật nội sinh là những vi sinh vật sống bên trong các mô thực vật nhưng không gây
bệnh cho cây chủ [73]. Trong đó, vi khuẩn và vi nấm là các vi sinh vật nội sinh
thường gặp nhất. Theo nghiên cứu gần đây của Hawksworth và Rossman ước tính
có đến 1,5 triệu loài vi nấm khác nhau, nhưng chỉ khoảng 100.000 lồi đã được mơ
tả [34]. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các
chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính
sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây
khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Họ Cam (Rutaceae) ở Việt Nam rất đa dạng, có khoảng 140 lồi, trong đó cam,
chanh, qt, bưởi... là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng trong dược
phẩm, thực phẩm… Thân, cành, lá, hoa và vỏ quả của chúng chứa nhiều túi tiết tinh
dầu… Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy tinh dầu của vỏ quả các cây họ Cam có
tác dụng an thần, chữa cảm cúm. Bên cạnh họ Cam, các cây thuộc họ Gừng
(Zingiberaceae) cũng có vai trị trị liệu trong đời sống con người. Từ xa xưa, gừng
đã trở thành gia vị, thức ăn, vị thuốc hết sức quan trọng của người Á đơng. Theo
nghiên cứu của Nguyễn Nghĩa Thìn và cộng sự năm 2008 [9] thì số lượng các lồi
cây có khả năng chữa bệnh ung thư là 50 loài thuộc 36 chi và 24 họ, trong số đó, họ
Gừng là đa dạng nhất (16%). Trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về các hoạt
tính sinh học như kháng viêm, chống lão hóa, kháng khuẩn, ức chế khối u… cùng
nhiều tác dụng khác của các cây họ Gừng, đặc biệt là các cây gừng, riềng, nghệ. Từ
những đặc tính trên cho thấy, tiềm năng đây là những họ chứa hệ vi nấm nội sinh
phong phú, tiết nhiều chất biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh... Tuy
Trang 1


Võ Thị Ngọc Mỹ
vậy, cho đến nay, ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có
nhiều nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên các lồi cây thuộc hai họ thực vật này. Do
đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất
biến dưỡng có lợi và có khả năng sinh các hoạt chất sinh học với hy vọng dùng để
điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức thú vị và được nhiều nhà nghiên
cứu quan tâm. Từ đó chúng tơi thực hiện luận án: “Nghiên cứu vi nấm nội sinh sinh
hoạt chất sinh học từ một số cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ Gừng
(Zingiberaceae)” với mục tiêu chính là tìm ra được các chủng vi nấm nội sinh có
khả năng sinh các hoạt chất sinh học cao từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae) và họ
Gừng (Zingiberaceae).

Trang 2

Võ Thị Ngọc Mỹ

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trang 3


Võ Thị Ngọc Mỹ

1.1. Tổng quan về vi nấm nội sinh
1.1.1. Vi sinh vật nội sinh
Vi sinh vật nội sinh là vi sinh vật sống trong mô thực vật bên dưới các lớp tế bào
biểu bì mà khơng gây tác hại hoặc nhiễm bệnh cho cây chủ, vi sinh vật nội sinh
sống trong gian bào của các mô và nhờ đó mà chúng có thể xâm nhập vào các tế
bào sống [77].
1.1.2. Vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh chiếm tỉ lệ cao trong hàng ngũ đông đảo vi sinh vật nội sinh thực
vật hiện nay. Chúng được xem là nguồn cung cấp nhiều chất mới, bao gồm rất
nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng quan tâm. Những dạng vi nấm này có thể
được phát hiện một cách ngẫu nhiên ở trong mô sâu của những cây chủ sinh trưởng
bình thường. Chúng sống nội sinh trên cây chủ và nhờ khả năng sinh tổng hợp
mạnh mẽ nên có thể tạo nên một lượng lớn các chất chuyển hóa. Điều này có thể
làm xuất hiện các chất mới có hoạt tính sinh học và hứa hẹn phát triển sản xuất ở
qui mơ cơng nghiệp. Bên cạnh đó, các chất do vi nấm nội sinh sản sinh được xem
như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những
tác nhân vi sinh gây bệnh [34], [73].
1.1.3. Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật

Vi nấm nội sinh ở thực vật có thể được phân lập dễ dàng từ một mảnh mô cây đã
được khử trùng bề mặt. Số lượng vi nấm nội sinh tìm thấy cũng rất khác nhau khi
khảo sát những mẫu cây khác nhau, con số này có thể biến động từ một cho đến vài
trăm chủng.
Sự hiện diện của vi nấm nội sinh trong mô thực vật được lý giải theo rất nhiều
hướng khác nhau. Nhưng hợp lý nhất có lẽ là giả thuyết cho rằng vi nấm nội sinh
xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong q trình tiến hóa của cây. Trên cây cũng
có một hệ vi sinh vật, trong đó có những chủng tồn tại im lìm và chỉ gây bệnh khi
cây già yếu hoặc gặp điều kiện sống bất lợi. Sự tương tác giữa cây chủ và vi sinh
vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài đã tạo ra những đột biến gen từ

Trang 4


Võ Thị Ngọc Mỹ
những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng vi nấm nội sinh hữu ích không
gây bệnh [77].
Giữa vi nấm nội sinh và cây chủ có mối quan hệ cộng sinh, tương sinh hoặc hỗ
sinh... Mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh giữa vi nấm nội sinh và thực vật thể
hiện khá mật thiết. Có lúc chúng liên kết chặt chẽ như một cá thể duy nhất và góp
phần tạo nên đặc tính riêng biệt của cây.
Vi nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của cây chủ. Ở một số
lồi cây cỏ có vi nấm nội sinh tồn tại, người ta nhận thấy chúng gia tăng sức chịu
đựng khô hạn hoặc chịu được độc tính của nhơm trong nguồn nước, trong mơi
trường sống…[65]. Ngồi việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ
như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều sản phẩm tự nhiên được sinh ra từ vi nấm
nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn,
kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mơ thực vật. Điều đó cũng
chính là lý do tại sao một số chủng vi nấm nội sinh có thể sinh ra những chất hóa
học thực vật tạo nét riêng biệt, độc đáo cho cây chủ. Ví dụ như có chủng vi nấm nội

sinh sinh ra taxol, một hoạt chất quan trọng có ý nghĩa lớn trong lĩnh vực y dược
học [73].
1.1.4. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật phân lập vi nấm nội sinh
Mô thực vật non thích hợp để phân lập vi nấm nội sinh hơn so với mô trưởng
thành do ở mô trưởng thành thường chứa nhiều loại vi nấm khác nhau nên việc
phân lập vi nấm trở nên khó khăn. Các mẫu thực vật thu thập phải được lưu trữ ở 4
°C cho đến khi phân lập vi nấm nội sinh, và việc phân lập nên được tiến hành càng
sớm càng tốt để tránh nhiễm vi khuẩn trong khơng khí.
Để thu nhận được vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học, cần lựa chọn các loài
thực vật nổi bật vể đặc tính sinh học, tuổi tác, đặc hữu, lịch sử về thực vật học, môi
trường sống của cây chủ. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy cây thuốc và thực vật sống
trong môi trường đặc biệt thường xuyên được nghiên cứu để sàng lọc vi nấm nội
sinh sản sinh các chất kháng sinh [77].

Trang 5


Võ Thị Ngọc Mỹ
1.1.4.1. Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường
Với những lồi thực vật này, mơi trường bất thường và các điều kiện tự nhiên
khắc nghiệt bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần một yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây
có khả năng chống chịu cao. Và người ta mong đợi nhân tố đó chính là các vi nấm
nội sinh có ích [65].
1.1.4.2. Thực vật được sử dụng như dược liệu dân gian
Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang
đời khác để chữa lành vết thương, kháng nấm, kháng khuẩn…
Ví dụ: Một nghiên cứu về loài vi nấm nội sinh sản xuất ra nhiều chất mới có hoạt
tính sinh học ở Brazil. Đó là một loài thực vật tên là “Hướng dương Mexico” –
Tithonia diversifolia (Asteraceae) thường được nhắc đến với rất nhiều điểm đáng
chú ý. Từ lâu, dựa vào kinh nghiệm truyền miệng người ta đã sử dụng cây này để

chữa một số bệnh như: sốt rét, tiêu chảy, sốt siêu vi, viêm gan và chữa lành các vết
thương hở. Ngoài ra các chất chiết từ T. diversifolia với hoạt tính kháng viêm, diệt
amip, chống co thắt, kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus cũng được nhắc đến.
Dựa trên những thơng tin đó, các nhà khoa học đã tiến hành phân lập và phân lập ra
được loài Phoma sorghina, một vi nấm nội sinh từ lá của cây “Hướng dương
Mexico” này. Từ đó thu được 6 dẫn chất anthraquinon từ chất biến dưỡng của vi
nấm với một nửa trong số đó là các chất mới được biết đến [77].
1.1.4.3. Thực vật có tính đặc thù về sinh thái
Các thực vật có tuổi thọ cao bất thường, phát triển trong các vùng có biến đổi
sinh học lớn, hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa…cũng là những đối tượng
nghiên cứu rất lý tưởng để cung cấp các vi nấm nội sinh mới lạ. Thực vật bị bao
quanh bởi cây bị nhiễm tác nhân gây bệnh, nhưng khơng bị nhiễm bệnh và có nhiều
khả năng chứa vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn hơn các cây chủ khác.
Ví dụ: Tuntiwachwuttikul và cộng sự năm 2008 đã tìm thấy một loại vi nấm nội
sinh cho hoạt tính chống lại những tác nhân gây bệnh trên cây chuối Colletotrichum
musae (Phyllachoraceae) [81].

Trang 6


Võ Thị Ngọc Mỹ
1.1.4.4. Thực vật đặc hữu
Các loài thực vật đặc hữu có một tuổi thọ bình thường, hoặc chiếm diện tích đất
nhất định trong tự nhiên. Chaetomium globosum phân lập từ lá của thực vật đặc hữu
Maytenus hookeri chỉ phân bố ở các vùng Vân Nam, Trung Quốc sinh
chaetoglobosin B ức chế được vi khuẩn lao [81].
1.1.5. Sự đa dạng của vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh rất phong phú, theo nghiên cứu của Matsushima năm 1971 [65]
tiến hành trên một số thực vật hạt kín và cây lá kim ở Bắc Mỹ và Panama đã cho
rằng đa phần các vi nấm nội sinh thuộc về lớp Nấm túi Ascomycetes.

Hình 1.1. Các chủng thuộc lớp Ascomycetes phân lập từ lá của cây hạt kín và cây
lá kim ở Bắc Mỹ và Panama [65]. (Nguồn: Selim KA và cộng sự, 2012)
Huang và cộng sự năm 2008 cũng đã tìm thấy các loại vi nấm nội sinh hiện diện
trong 27/29 cây thuốc khảo sát. Tần số xuất hiện của các vi nấm nội sinh tương đối
cao, chủ yếu là các chi Fusarium (27%), Colletotrichum (20%), Phomopsis (11%),
Alternaria (9%), Aspergillus (5%)…[65].
Theo thống kê của các nhà khoa học nghiên cứu về ba họ thực vật ở Đông Nam
Arizona - Mỹ, rừng ở North Carolina và rừng Phương Bắc [65] cho thấy:
– Khảo sát cây chủ đại diện cho họ Fagaceae thu được 44 chủng vi nấm nội sinh
trong đó chi Sordariomycetes chiếm ưu thế.

Trang 7


Võ Thị Ngọc Mỹ
– Khảo sát cây Pinus ponderosa đại diện cho họ Pinaceae thu được 111 chủng vi
nấm nội sinh, trong đó chi Leotiomycetes chiếm ưu thế.
– Khảo sát 2 cây Cupressus arizonica và Platycladus orientalis đại diện cho họ
Cupressaceae thu được 42 chủng, trong đó chi Dothideomycetes chiếm ưu thế.
1.1.6. Vi nấm nội sinh sinh các hoạt chất sinh học
Nhiều vi nấm sống nội sinh trong cây đã được phân lập, chúng có khả năng sinh
các hoạt chất sinh học như kháng sinh, kháng khuẩn, kháng nấm, kìm hãm khối u,
chống oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
1.1.6.1. Vi nấm nội sinh sinh chất kháng khuẩn, kháng nấm
Nhiều nghiên cứu về các hoạt chất kháng khuẩn, kháng nấm được sinh ra từ vi
nấm nội sinh, chủ yếu thuộc về các nhóm: alkaloid, peptid, steroid, terpenoid,
phenol, quinine và flavonoid… Các hợp chất này chỉ chiếm một phần nhỏ trong
tổng số hoạt chất mà các loài vi nấm nội sinh sinh ra, rõ ràng chúng là một nguồn
tiềm năng tuyệt vời và mới lạ để sản xuất các chất kháng sinh mới. Điều này mang

nhiều hứa hẹn giải quyết được vấn đề kháng thuốc ở vi khuẩn vì các chất kháng
sinh này là các hợp chất mới và có hoạt tính cao.
Bảng 1.1. Tác động kháng sinh của một số loài vi nấm nội sinh [15], [62], [65]
Vi nấm nội sinh
Pestralotiopisis
microspora
Pestralotiopisis
jesteri
Colletotrichum
gloeosporioides
Colletotrichum sp.

Muscodor albus
Fusarium sp.

Nguồn phân lập
Torreya axifolia

Kháng sinh
Pestalopyrone
Hydroxypestalop
yrone
Các cây mọc ở Hydroxyl
sông thuộc Papua jesterone
New Guinea
Artemisia
Acid colletotric
mongolica
Artemisia annua
Chất biến dưỡng

Cinnamomum
zeylanicum
Selaginella
pallescens

Chất bay hơi
CR 337:
pentaketide mới

Trang 8

Tác động kháng VSV
Kháng sinh thực vật

Kháng nấm gây bệnh thực
vật
Kháng khuẩn
Helminthosporium sativum
Kháng khuẩn, kháng vi
nấm gây bệnh cho người
và thực vật
Ức chế vi khuẩn và nấm
Candida albicans


Võ Thị Ngọc Mỹ
Acremonium zeae

Zea mays L.

Pyrrocidines A, Nấm
B
Cryptosporiopsis
Tripterigeum
Cryptocandin
C. albicans
quercina
wilfordii
Trichophyton spp.
Cryptocin
Botrytis cinerea
Pryriaria oryzae và một số
vi nấm gây bệnh thực vật
Alternaria sp.
8 loại cây thuốc Dịch chiết từ C. albicans
Nigrospora oryzae được tìm thấy ở 3 dịch lên men
Papulospora sp.
khu vực khác nhau
tại miền Tây Ấn
Độ
Chaetomium
Lá cây Ginkgo Chaetoglobosin
Mucor miehei
globosum
biloba
A và C
Talaromyces sp.
Rừng ngập mặn
7-epiaustdiol

P. aeruginosa
Stemphyperyleno Sarcina ventriculi
l Secalonic A

Bên cạnh đó, Phomopsis là vi nấm nội sinh sản xuất phomopsichalasin tiêu biểu
cho nhóm hợp chất đầu tiên loại cytochalasin.
1.1.6.2. Vi nấm nội sinh sinh chất ức chế khối u
Từ 1990, Taxomyces andreanae lần đầu tiên được phân lập từ cây Taxus
brevifolia, vi nấm này sinh paclitaxel – chất ức chế các thoi vơ sắc trong q trình
phân bào, có phổ khối tương tự như paclitaxel chiết từ cây Thông đỏ (Taxus). Tiếp
sau đó, một số vi nấm sản xuất paclitaxel đã được phân lập từ nhiều thực vật và các
loài Taxus khác [80], [90].
Bảng 1.2. Một số vi nấm nội sinh sản sinh paclitaxel [80], [90]
STT
Vi sinh vật nội sinh
1
Pestalotiopsis microspora
2
Pestalotiopsis guepini
3
Seimatoantlerium tepuiense

Nguồn phân lập
Taxus wallichiana
Wollemia nobilis (cây quý hiếm)
Maguireothamnus sprciosus

1.1.6.3. Vi nấm nội sinh sinh hoạt chất kháng côn trùng
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tầm quan trọng của vi nấm nội sinh trong sản
xuất thuốc kháng côn trùng, có nhiều ý nghĩa trong việc bảo vệ cây trồng và giúp

tăng sản lượng trong nông nghiệp [65].

Trang 9


Võ Thị Ngọc Mỹ
Bảng 1.3. Tác động kháng côn trùng của một số loài vi nấm nội sinh [65]
Vi nấm nội sinh
Nodulisporium sp.

Nguồn phân lập
Bontia daphnoides

Tên chất
Nodulisporic

Muscodor vitigenus

Paullina paullinioides

Napthalen

Tác động sinh học
Trừ sâu, chống lại ấu
trùng của ruồi xanh,
nhặng…
Trừ rệp

1.1.6.4. Vi nấm nội sinh sinh hoạt chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hoá là những chất phản ứng với gốc tự do tạo ra trong q trình

oxy hố nên ngăn cản hay làm chậm quá trình này. Chất chống oxy hóa phịng ngừa
và điều trị các bệnh như ung thư, tim mạch (xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, thiếu
máu cục bộ), đái tháo đường, các bệnh thối hóa thần kinh (bệnh Parkinson), viêm
khớp và lão hóa... Vi nấm nội sinh ở thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp nhiều
hoạt chất chống oxy hóa mới [12], [64].
Bảng 1.4. Tác động chống oxy hóa của một số lồi vi nấm nội sinh [18], [71]
Vi nấm nội sinh
Pestalotiopsis
microspora
Cephalosporium
sp.
Microsphaeropsis
olivacea
Xylaria sp.
Phyllosticta sp.

Nguồn phân lập
Terminalia
morobensis
Trachelospermum
jasminoides
Pilgerodendron
uviferum
Ginkgo biloba
Guazuma
tomentosa

Chất biến dưỡng
Pestacin
Isopestacin

Graphislactone A

Tác động sinh học
Chống oxy hóa mạnh
Kháng nấm
Chống oxy hóa mạnh
hơn BHT và acid
ascorbic.

Phenolic, flavonoid Chống oxy hóa mạnh
Nhiều chất biến Chống oxy hóa mạnh
dưỡng

1.1.6.5. Vi nấm nội sinh sinh các chất có tác động sinh học khác
Vi nấm nội sinh cũng được biết đến như nguồn cung cấp nhiều chất chuyển hóa
sinh học khác, chẳng hạn như chất kháng viêm, chữa trị bệnh tiểu đường, hạ đường
huyết, gây ức chế miễn dịch... Thuốc ức chế miễn dịch được sử dụng để ngăn chặn
việc đào thải trong cấy ghép nội tạng và có thể được sử dụng để điều trị các bệnh tự
miễn dịch như viêm khớp dạng thấp, bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin cũng được
biết đến từ vi nấm nội sinh [65].

Trang 10