Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (pangasius hypophthalmus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ
DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2018

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ
DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm và Đồ uống
Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Quản Lê Hà
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Đặng Minh Nhật

Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Minh Tuyển
Phản biện 2: GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn

Phản biện 3: TS. Lê Thị Minh Thủy
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. GS.TS. Phan Đình Tuấn
2. PGS.TS. Nguyễn Hoàng Dũng
ii


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả
nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ
một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được
thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.
Tác giả luận án

Lê Thị Thu Hương

iii


TĨM TẮT LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của luận án
Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bào và mô liên kết [1], [2].
Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein của cơ thể, đóng vai trị then chốt trong thành
phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,…Collagen là một loại
vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực
phẩm và dược phẩm [3], [4].
Trước đây, collagen được tinh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò,
lợn. Từ năm 2000 đến nay, do sự bùng nổ của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ở
lợn và gia súc; thêm vào đó, vì lý do tơn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm có
nguồn gốc từ bị, lợn nên đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn

nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản.
Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu thủy sản lớn của thế giới, chủ yếu là
mặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa. Lượng phụ phẩm của hai loại cá này thải ra hàng năm
lên tới hàng trăm ngàn tấn. Tại thời điểm hiện tại, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếu
được chế biến thành thức ăn gia súc và phân bón có giá trị kinh tế thấp. Trong khi đó,
da cá tra chứa một lượng collagen khá lớn, đây là sản phẩm có giá trị cao, được ưa
chuộng trên thị trường thế giới, có rất nhiều ứng dụng trong cơng nghiệp thực phẩm, mỹ
phẩm, dược phẩm và vật liệu sinh học.
Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhằm đa dạng hóa các sản phẩm
có nguồn gốc từ thủy sản, nâng cao giá trị kinh tế của loài cá tra, cá ba sa, từ đó nâng
cao thu nhập cho người nuôi trồng và chế biến thủy sản là rất cần thiết.
2. Mục tiêu của luận án
Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius
hypophthalmus)” được thực hiện với mục tiêu:
(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết collagen và xác định các giải
pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen;
iv


(2) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học q trình trích ly collagen nhằm lựa
chọn các thơng số cơng nghệ thích hợp và thơng qua mơ hình hóa về động học trích ly
để dự đốn được hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả năng chủ động
điều khiển q trình trích ly.
(3) Xác định một số đặc tính hóa lý của collagen tách chiết từ da cá tra.
3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định thông số kỹ thuật của ba cơng đoạn chính trong quy trình cơng nghệ tách
chiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen.
- Tối ưu hóa q trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response
Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo
phương án quay bậc hai tâm xoay Box – Hunter; đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi

quy theo chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn
Fisher; Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng
phương pháp bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mơ hình dự
đoán.
- Nghiên cứu động học và cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thơng số ảnh
hưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hành
khảo sát sự thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay đổi hàm
lượng của các thông số ảnh hưởng. Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng,
đánh giá sự tương thích của ba mơ hình với thực nghiệm để chọn mơ hình phù hợp mơ
tả đúng nhất động học q trình trích ly collagen.
- Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra như: thành phần amino acid, cấu tạo
phân tử, nhiệt độ biến tính. Đồng thời kiểm tra một số chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh
vật trong collagen thành phẩm.
4. Những đóng góp mới của luận án
* Về mặt học thuật

v


(1) Đã xây dựng được mơ hình tốn học mơ tả quy luật ảnh hưởng của nồng độ acetic
acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen;
(2) Xác định được q trình trích ly collagen từ da cá tra tn theo quy luật động học
bậc hai;
(3) Xác định được bản chất của collagen tách chiết từ da cá tra và các đặc tính của nó.
* Về mặt thực tiễn
(1) Đưa ra giải pháp kỹ thuật hiệu quả để làm sạch da cá tra trước khi trích ly bằng cách
sử dụng LASNa để loại lipid và H2O2 để khử màu da cá với các thông số kỹ thuật cụ
thể.
(2) Xây dựng được phương trình hồi quy mơ tả quan hệ giữa hiệu suất trích ly collagen
với các yếu tố ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung

mơi/da cá, từ đó xác định được các giá trị tối ưu.
(3) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại muối ra khỏi collagen bằng phương pháp
thẩm tích với hiệu suất tách muối cao nhất đạt 95,75%.
(4) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại lipid ra khỏi collagen thành phẩm bằng kỹ
thuật trích ly lipid bằng dung môi CO2 siêu tới hạn.
(5) Đánh giá các đặc tính chất lượng của collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phù
hợp để dùng làm vật liệu sinh học hoặc sử dụng trong nuôi cấy tế bào.

vi


ABSTRACT
Fish skin is the byproduct of fishery companies in the Mekong River Delta. Basa fish
(Pangasius hypophthalmus) skin contains large amounts of collagen, highly valuable
protein in the food, cosmetics and pharmaceutical industries. The aims of this thesis
"Research on methods of extraction collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus)
skin" were as follows: (1) Research on extraction process of collagen from tra fish
(Pangasius hypophthalmus) skin; (2) Optimisation and kinetics studies on the extraction
of collagen from tra fish skin; (3) Studies on the characterizations of collagen from tra
fish skin
The thesis presented an overview of the structure, origin and application of collagen; the
collagen extraction methods and the theoretical basis of kinetic of solid – liquid
extraction.
Statistical optimization of process conditions using the central composite design (CCD)
appeared to be an effective tool for the extraction process of soluble collagen from the
fish skin (Pangasius hypophthalmus). Each of the three independent variables (acetic
acid concentration, liquid to solid ratio, and pepsin content) showed a significant effect
in the yield of extracted collagen. The mathematical model gave an R2 of 0,993 and a P
value of less than 0,0001, which implied a good agreement between the predicted values
and the actual values of the yield of PSC, thus confirmed a good generalization of the

mathematical model.
The optimal conditions to obtain maximum yield of PSC were identified as follows: 0,47
M of acetic acid concentration, 55 mL/g of liquid to solid ratio and 0,49 % of pepsin
content. Under these optimized conditions, the experimental PSC extraction yield
agreed closely with the predicted yield of 92,44 %.
Kinetic models based on the second order rate equation were successfully developed to
describe the extraction process with different processing variables. Extraction rate
constant, initial extraction rate and equilibrium concentrations of collagen for different
acetic acid concentrations, pepsin contents and liquid to solid ratios were predicted. The

vii


model verification showed that the experimental values agreed with the predicted ones,
with percentage error differences in the range of 0,18 - 4,05 %.
The extraction of collagen from basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin mainly
consists of three phases: Phase 1- Removing fat and pigments: basa fish skin was treated
by LASNa 0,5 % to remove fat, during 6 hours and H2O2 1 % to remove pigments,
during 2 hours. The compositions of basa fish skin after treatment by LASNa were as
follows: hydroxyproline - 13,8 mg/g; moisture - 79,54 %; organic substance - 20,33 %;
lipid – 0,98 % and ash – 0,13 %; color parameters obtained as follows: L = 73,065 ±
0,12; a = -3,64 ± 0,11 and b =18,32 ± 0,68. Phase 2 - Extraction of collagen from basa
fish skin and fractional precipitation to obtain collagen: Collagen was extracted from
basa fish skin with acetic acid - 0,47 M, pepsin - 0,49 % and L/S - 55 ml/g during 24
hours at a temperature of 4 °C, then NaCl was added to a final concentration of 0,9 M
in order to precipitate collagen. Phase 3 - Refining collagen in two main stages
(removing sodium chloride in solution collagen by dialysis and removing lipid by
SCCO2). After purification, the compositions of collagen were: 0,159 % of NaCl; 0,1467
% of lipid (by dry weight).
The collagen from basa fish skin is identified as type I collagen. The collagen consist of

three chains as follows: the α chain with molecular weight of about 130 kDa, the β chain
with molecular weight of about 250 kDa (as components of two α chain) and the γ chain
chain with molecular weight of about 300 kDa (as components of 3 α chain). The
denature temperature of collagen is 39 oC. The final product’s compositions were:
hydroxyproline 97,76 mg/g (corresponding collagen content is 927,7 mg/g); organic
compounds 92,8 %; moisture 7,0 %; lipid 0,03 % and ash 0,20 %; without detection of
heavy metals (As, Pb). The product met the microbiological standards of Vietnam
Pharmacopoeia IV-2009.

viii


LỜI CÁM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất tới: GS.TS. Phan Đình Tuấn và PGS.TS. Nguyễn
Hồng Dũng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q
trình thực hiện luận án này.
Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education)- JICA, thầy PGS.TS. Nguyễn
Hoàng Dũng, chủ nhiệm đề tài B1-07 “Fish collagen extraction and application” và cơ
PGS.TS. Phan Ngọc Hịa chủ nhiệm đề tài B2-06 “Purification collagen from Pangasius
hypophthalmus fish skin and application”, GS. Shigeru Morimura - cố vấn đề tài, cùng
toàn thể các thành viên thực hiện đề tài đã hỗ trợ và cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong
q trình thực hiện luận án.
Tơi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn, TS. Trần
Bích Lam, GS.TS. Đống Thị Anh Đào, Cô Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS. Mai Thanh
Phong, PGS.TS. Lê Kim Phụng, TS. Hồng Minh Nam, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học,
Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và
giúp đỡ tôi trong q trình nghiên cứu thực nghiệm và dành cho tơi nhiều ý kiến trao
đổi khoa học bổ ích cho luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ
Chí Minh, Phịng Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa Học và Bộ môn Công

Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình học tập và nghiên
cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ giảng viên Khoa Kỹ thuật Hóa học & Mơi
trường, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp
đỡ tơi trong q trình vừa công tác vừa thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và gởi lời chúc tốt đẹp nhất tới quý thầy
cô, bạn bè, đồng nghiệp, các em sinh viên và gia đình đã hỗ trợ, động viên và khuyến
khích tơi trong suốt thời gian qua.

ix


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH....................................................................................xv
DANH MỤC BẢNG BIỂU ....................................................................................... xviii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...............................................................................xx
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN .....................................................................................3

1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất và ứng dụng của collagen ..........................................3
1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen ..................................................................3
1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bò ................................................................................3
1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn ...............................................................................3
1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá .....................................................................................4
1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen ........................................................................................4
1.1.2.1 Thành phần amino acid của phân tử collagen .....................................................5
1.1.2.2 Cấu trúc của collagen ..........................................................................................7

1.1.3 Phân loại collagen .................................................................................................10
1.1.3.1 Collagen dạng sợi ..............................................................................................10
1.1.3.2 Collagen khơng ở dạng sợi ................................................................................10
1.1.4 Tính chất của collagen ..........................................................................................12
1.1.4.1 Tính hydrate hóa của collagen ...........................................................................13
1.1.4.2 Độ nhớt của dung dịch collagen ........................................................................14
1.1.5 Ứng dụng của collagen ........................................................................................15
1.1.5.1 Ứng dụng của collagen trong thực phẩm ..........................................................15
1.1.5.2 Ứng dụng của collagen trong lĩnh vực vật liệu sinh học ...................................16
x


1.1.5.3 Ứng dụng của collagen trong dược phẩm .........................................................17
1.2 Đặc điểm của cá tra .................................................................................................19
1.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da cá ........................................................19
1.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thế giới ...19
1.3.2 Trình tự tách chiết collagen từ da cá ....................................................................21
1.2.2.1 Quá trình tách tạp chất để sản xuất collagen .....................................................22
1.2.2.2 Q trình trích ly collagen .................................................................................26
1.2.2.3 Q trình tinh sạch collagen .............................................................................30
1.4 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly rắn –lỏng ............................................32
1.4.1 Mơ hình hấp phụ Peleg ........................................................................................33
1.4.2 Mơ hình khuếch tán Fick .....................................................................................33
1.4.3 Mơ hình động học bậc hai ....................................................................................33
1.5 Những vấn đề tồn tại và định hướng nghiên cứu ....................................................34
1.5.1 Những vấn đề tồn tại ............................................................................................34
1.5.2 Định hướng nghiên cứu ........................................................................................34
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............35
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất ........................................................................................35
2.1.1 Ngun liệu...........................................................................................................35

2.1.2 Hố chất ................................................................................................................35
2.2 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra ................................................................37
2.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................39
2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................................39
2.3.2 Hoạch định thí nghiệm .........................................................................................41
2.3.2.1 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) ........41
2.3.2.2 Khảo sát quá trình trích ly collagen từ da cá tra ................................................42
xi


2.3.2.3 Nghiên cứu động học và cơ chế trích ly collagen .............................................45
2.3.2.4 Phương pháp tinh sạch collagen ........................................................................50
2.3.3 Phương pháp phân tích .........................................................................................53
2.3.3.1 Phương pháp hóa lý ...........................................................................................53
2.3.3.2 Phương pháp phân tích vi sinh ..........................................................................59
2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................60
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................................61
3.1 Phân tích nguyên liệu da cá tra ................................................................................61
3.2 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra............................................................62
3.2.1 Tách tạp chất từ da cá tra bằng NaOH..................................................................62
3.2.2 Tách tạp chất từ da cá tra bằng LASNa ................................................................64
3.2.3 Tách tạp chất từ da cá tra bằng ethanol ................................................................65
3.2.4 Xử lý màu da cá tra bằng H2O2 ............................................................................68
3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen ..................71
3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid đến hiệu suất trích ly collagen ....................71
3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ số dung môi : da cá (L/S) đến hiệu suất trích ly collagen ......73
3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pepsin đến hiệu suất trích ly collagen .........74
3.4 Tối ưu hóa q trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng
phần mềm Design Expert 10. ........................................................................................75
3.4.1 Phân tích thống kê và dự đốn phương trình hồi quy ..........................................75

3.4.2 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương
pháp bề mặt đáp ứng RSM-CCD ...................................................................................78
3.5 Nghiên cứu động học của q trình trích ly collagen từ da cá tra bằng dung dịch
acetic acid kết hợp với enzyme pepsin ..........................................................................81
3.5.1 Nghiên cứu động học của q trình trích ly collagen theo mơ hình Peleg...........81

xii


3.5.2 Nghiên cứu động học của q trình trích ly collagen theo mơ hình khuếch tán Fick
.......................................................................................................................................84
3.5.3 Nghiên cứu động học của q trình trích ly collagen theo mơ hình động học phản
ứng bậc hai .....................................................................................................................87
3.5.4 Xác định hàm lượng collagen và tốc độ trích ly theo mơ hình động học bậc hai 91
3.5.5 Kiểm tra sự phù hợp của mơ hình động học bậc hai với thực nghiệm .................93
3.6 Khảo sát quá trình tinh sạch collagen ......................................................................95
3.6.1 Khảo sát q trình thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch collagen bằng màng
cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing) ..................95
3.6.1.1 Thẩm tích lần thứ nhất .......................................................................................95
3.6.1.2 Thẩm tích lần thứ hai .........................................................................................96
3.6.2 Tách lipid bằng CO2 siêu tới hạn (SCCO2) ..........................................................97
3.6.2.1 Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid ...............................97
3.6.2.2 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid...........................98
3.6.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid .............................99
3.6.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid
.....................................................................................................................................100
3.6.2.5 Khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian ở các điều kiện tối ưu .....................102
3.7 Xác định đặc tính hóa lý của collagen thành phẩm ...............................................103
3.7.1 Xác định thành phần hóa học của collagen thành phẩm ....................................103
3.7.2 Kết quả điện di collagen thành phẩm trên gel polyacrylamide – SDS ...............103

3.7.3 Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá tra ......................................................104
3.7.4 Cấu trúc sợi collagen từ da cá tra ......................................................................105
3.7.5 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tra ...............................................................107
3.7.6 Thành phần các amino acid trong collagen từ da cá tra .....................................108
3.7.7 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra .....................................110
3.7.8 Kiểm nghiệm vi sinh trong collagen da cá tra ....................................................110
xiii


3.8 Đặc tính của collagen da cá tra ..............................................................................111
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................................112
DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ............................................................114
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................115

xiv


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu trúc của sợi dây chằng ...............................................................................7
Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen loại I ......................................................................8
Hình 1.3 (A) Hình ảnh vi sợi collagen với chu kì D = 67 nm nhìn qua kính hiển vi điện
tử truyền qua (TEM). (B) Biểu đồ thể hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử collagen
trong vi sợi. Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử collagen trong vi
sợi ...................................................................................................................................9
Hình 1.4 Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) ........................................19
Hình 1.5 Sơ đồ trình tự tách chiết collagen ...................................................................21
Hình 1.6 Giản đồ pha của CO2 ....................................................................................23
Hình 1.7 Cơ chế phá vỡ melanin .................................................................................25
Hình 1.8 Giai đoạn đầu và cuối của quá trình thẩm tích ..............................................32
Hình 2.1 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra .......................................................38

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................39
Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................40
Hình 2.3 Thiết bị trích ly collagen .................................................................................43
Hình 2.4 Sơ đồ ngun lý hoạt động của thiết bị CO2 siêu tới hạn THAR SFC SN.11419
mơ phỏng trên máy tính .................................................................................................52
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a),
hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................63
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ LASNa đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a),
hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................64
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a),
hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................66
Hình 3.4 (a) Da cá trước khi xử lý màu bằng H2O2 và (b) da cá sau khi xử lý màu bằng
H2O2 ...............................................................................................................................70
Hình 3.5 (a) Hiệu suất trích ly collagen ở các nồng độ acetic acid khác nhau đạt được
sau 24h với tỷ số L/S là 60 ml/g và hàm lượng pepsin là 0,5 %; (b) Sự gia tăng hiệu suất
trích ly collagen theo thời gian ở các nồng độ acetic acid khác nhau. ..........................72

xv


Hình 3.6 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các tỷ số L/S khác nhau; nồng độ acetic
acid là 0,55 M và hàm lượng pepsin là 0,5 %. ..............................................................73
Hình 3.7 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các hàm lượng pepsin khác nhau; nồng
độ acetic acid là 0,55 M và tỷ số L/S là 60 ml/g. ..........................................................74
Hình 3.8a Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid và hàm lượng pepsin đến hiệu suất trích
ly collagen ......................................................................................................................79
Hình 3.8b Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen
.......................................................................................................................................79
Hình 3.8c Ảnh hưởng của hàm lượng pepsin và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen
.......................................................................................................................................80

Hình 3.9 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình Peleg với sự ảnh hưởng của nồng độ
acetic acid ......................................................................................................................81
Hình 3.9 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình Peleg dưới tác động của tỷ số L/S ....82
Hình 3.9 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình Peleg dưới tác động của hàm lượng
enzyme pepsin. ..............................................................................................................82
Hình 3.10 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng
độ acetic acid .................................................................................................................84
Hình 3.10 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình khuếch tán Fick dưới tác động của tỷ số
L/S .................................................................................................................................85
Hình 3.10 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình khuếch tán Fick dưới tác động của hàm
lượng enzyme pepsin. ....................................................................................................85
Hình 3.11 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình động học bậc hai dưới tác động của nồng
độ acetic acid .................................................................................................................87
Hình 3.11 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình động học bậc hai dưới tác động của tỷ
số L/S .............................................................................................................................88

xvi


Hình 3.11 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mơ hình (đường liền nét) của q
trình trích ly collagen từ da cá tra theo mơ hình động học bậc hai dưới tác động của hàm
lượng enzyme pepsin. ....................................................................................................88

Hình 3.12 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các
tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ nhất) ...............................95
Hình 3.13 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các
tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ hai) .................................96
Hình 3.14 (a) - Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện
di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3
collagen sau khi trích ly lipid ở áp suất tương ứng 100, 200 và 300 bar, cột 4 - protein
chuẩn ..............................................................................................................................98
Hình 3.15 (a)- Ảnh hưởng của lưu lượng dịng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình
điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 13 collagen sau khi trích ly lipid ở lưu lượng dòng CO2 tương ứng 5, 10 và 15 g/phút, cột
4 - protein chuẩn ............................................................................................................99
Hình 3.16 (a)- Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình
điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột
1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở nhiệt độ dịng CO2 tương ứng 34, 38 và 42 oC, cột 4
- protein chuẩn .............................................................................................................100
Hình 3.17 (a) -Ảnh hưởng của chất trợ dung mơi- ethanol đến hiệu suất tách lipid; (b)Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid,
cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid với hàm lượng ethanol tương ứng 5, 10 và 15 % ,
cột 4 - protein chuẩn ....................................................................................................101
Hình 3.18 (a) - Kết quả khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian; (b)- Hình điện di SDSPAGE của các mẫu collagen. Cột 1-4 collagen sau khi trích ly lipid với thời gian lưu
tương ứng 10, 20, 30 và 40 phút, cột 5 - protein chuẩn ..............................................102
Hình 3.19 SDS-PAGE của collagen da cá tra cột 1, 2, 3, 4 và cột 0 - protein chuẩn.104
Hình 3.20 Đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0,3 %........................105
Hình 3.21 Ảnh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra ...........................106
Hình 3.22 Ảnh TEM chụp bó sợi collagen tách chiết từ da cá tra ..............................106
Hình 3.23 Phổ FTIR của collagen tách chiết từ da cá tra ............................................108

xvii


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá ............6
Bảng 1.2 Cấu tạo của chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người .12
Bảng 1.3: Đặc tính collagen loại I dạng sợi của Cơng ty Collagen Solutions ..............17
Bảng 1.4 Tóm tắt q trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp acid
.......................................................................................................................................27
Bảng 1.5 Tóm tắt q trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp
enzyme ...........................................................................................................................28
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong q trình thực hiện luận án .....................35
Bảng 2.2 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát ......................44
Bảng 3.1 Thành phần hóa lý của da cá tra ...................................................................61
Bảng 3.2 So sánh hiệu quả tách tạp chất và mức độ thất thoát hydroxyproline khi xử lý
da cá tra bằng NaOH, LASNa và ethanol ở các điều kiện đã chọn ...............................68
Bảng 3.3 Độ sáng của da cá Tra sau xử lý H2O2 ở các nồng độ khác nhau .................69
Bảng 3.4 Thành phần hóa học của da cá tra sau khi xử lý H2O2 .................................71
Bảng 3.5 Kế hoạch thực nghiệm xác định hiệu suất trích ly collagen theo ..................76
Bảng 3.6 Kết quả phân tích ANOVA cho mơ hình đáp ứng bậc hai ............................77
Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm ........................78
Bảng 3.8 So sánh kết quả thực nghiệm và mơ hình ......................................................80
Bảng 3.9 Các thông số động học và giá trị tương quan thống kê của q trình trích ly
collagen từ da cá tra theo mơ hình Peleg .......................................................................83
Bảng 3.10 Các thơng số mơ hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly
collagen từ da cá tra theo mơ hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng độ acetic
acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin. ...............................................................86
Bảng 3.11 Các thơng số mơ hình và giá trị tương quan thống kê của q trình trích ly
collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) theo mơ hình động học bậc hai dưới
tác động của nồng độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin. .................89
Bảng 3.12 Các hệ số cơ bản của ba mơ hình nghiên cứu ..............................................91

xviii

Bảng 3.13 Hàm lượng collagen xác định từ thực nghiệm và mơ hình dự đốn theo thời
gian trích ly ở các nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin, tỷ số L/S khác nhau.
.......................................................................................................................................94
Bảng 3.14 Nồng độ NaCl trong dung dịch collagen sau hai lần thẩm tích ...................97
Bảng 3.15 Thành phần hóa lý của collagen thành phẩm ............................................103
Bảng 3.16 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da cá tra .....................109
Bảng 3.17 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra .............................110
Bảng 3.18 Chỉ tiêu vi sinh trong collagen da cá tra.....................................................110
Bảng 3.19 Mô tả sản phẩm collagen da cá tra .............................................................111

xix


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ASC

Acid - Solubilized Collagen

CCD

Central Composite Design

DOC

Deoxycholate

DMSO

Dimethyl Sulfoxide

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

FTIR

Fourier Transformation Infra-red

LASNa

Sodium Lauryl Benzen Sulfonate

L/S

Liquid/ Solid

MPD

2- Methyl – 2, 4 – Pentanediol

PE

Polyethylene

PSC

Pepsin - Solubilized Collagen

RCDMB

Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing

RMSD

Root Mean Square Deviation

RSM

Response Surface Methodology

SCCO2

Supercritical Carbon Dioxide

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
± SD

Standard Deviation

SEM

Scanning Electron Microscope

TEM

Transmission Electron Microscopy

xx


MỞ ĐẦU
Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bào và mô liên kết [1], [2].
Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein ở cơ thể người, đóng vai trò then chốt trong
thành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,… Collagen là
một loại vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm,
thực phẩm và dược phẩm [3], [4].
Trước đây, collagen được tinh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò,
lợn. Hiện nay, do sự bùng nổ của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ở lợn và gia
súc; thêm vào đó, vì lý do tơn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ
bị, lợn nên trong những năm gần đây đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung
vào nguồn nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản [5] như: nghiên cứu tinh chế
collagen từ da cá biển để làm vật liệu nha khoa [6]; nghiên cứu tính chất hóa sinh của
dịch chiết collagen từ các lồi cá có giá trị kinh tế thấp [7]; tinh chế collagen từ da cá
nóc bạc (Lagocephalus gloveri) [8]; tinh chế collagen từ da cá đuối gai (Raja kenojei)
[9]; nghiên cứu tính chất của collagen trích ly từ da cá nóc (Takifugu rubripes) [10];
nghiên cứu cấu trúc của collagen trích ly từ da cá [11],…Nhìn chung, đa số các nghiên
cứu tách chiết collagen từ da cá hiện có tập trung vào các loại cá vùng ôn đới, các nghiên
cứu tách chiết collagen trên cá nhiệt đới chưa nhiều, mới chỉ có một vài nghiên cứu về
xác định đặc tính của collagen tách chiết từ da và xương cá hồng (bigeye snapper) [12];
nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến q trình trích ly collagen loại I tách từ da cá
đuối (Pomadasys kaakan) [13].
Ở nước ta, các nhà máy chế biến cá tra, cá ba sa trên địa bàn Đồng bằng Sông Cửu Long
hàng năm thải ra hàng ngàn tấn phế liệu da và xương cá, đây là nguồn nguyên liệu rất
phong phú để tách chiết collagen.
Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius
hypophthalmus)” được tiến hành với mục tiêu:

1


(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ tách chiết collagen và xác định các giải
pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen.
(2) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học trích ly collagen nhằm lựa chọn các
thơng số cơng nghệ thích hợp và thơng qua mơ hình hóa về động học trích ly để dự đốn
được hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả năng chủ động điều khiển q
trình trích ly.
Để đạt được mục tiêu trên, đề tài tập trung vào các nội dung sau:
(1) Xác định thông số kỹ thuật của ba cơng đoạn chính trong quy trình cơng nghệ tách
chiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen.
(2) Tối ưu hóa q trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response
Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo
phương án cấu trúc có tâm (CCD); đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theo
chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tối
ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp
bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mơ hình dự đốn.
(3) Nghiên cứu động học và cơ chế của q trình trích ly collagen: với các thông số ảnh
hưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hành
khảo sát sự thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay đổi hàm
lượng của các thông số ảnh hưởng. Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng,
đánh giá sự tương thích của ba mơ hình với thực nghiệm để chọn mơ hình phù hợp mơ
tả đúng nhất động học q trình trích ly collagen.
(4) Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra và khả năng ứng dụng của collagen
trong công nghiệp.

2

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất và ứng dụng của collagen
1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen
Trước đây, collagen được trích ly từ da và xương của một số lồi động vật có xương
sống như lợn và trâu bị. Collagen ngun thể trích ly từ các nguồn này được ứng dụng
nhiều trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm [14]. Tuy nhiên, collagen
từ lợn và trâu bị có một số hạn chế nhất định nên trong những năm gần đây, các nhà
khoa học đã tập trung nghiên cứu tách chiết collagen từ những nguồn nguyên liệu thay
thế có nguồn gốc từ phế liệu thủy sản như: da, xương, vây, vảy của các loài cá nước
ngọt và cá biển, da mực, da ếch,… [5].
1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bị
Collagen trích ly từ da bị đã được sử dụng từ rất lâu trong lĩnh vực y khoa, nó cũng
đóng vai trị quan trọng trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc sức
khỏe [15]. Tuy nhiên, mãi đến năm 1970 nghiên cứu về trích ly collagen từ da bị mới
được hiểu biết rõ, khi các nhà nghiên cứu phát triển hệ thống tách chiết collagen từ da
bị và điều chế nó thành dạng lỏng [16].
1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn
Từ nhiều năm nay, da lợn là nguồn collagen dùng trong sản xuất các sản phẩm như vỏ
bao xúc xích và các loại màng. Trong lĩnh vực y khoa, màng collagen từ da lợn cho thấy
rất hữu ích trong phẫu thuật chỉnh hình. Gần đây, các nhà nghiên cứu cho rằng collagen
dạng bột nhão tách chiết từ da lợn phủ lên vết thương rộng khơng có dấu hiệu đào thải
và khơng gây ra triệu chứng viêm sưng q mức, chính vì vậy có thể xem collagen tách
chiết từ da lợn là một lựa chọn hiệu quả thay thế cho da trong điều trị vết thương rộng
[17].

3

1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá
Tương tự như collagen loại I tách chiết từ động vật hữu nhũ, collagen cá gồm ba chuỗi
polypeptid, mỗi chuỗi có khoảng 1000 amino acid với trọng lượng khoảng 100 kDa.
Collagen cá có hàm lượng hydroxyproline thấp hơn collagen động vật hữu nhũ, do đó
chúng có ít liên kết ngang và kém bền hơn so với collagen của động vật có xương sống
trên cạn [18].
Nguồn collagen từ động vật hữu nhũ rất phù hợp để ứng dụng trong sinh học dược, tuy
nhiên do sự tồn tại của các mối nguy sinh học và tín ngưỡng tôn giáo nên collagen tách
chiết từ phế phụ phẩm của ngành chế biến thủy hải sản sẽ là nguồn collagen thay thế có
hiệu quả và đầy triển vọng [14], [19], [20].
1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen
Những hình ảnh đặc trưng về thành phần cấu tạo và cấu trúc của collagen đã được công
bố vào thập niên 1940 và 1950. Thành phần amino acid của collagen khác với các protein
đã biết, điểm đặc trưng nhất của collagen là có hàm lượng glycine và proline rất cao
[21]. Những thử nghiệm ban đầu để xác định cấu trúc cơ sở của collagen bằng phương
pháp thủy phân từng phần cho thấy: trong chuỗi collagen thơng thường, glycine có thể
chiếm 1/3 tổng chiều dài chuỗi [22]. Nghiên cứu về collagen ở động vật có xương sống
trưởng thành cho thấy có một lượng carbohydrate thấp (khoảng dưới 1 %) trong
collagen. Năm 1966, người ta xác định được carbohydrate đó là galactose hoặc
glucosylgalactose liên kết với nhóm hydroxyl của hydroxylysine [23].
Nghiên cứu nhiễu xạ tia X trên sợi collagen cho thấy, collagen có cấu trúc xoắn bộ ba
(triple-helices) [24]. Quan sát nhiễu xạ trên sợi cơ collagen từ gân đuôi chuột cho thấy
một sự phản xạ mạnh mẽ có tính đối xứng ở 2,9 Ao và phản xạ cầu nằm trong khoảng
11-16Ao tùy thuộc vào mức độ hydrate hóa [25]. Sự cải tiến hình ảnh nhiễu xạ bằng
cách kéo căng [26] cho thấy sự biến đổi cấu trúc dạng hình que và cấu trúc dạng xoắn
ốc. Theo Ramachandran và Kartha [24], collagen bao gồm ba sợi bện thành dạng dây
thừng xoắn theo chiều từ trái qua phải, trong khi đó từng sợi collagen xoắn từ phải qua
trái. Cấu trúc xoắn của collagen giải thích tính đặc trưng của ảnh nhiễu xạ tia X và các
amino acid đặc trưng của chúng.

4


1.1.2.1 Thành phần amino acid của phân tử collagen
Phân tử collagen được cấu tạo từ 20 loại amino acid. Trong đó glycine có hàm lượng
cao nhất, chiếm 33 % tổng số amino acid, khoảng 12 % proline, alanine và
hydroxyproline mỗi loại chiếm 11 %, tổng lượng amino acid còn lại khoảng 23 %. Hàm
lượng hydroxylysine, histidine, phenylalanine, isoleucine, tyrosine và amino acid chứa
lưu huỳnh vào khoảng 1 % hoặc thấp hơn. Các amino acid có cực chiếm khoảng 40 %
phân tử collagen, trong đó 11 % là amino acid có tính bazơ, 9 % là amino acid có tính
acid và khoảng 17 % là amino acid ở dạng hydroxy, khoảng 5 % acid aspartic và
glutamic còn lại tồn tại ở dạng amid. Các amino acid không phân cực chiếm khoảng 40
% phân tử collagen. [8], [9], [11], [27], [28].

5