Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm phytophthora SP gây bệnh trên cây có múi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNG

SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG VI SINH
VẬT CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM
PHYTOPHTHORA SP. GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÓ MÚI

Ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

8420201

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Phạm Hồng Hiển
TS. Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kì học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn,
các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Diệu Hương

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, em đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn
bè và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép em được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS. Phạm Hồng Hiển và TS. Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn,
dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam đã
tận tình giúp đỡ em trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phòng thí nghiệm. Bộ mơn
Cơng nghệ Vi sinh, tồn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang thực tập và nghiên cứu
tại phịng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời
gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vơ hạn, em xin gửi lời cảm
ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên và luôn tạo
động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2019
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Diệu Hương

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ............................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn ............................................................................................................ x
Thesis abstract................................................................................................................. xii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Mục đích nghiên cứu của đề tài .......................................................................... 2

1.2.

Yêu cầu của đề tài ............................................................................................... 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Tổng quan tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ......................................... 3

2.1.1.

Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới ..................................... 3

2.1.2.

Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam ...................................... 4

2.2.

Sâu bệnh hại trên cây có múi .............................................................................. 4

2.3.

Giới thiệu nấm Phytophthora gây bệnh trên cây có múi .................................... 6

2.3.1.

Nấm Phytophthora .............................................................................................. 7

2.3.2.

Cơ chế gây bệnh ............................................................................................... 11

2.3.3.

Biện pháp phòng trừ ......................................................................................... 12

2.3.4.

Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật .................................... 13

2.4.

Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài trong và ngoài nước ........... 15

2.4.1.

Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài ở ngồi nước ................................ 15

2.4.2.

Tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong nước .......................... 17

Phần 3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.......................................................... 19
3.1.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 19

3.2.

Vật liệu ............................................................................................................. 19

3.3.

Môi trường nghiên cứu ..................................................................................... 19

3.4.

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng .............................................................. 20

3.4.1.

Dụng cụ............................................................................................................. 20

iii


3.4.2.

Thiết bị .............................................................................................................. 20

3.4.3.

Hoá chất ............................................................................................................ 20

3.5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20

3.5.1.

Giữ giống vi sinh vật ........................................................................................ 20

3.5.2.

Phương pháp phân lập mẫu nấm bệnh .............................................................. 20

3.5.3.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng nấm .......................... 22

3.5.4.

Phương pháp tái lây nhiễm ............................................................................... 23

3.5.5.

Đánh giá dặc điểm sinh học .............................................................................. 23

3.5.6.

Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh của các chủng
vi sinh vật.......................................................................................................... 24

3.5.7.

Khảo sát một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng vi sinh vật............ 25

3.5.8.

Định danh chủng nấm bệnh, xạ khuẩn, vi khuẩn.............................................. 27

Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 31
4.1.

Phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây có múi ........ 31

4.1.1.

Phân lập ............................................................................................................ 31

4.1.2.

Lây nhiễm nhân tạo .......................................................................................... 33

4.1.3.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 34

4.1.4.

Một số đặc điểm sinh học của chủng HDB và DB5 ......................................... 35

4.1.5.

Định danh chủng nấm DB5 .............................................................................. 37

4.2.

Sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi
sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây
có múi ............................................................................................................... 39

4.2.1.

Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng ............................... 39

4.2.2.

Một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn 38 ............................. 40

4.2.3.

Định danh chủng xạ khuẩn 38 .......................................................................... 43

4.2.4.

Một số đặc điểm sinh học và phân loại hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2 ........... 45

4.2.5.

Định danh 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2 ...................................................... 48

4.4.

Thảo luận .......................................................................................................... 50

4.4.1.

Kết quả phân lập và xác định chủng nấm Phytophthora sp gây bệnh trên cây ..... 51

4.4.2.

Kết quả sàng lọc và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số
chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây bệnh
trên cây có múi ................................................................................................. 52

iv


Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 54
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 54

5.2.

Kiến nghị .......................................................................................................... 54

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 55
Phụ lục .......................................................................................................................... 58

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

µl

Microliter

µM

Micromol

CMC

Carboxylmethyl cellulose

CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

ĐC

Đối chứng

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetracetic Acid

EtBr

Ethidium bromide

FAO

Food and Agriculture Organization of
the United Nations

FCOJ

Frozen Concentrate Orange Juice

LB

Luria Bertani

ml

Mililiter

mm

Milimeter

nm

Nanometer

NN&PTNT

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

PCR

Polymerase Chain Reaction

PDA

Potato D-glucose agar

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

RNA ribosome

sp

Species

TAE

Tris-Acetic-EDTA

WA

Water agar

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Một số đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập được ....................... 32

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Một số bệnh điển hình trên cây có múi do nấm Phytophthora gây ra .......... 7
Hình 2.2. Hình thái nấm Phytophthora .......................................................................... 8
Hình 2.3. Chu kì sống của Phytophthora ....................................................................... 9

Hình 4.1. Một số dấu hiệu bệnh ở những cây thu mẫu (A) rễ; (B) (C) (D) thân;
(E) (F) (G) lá; (H) quả. ................................................................................. 31
Hình 4.2. Phân lập bằng phương pháp bẫy bằng cánh hoa hồng. ................................ 31
Hình 4.3. Tái lây nhiễm trên quả chanh sau 1 tuần...................................................... 34
Hình 4.4. Đặc điểm hình thái của 2 chủng nấm HDB và DB5 quan sát qua kính
hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần ................................................. 34
Hình 4.5. Khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm HDB và DB5 .............. 36
Hình 4.6. Ảnh hưởng của mơi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của 2 chủng
nấm HDB và DB5 sau 2 ngày ni .............................................................. 37
Hình 4.7. Cây phân loại của chủng DB5 được xây dựng

bằng phần mềm

MEGA7 ........................................................................................................ 38
Hình 4.8. Hoạt tính đối kháng của một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn với 2 chủng
nấm bệnh HDB và DB5 trên môi trường PGA sau 3 ngày ni cấy ............... 39
Hình 4.9. Quan sát hình thái chủng xạ khuẩn 38 ......................................................... 40
Hình 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng, phát triển của chủng
xạ khuẩn 38 sau 4 ngày ni cấy ................................................................. 41
Hình 4.11. Khả năng sinh sắc tố Melanin của chủng xạ khuẩn 38 trên môi trường
ISP6 ở 37oC sau 5 ngày ni cấy ................................................................. 42
Hình 4.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn
38 trên mơi trường Gause-I sau 5 ngày ni cấy ......................................... 43
Hình 4.13. Cây phân loại của chủng 38 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 ...... 44
Hình 4.14. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn VK1 và VK2 trên môi
trường LB ở 30oC sau 2 ngày nuôi cấy ........................................................ 45
Hình 4.15. Khả năng di động của hai chủng vi khuẩn VK1 và VK2 nuôi cấy trên
môi trường LB ở 30°C sau 2 ngày ni ....................................................... 46
Hình 4.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi
khuẩn VK1 trên môi trường LB sau 2 ngày nuôi cấy .................................. 47

viii


Hình 4.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn
VK2 trên môi trường LB sau 2 ngày ni cấy ............................................. 47
Hình 4.18. Cây phân loại của chủng VK1 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 ....... 49
Hình 4.19. Cây phân loại của chủng VK2 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 ....... 50

ix


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Nguyễn Thị Diệu Hương
Tên luận văn: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng
nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi
Ngành: Cơng nghệ sinh học

Mã số: 8420201

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu: Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối
kháng nấm Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi.
Phương pháp nghiên cứu:
Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện invitro với đầy đủ thiết bị, máy
móc, hóa chất cần thiết.
Các mẫu thu thập được từ rễ, thân, lá và quả ở cây cam, chanh, bưởi với đặc
điểm: thối rễ, tàn lụi lá, thân xì mủ, thối quả. Mẫu thu tại các vùng Thái Bình, Hà Nội,
Phú Thọ, Yên Bái. Tiến hành phân lập nấm bệnh từ các mẫu đã thu thập. Các chủng
nấm phân lập được đem lây nhiễm nhân tạo để xác định một số chủng nấm gây bệnh

trên cây có múi. Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương pháp sinh học phân tử tiến
hành định danh chủng nấm gây bệnh.
Phương pháp hoạt hóa, ni cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và vi
khuẩn với nấm Phytophthora sp. gây bệnh bằng phương pháp đồng nuôi cấy. Nghiên
cứu ảnh hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi
cấy, nhiệt độ, khả năng chịu muối, khả năng sinh melanin. Phương pháp tách chiết DNA
và định danh chủng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng với các chủng nấm nghiên cứu.
Kết quả chính và kết luận:
1. Phân lập được 5 chủng nấm DB1, HDB, HQC, RB, DB5 trong đó hai
chủng nấm DB5, HDB có khả năng gây bệnh cây trên cây có múi. Cả 2 chủng nấm
nghiên cứu đều khơng có khả năng sinh enzyme cellulase, phát triển tốt ở mơi
trường giàu dinh dưỡng.
2. Chủng HDB có hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử hình
chùm, bào tử hình trịn. Chủng DB5 có hệ sợi phân nhánh, khơng có vách ngăn, chuỗi
bào tử hình chùm, bào tử hình quả chanh. Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương
pháp sinh học phân tử, đặt tên cho chủng DB5 là Phytophthora colocasiae DB5.
3. Tuyển chọn được 1 chủng xạ khuẩn số 38 và 2 chủng vi khuẩn VK1, VK2 đối
kháng với nấm HDB và DB5. Chủng 38 có khuẩn lạc hình trịn, tâm lồi. Màu trắng

x


xám. Sau 7 ngày nuôi cấy, màu sắc khuẩn lạc chuyển sang màu xám. Sau 24h đã xuất
hiện hệ sợi, hệ sợi phân nhánh, xuất hiện cuống sinh bào tử dạng xoắn. Sau 36h, cuống
sinh bào tử dần duỗi thẳng, xuất hiện bào tử. Chủng vi khuẩn VK1 có khuẩn lạc tròn,
nhỏ, mép trơn, bề mặt nhày là trực khuẩn Gram âm. Chủng vi khuẩn VK2 khuẩn lạc
tròn, nhỏ, mép trơn, bề mặt khô, trực khuẩn Gram dương.
4. Kết hợp các đặc điểm sinh học và phương pháp sinh học phân tử, đặt tên cho
chủng vi khuẩn VK1 là Pseudomonas aeruginosa VK1, chủng vi khuẩn VK2 là Bacillus
velezensis VK2, chủng xạ khuẩn 38 là Streptomyces mutabilis 38.

xi


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Nguyen Thi Dieu Huong
Thesis title: Screening and identification of microorganism strains resistant to pathogenic
Phytophthora sp. fungi on citrus.
Major: Biotechnology

Code: 8420201

Educational organnization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives: Screening and identification of microorganism strains resistant to
pathogenic Phytophthora sp. fungi on citrus.
Material and methods:
Experiments were carried out under in-vitro conditions with sufficient
equipment, machines, chemicals, and isolation rooms, from 4-9 2019.
The samples (18 samples) were collected from roots, stems, leaves and fruits of
orange, lemon, and grapefruit trees with the characteristics: root rot, leaf blight, pus-*stem, fruit rot. Conduct isolation of fungal pathogens from collected samples. Isolates of
fungal pathogens are artificially infected to identify some pathogenic fungi in citrus.
Combining biological characteristics and molecular biology methods to identify
pathogenic fungi.
Activation method, culture, testing the antagonistic ability of actinomycetes and
bacteria with pathogenic Phytophthora fungi by co-culture method. The study affects
the growth of actinomycetes, bacteria through factors: culture medium, temperature, salt
tolerance, melanin production. Methods of DNA extraction and identification of
bacteria strains, actinomycetes with antifungal strains studied.
Main findings and conclusions:
1. Isolation of 5 strains of fungi DB1, HDB, HQC, RB, DB5 in which two

strains of fungi DB5, HDB are capable of causing citrus diseases. Both fungal strains
are unable to produce cellulase enzyme, growing well in a nutrient-rich environment.
2. HDB strain has branched filament, no septum, spore-shaped spore chains,
round spores. Strain DB5 has a branched filament, no septum, spore-shaped spores, and
lemon-shaped colonies. Combining biological characteristics and molecular biology
methods, naming the DB5 strain is Phytophthora colocasiae DB5.
3. Selection of actinomycetes 38 and 2 strains bacteria VK1 and VK2 against
HDB and DB5 fungi. Strains 38 have round and convex colonies. Gray white. After 7
days of culture, the colony color becomes gray. After 24h, there appeared a fiber

xii


system, branched fiber system, and a spore-like stem cell appeared. After 36 hours, the
spore stem gradually stretched out, appearing a spore. VK1 strain has round, small,
smooth edges and the surface is gram-negative bacilli. Colony of VK2 bacteria are
round, small, smooth edges, dry surface, gram-positive bacilli.
4. Combining biological characteristics and molecular biology methods, naming
the VK1 strain is Pseudomonas aeruginosa VK1, the VK2 bacterial strain is Bacillus
velezensis VK2, the bacteriological strain 38 is Streptomyces mutabilis 38.

xiii


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Gần đây, diễn biến dịch bệnh trên cây có múi vẫn rất phức tạp mà ngun
nhân khơng phải là do bệnh mới. Trong những năm gần đây từ năm 2015, thế giới
sản xuất 1.938 triệu tấn nước cam (chuyển đổi sang FCOJ), tỉ lệ này ngày càng giảm
chủ yếu do dịch bệnh. Theo nghiên cứu dịch bệnh chủ yếu do nấm Phytophthora sp.
gây ra là một trong những yếu tố quan trọng và nguy hiểm bậc nhất làm giảm sút

sản lượng của cây có múi. Bệnh thường xuất hiện và tấn công ở các vườn trồng trên
nền đất thấp, kém thoát nước. Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở
xung quanh gốc hay ở chản hai, chản ba của cây, sau đó vỏ cây bị thối có màu nâu
hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ nhựa ra màu nâu đen và có mùi hơi.
Nhiều biện pháp đã được đưa ra để hạn chế bệnh dịch trên cây có múi
nhưng chỉ dừng lại ở phịng bệnh là chính. Tuy nhiên, trong những trường hợp
bệnh hại nặng có thể dùng một số loại thuốc phun để tăng cường sức đề kháng
cho cây và hạn chế bệnh lây lan như: Aliette, Ridomil, Phosacide... Do tác nhân
gây bệnh tồn tại chủ yếu trong đất, xâm nhiễm gây hại ở bộ phận rễ, cổ rễ thân
sát mặt đất nên hiệu quả của các loại thuốc này cịn thấp. Bên cạnh đó việc sử
dụng thuốc hóa học để phịng hay trừ bệnh khơng những khơng đạt kết quả như
mong đợi, chúng còn gây ra ảnh hưởng không tốt với sức khỏe con người, môi
trường và các sinh vật sống khác.
Do những tác động bất lợi kể trên của thuốc hóa học, việc sử dụng vi sinh
vật thay thế các loại thuốc hóa học được coi là sự thay thế bền vững để kiểm soát
sâu bệnh và mầm bệnh thực vật (Chandler et al., 2011). Kiểm soát sinh học bằng
cách sử dụng các vi sinh vật đã và đang trở thành mục tiêu quan trọng đối với
ngành cơng nghiệp sinh học trên con đường tìm kiếm và sản xuất các loại thuốc
mới, các hoạt chất kháng khuẩn mới, an tồn và thân thiện hơn.
Hơn nữa, tình hình biến động của chủng nấm cũng như bệnh dịch ngày
một gia tăng. Đặc biệt ở nước vùng nhiệt đới như ở Việt Nam thì bệnh dịch ngày
một lan rộng. Trước tình hình gây bệnh trên họ cam chanh của nấm
Phytophthora sp chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Sàng lọc và
định danh một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm Phytophthora
sp. gây bệnh trên cây có múi”.

1


1.1. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Sàng lọc và định danh một số chủng vi sinh vật đối kháng với nấm
Phytophthora sp. gây bệnh trên cây có múi.
1.2. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
Phân lập một số chủng nấm Phytophthora sp. có khả năng gây bệnh cây
trên cây có múi.
Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh học của chủng nấm đã phân
lập được.
Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với chủng nấm phân
lập được.
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối kháng với
nấm gây bệnh.
Định danh một số chủng nấm bệnh và một số chủng vi sinh vật đối kháng
với nấm gây bệnh trên cây có múi.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ QUẢ CĨ MÚI
2.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi trên thế giới
Sản xuất quả có múi trên thế giới vẫn tăng do giá trị kinh tế, giá trị dinh
dưỡng cao và do tăng trưởng thu nhập của các nền kinh tế mới nổi. Tổng sản
lượng quả có múi hàng năm trên thế giới dao động vào khoảng 123 - 131 triệu
tấn trong giai đoạn 5 năm từ 2011 đến 2016 (FAO, 2017), trong đó cam chiếm
trên 50% tổng sản lượng. Sản xuất quả có múi vẫn đang tiếp tục tăng do thu nhập
của người dân ở một số quốc gia tăng nhanh như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nga,
Ấn Độ, các nước Đơng Âu, các nước ASEAN...
Theo FAO, sản lượng quả có múi toàn cầu vào khoảng 131 triệu tấn năm
2015 và 124 triệu tấn năm 2016, bình quân đầu người khoảng 18kg năm 2016.
Tiêu thụ bình quân ở các nước phát triển Tây Âu và Bắc Mỹ đạt trên 40 kg/người

(Tổng cục Thống kê: Tình hình kinh tế - xã hội năm 2017; FAO, 2017). Trong đó
có Mexico là một cường quốc sản xuất và xuất khẩu quả có múi; nằm ở vĩ độ Bắc
10o - 24o, có vị trí địa lý, khí hậu thích hợp với việc trồng cây có múi. Sản lượng
quả có múi của Mexico năm 2016 là 6,634 triệu tấn; với dân số xấp xỉ 130 triệu
người. Bình qn sản lượng quả có múi vào khoảng 51,0 kg/người. Diện tích
trồng cam cả nước khơng thay đổi trong 10 năm (2000 - 2010), tổng diện tích là
342.000ha, sản xuất mỗi năm khoảng 4,1 triệu tấn cam; chỉ sau Brazil, Trung
Quốc, Ấn Độ và Mỹ. Niên vụ 2016/2017, Mexico sản xuất khoảng 4,3 triệu tấn
cam, năng suất trung bình tồn quốc khoảng 14,3 tấn/ha. Bên cạnh cây cam,
Mexico cịn đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu chanh. Theo Bộ Nông
nghiệp Mỹ, niên vụ 2016/2017, sản xuất chanh toàn cầu đạt 7,3 triệu tấn, riêng
Mexico đã chiếm 2,4 triệu tấn.
Ở Trung Quốc, diện tích và sản lượng quả có múi liên tục tăng trong
suốt 40 năm qua. Năm 2008, tổng sản lượng quả có múi ở Trung Quốc lục
địa là khoảng 21,7 triệu tấn, 5 năm sau (2013) sản lượng tăng lên 34,3 triệu
tấn; năm 2016 đạt khoảng 32,7 triệu tấn (trong đó chủ yếu là quýt). Bình
quân khoảng 23,7 kg/người với dân số 2016 vào khoảng 1,379 tỷ người
(FAO, 2017).

3


2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả có múi ở Việt Nam
Tình hình trồng các loại cây ăn quả đặc biệt là cây có múi trên thế giới nói
chung và ở Việt Nam nói riêng đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta nằm ở
trung tâm phát sinh cây ăn quả có múi, có vị trí địa lý thuận lợi, ở vùng thích hợp
cho phát sinh và phát triển của nhiều lồi quả có múi. Từ Quảng Nam trở vào là
diện tích vùng nóng đối với cây có múi. Bưởi, cam sành và chanh thường phát
triển tốt hơn ở vùng này do chịu được nhiệt. Khi nhiệt độ cao quanh năm, cây có
múi có thể ra hoa vài lần trong năm. Cây thuộc họ cam chanh là những cây mang

giá trị thương mại cao.
Theo Bộ NN-PTNT, diện tích cây ăn quả nước ta tăng mạnh đặc biệt là ở
các tỉnh phía bắc. Năm 2017 đã tăng 52000ha so với năm 2016, trong đó diện
tích cam tăng 10000ha, diện tích bưởi tăng 13000ha. Trong đó, phần lớn cam
chiếm diện tích trồng và sản lượng thu hoạch lớn. Theo Tổng cục thống kê, năm
2017 sản lượng cam đạt 772,6 nghìn tấn, tăng 20,4% so với năm trước; quýt đạt
175,5 nghìn tấn, tăng 6,3%; bưởi đạt 571,3 nghìn tấn, tăng 13,4%. Năm 2018, nhóm
cây ăn quả nói chung và cây ăn quả có múi nói riêng đạt sản lượng thu hoạch khá do
nhiều cây trồng tăng về diện tích và có thị trường tiêu thụ ổn định, tiếp tục tăng
mạnh. Sản lượng cam, quýt, bưởi đạt 1697,9 nghìn tấn tăng 10,9% so với năm trước.
Tuy nhiên, cùng với sự thâm canh hóa và gia tăng về diện tích trồng họ
cam chanh thì dịch bệnh đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến năng suất và sự
phát triển bền vững của nghề trồng.
2.2. Sâu bệnh hại trên cây có múi
Sâu đục cành
Đặc tính sâu bệnh hại: Đây là bệnh phổ biến nhất trên nhóm cây có múi.
Sâu đục cành có màu vàng dài khoảng 50mm. Chúng một khi xâm nhập được
vào cây sẽ khoét lỗ và làm tổ trong cành khiến cành bị úa vàng, sinh trưởng kém
rồi dần dần héo và chết. Sâu trưởng thành đẻ trứng rải rác khắp nách lá và trên vỏ
thân cây. Cứ thế khiến cây bị suy kiệt khơ héo mà chết.
Cách phịng và trị: tăng cường biện pháp đốn tỉa cây giúp cây được thơng
thống hơn. Để hạn chế việc xâm nhập của sâu, cần quét vôi lên trên thân cây.
Loại bỏ những cành bị sâu bệnh tấn công để chúng không lan rộng ra cả cây.
Ngồi ra nếu có q nhiều thì có thể phun xịt một số loại thuốc kháng sâu bệnh.

4


Sâu vẽ bùa
Đặc tính sâu bệnh: Loại sâu này đẻ trứng trên thân cây và khi sâu non nở

chúng sẽ tấn cơng lá ăn hết lớp biểu bì trên bề mặt lá và khiến lá quang hợp kém.
Cây từ đó mà phát triển kém hơn đồng thời làm cho cây cịi cọc chậm lớn. Loại
sâu vẽ bùa này được hình thành nhiều nhất sau các đợt mưa dài ngày.
Cách phòng và trị: Cần theo dõi chặt chẽ những đợt ra lộc của cây. Vì thời
điểm này sâu vẽ bùa phát triển khá mạnh sau đợt mưa hoặc khi tưới nước. Cần sử
dụng một số loại thuốc phun đều lên cây như Sumicidin 50EC 0,2%, Polytrin
50EC 0,2%. Chia làm 2 lần phun mỗi lần cách nhau khoảng 10 ngày. Nếu thấy
thuyên giảm thì ngừng phun.
Theo cẩm nang bệnh cây Texas các nhà khoa học cũng đã lập danh sách
các bệnh trên cây có múi.
Bệnh thối đen
Nguyên nhân: Bệnh do nấm Alternaria citri xảy ra trên trái cam.
Triệu chứng: Ban đầu xuất hiện những đốm nhỏ màu nâu, sau đó vết bệnh
phát triển rất nhanh và chuyển dần sang màu đen. Quả bị nhiễm bệnh sẽ đổi màu
và có thể rụng sớm.
Bệnh vàng lá gân xanh
Nguyên nhân: Do vi khuẩn
Triệu chứng: Bệnh xảy ra trên cây còn nhỏ gây ra triệu chứng đốm vàng,
loang lổ trên lá làm phiến là chuyển màu vàng chỉ còn gân lá màu xanh. Khi
bệnh nặng cây không phát triển, tán lá không đều, các lá mọc thẳng đứng, cứng.
Còn cây lớn bị mắc bệnh vàng lá trái nhỏ, méo mó, khi bổ dọc trái thấy tâm trái
bị lệch hẳn sang một bên và hạt bị hỏng có màu nâu.
Bệnh do nấm Phytophthora
Nguyên nhân: bệnh do nấm Phytophthora citrophthora, P. parasitica và
các loại Phytophthora sp khác.
Triệu chứng:
Thối nâu: Trái cây mọc gần mặt đất bị nhiễm bệnh đầu tiên và sau đó sẽ
lây đến những quả mọc cao hơn trên cây. Xuất hiện các vết đốm nâu nhỏ trên

5

quả, sau đó lan rộng thành một vùng. Quả bị nhiễm bệnh có mùi hăng, ơi. Nếu
nhiễm qua rễ cây, xâm nhập vào qua vỏ rễ, lan mạnh khắp cây. Cây bị nhiễm
bệnh làm giảm năng xuất và chất lượng quả.
Thối gốc chảy mủ: Với loại bệnh này rễ sẽ có biểu hiện như bị thối cả phần
lơng hút và phần vỏ rễ. Cây sẽ không hấp thụ được chất dinh dưỡng và nguồn nước
nên còi cọc kém phát triển dần dần nặng sẽ bị chết. Trên thân và cành cây cịn có
những vết nứt và kèm theo chảy nhựa. Càng về sau bệnh càng nặng và thân sẽ bị
thối. Với những cây non thì cây sẽ thường bị chết chỉ sau một tuần nhiễm bệnh. Trời
nóng ẩm mưa nhiều là điều kiện thuận lợi cho nấm này sinh sôi.
2.3. GIỚI THIỆU NẤM PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH TRÊN CÂY CÓ MÚI
Các lồi Phytophthora tấn cơng một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác
nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới - điển hình như bệnh mốc
sương mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những
năm 1840, nguyên nhân do nấm P. infestans (Bourke, 1964). Bệnh Phytophthora
đã được nghiên cứu sâu tại Châu Âu. Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt
đới ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng
ở những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái.
Nấm P. palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen
vỏ cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ;
sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu. Trên cây tiêu
dòng nấm Phytophthora gây hại được xác định là nấm Phytophthora capsici gây
hại chủ yếu trong mùa mưa, nhất là vào cuối mùa mưa khi có khí hậu ấm và ẩm.
Nấm Phytophthora sp. có thể tấn cơng riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các
nấm khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia.
Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế
giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch
hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi được tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì
P. palmivora, P. paracitica (P. nicotianae) và P. citrophthora là đặc trưng ở

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P. infestans, P. syringae và P. fragariae xuất
hiện phổ biến ở vùng ôn đới.

6


A

B

C
Hình
h 2.1. Một số bệnh điển hình trên cây cóó múi do
nấm Phytophthora gây ra
(Nguồn: Internet)
Chú
ú thích:
thíc
A: Bệnh
nh thối rễ trên bưởi
B: Bệnh
nh thối nhũn trên quả chanh và cam
C: Bệnh
nh đốm lá do nấm Phytophthora palmivora gây ra

2.3.1. Nấm Phytophtho
phthora
a. Vị trí phân loại, phân bố
Vị trí phân loại
Giới (Regnum)

:

Chromalveolata

Ngành (phylum
ylum)

:

Heterokontophyta

Lớp (Class)

:

Oomycetes

7


Bộ (Order)

:

Pernoporales

Họ (Familia)

:

Pythiacea

Chi (genus)

:

Phytophthora

(Chi này được Heinrich
He
Anton de Bary mô tả đầu tiên năm 1875 )
Nấm Phytophtho
thora được xem là một tác nhân gây bệnh
nh nguy hiểm cho
cây do sức tàn pháá mãnh
mãn liệt của nó. Nó gây ra những căn bệnh
nh như: thối cổ rễ,
loét thân, tàn lụi lá, thối
th quả và đặc biệt nguy hiểm với bệnh
nh trên họ cam chanh.
Các loài Phytophthora
ora này đặc biệt phát triển ở những nướcc vùng nhiệt đới trong
đó có Việt Nam vào những
n
mùa mưa. Bệnh héo nhanh do nấm
n
Phytophthora
Capcasi tấn công trên cây tiêu thường xảy ra trong mùa mưa, khi có khí hậu
nóng và ẩm. Bệnh xảyy ra

r trên những vườn thốt nước kém, đấtt bị
b úng nước hồn
tồn là điều kiện cho nấm
n phát triển.

Hìn 2.2. Hình thái nấm Phytophthora
Hình
Nguồn: Internet

b. Chu kì sống của phytophthora
phyt
Khi Phytophthora
thora sp được ni cấy trong mơi trường
ng thích
thíc hợp, khuẩn ty
(Mycelium) của nóó phát triển rất nhanh. Dưới điều kiện ẩm ướtt chúng
chú tạo ra những
bào tử vơ tính hayy cịn được gọi là túi bào tử (Sporangia) hoặặc túi bào tử động
(Zoosporangia). Túi
úi bào tử này nảy mầm trong môi trường nướcc hoặc
h
khi nhiệt độ
mơi trường giảm. Chúng phóng thích ra những bào tử động (Zoosp
Zoospores) với hệ lông
roi không đều nhauu (Heterokont
(Het
flagella). Những bào tử động
ng sau khi được phóng

8

thích sẽ bơi lội hàng
ng giờ
gi liền và cuối cùng ngừng bơi lội để cuộnn tròn
t
hay kết kén.
Sau một thời gian chúng hình thành vách tế bào. Ở giai đoạn này, bào
b tử được gọi là
kén hay nang (Cyst).
t). Bào tử vách dày (Chlamydospore) ở dạng
ng hình cầu hay oval, là
một cấu trúc nghỉ vơ tính.
tính Cấu trúc hữu tính bao gồm túi giao tử đực
đ (Antheridium bộ phận sinh sản đực)
c) và
v túi noãn (Oogonium - bộ phận sinh
inh sản
s cái). Quá trình
giảm phân hình thành
ành nên
nê túi giao tử đực và túi noãn. Đây chỉ là giai
g đoạn đơn bội
trong vòng đời của Phyto
hytophthora. Giai đoạn lưỡng bội đóng vai trị
tr quyết định trong
suốt chu kì sống củaa chúng.
chú Các vòi thụ tinh từ túi giao tử đực sẽẽ thốt vị đưa nhân
của giao tử đực vào
ào nỗn.

nỗ Hợp tử sau khi được thụ tinh sẽ nảyy mầm
m
ở điều kiện
thích hợp tùy thuộcc vào sự kết hợp của trứng với một hay nhiềuu ống giao tử đực.
Giống Phytophthora bao gồm một số lồi nấm dị tản (Heterothallic
othallic) (có hai kiểu lai
A1và A2) chẳng hạnn như
nh Phytophthora infestans. Số cịn lạii là những lồi nấm
đồng tản (Homothallic)
allic) bao gồm cả Phytophthora porri.

Hình 2.3. Chu kì sống của Phytophthora
Nguồn: SI--AMMOUR (2002)

c. Đặc điểm hình thái
ái của
c Phytophthora
Ta có thể xác định
đ
một số lồi Phytophthora thơng qua m
một số đặc điểm
hình thái sau (A. Drenth và B. Sendall, 2004):
Hình thái túi bào tử (hình dạng, kích thước, chiều dài, chiều
ch
rộng,…), hệ
gai của túi, tính rụng
ng sớm
s
của chúng. Chiều dài của cuống
ng trên túi bào tử. Sự

tăng sinh của túi bào tử
ử. Nhánh của cuống túi bào tử mà trênn đó tú
túi bào tử sinh ra.
Một số loài Phytophtho
phthora tạo ra bào tử ngay trên mơi trường
ng agar, trong khi
nhiều lồi khác cầnn được
đư ni cấy trong nước, dung dịch muốối khống và dịch

9


trích từ đất pha lỗng trước khi chúng tạo ra bào tử. Điều quan trọng hơn là sự
tạo ra bào tử trên Phytophthora phụ thuộc vào điều kiện ánh sáng.
Chlamydospore và sự trương phồng sợi nấm: Chlamydospore là một bào
tử vách dày có chức năng như một bào tử nghỉ. Chúng có thể chỉ là một đốt (nằm
giữa sợi nấm) hoặc ở tận cùng (nằm ở cuối sợi nấm). Hình thái của
chlamydospore khơng khác biệt nhiều giữa các lồi. Tuy nhiên sự hiện diện (trên
Phytophthora palmivora) hay sự vắng mặt (trên Phytophthora hevae) của
chlamydospore có thể xác định ở mức độ lồi.
Cấu trúc sinh sản hữu tính: Khoảng một nửa các loài Phytophthora ở dạng
đồng tản (homothallic) chúng sẽ sản xuất bộ phận sinh sản đực, bộ phận sinh sản
cái và bào tử động trên cùng một môi trường. Phần còn lại là dạng dị tản
(heterothallic) với hai kiểu lai A1 và A2. Dạng dị tản tạo ra túi giao tử (túi giao
tử đực và túi nỗn) chỉ khi có sự hiện diện của một dòng 7 phân lập mọc đối trên
cùng mơi trường. Việc xác định lồi nấm thuộc nhóm đồng tản hay dị tản phụ
thuộc vào túi bào tử đực của chúng là amphigynuos (túi giao tử đực nằm quanh
thân túi noãn) hay paragynuos (túi giao tử đực nằm tiếp theo túi nỗn).
Ngồi ra sinh sản vơ tính (Textbook of Fungi do Sharma 1998 biên soạn)
Hệ khuẩn ty bên trong thơng thường đi ra ngồi qua khí khổng ở dạng

chùm; cọng mang túi bào tử (sporangiophore) cũng có thể đi ra ngồi bằng cách
chọc thủng lớp biểu bì lá, củ, thân hay chổ có thương tích và cọng bào tử trong
suốt, phân nhánh tự do và không giới hạn, sự sinh sản tùy thuộc vào độ ẩm cao
hay thấp, túi bào tử (sporangium) phát triển ở đầu chóp của mỗi nhánh thể mang
bọc bào tử, bọc bào tử có vách dày, trong suốt, đa nhân có hình hạt đậu hay quả
lê và chứa nhủ (papilla) ở giai đoạn cuối, nhủ là lớp tế bào nối liền túi bào tử với
cọng bào tử và khi mưa hay gió lớn thì lớp nhủ này phân tán để cho túi bào tử
phát tán theo gió vào khơng khí…nếu khơng gặp ký chủ thì chúng sẽ chết sau vài
giờ tồn tại trong khơng khí.
Sự nảy chồi của túi bào tử hay bọc bào tử bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và độ
ẩm; túi bào tử cho thấy sự mọc mầm gián tiếp ở nhiệt độ thấp và điều kiện ẩm ướt
do những bào tử động tạo ra đầu tiên, chúng được phóng thích nhanh và nhiễm vào
vật chủ. Nhưng ở nhiệt độ cao và điều kiện khô ráo, bọc bào tử cho thấy sự mọc
mầm trực tiếp ớ điều kiện này, bọc bào tử bắt đầu hoạt động như bào tử riêng lẻ và
nảy chồi nhanh bằng cách tạo ra ống phôi thâm nhập vào vật chủ.

10


d. Đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora
Đặc điểm chung: Phytophthora (Gr. Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại),
được đặt tên bởi Bary (1876). Nấm Phytophthora là loại nấm khá phổ biến của
lớp Oomycetes thuộc họ Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm khơng màu, khơng
vách ngăn, đơn bào, kích thước khơng đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả
chanh, trên đầu có nuốm hoặc khơng có nuốm, khơng màu, trong suốt. Bào tử
hình cầu hoặc hình thận có hai lơng roi, di chuyển rất nhanh trong nước. Nấm
Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các
bào tử có vách dày gọi là nỗn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng
năm trong đất.
Theo tài liệu của Bary (1876), Phytophthora có các khoảng chịu đựng

cũng như các khoảng tối ưu cho sự sinh trưởng như sau:
Nhiệt độ tối ưu: 25-30 oC.
pH tối ưu: 6-7.
2.3.2. Cơ chế gây bệnh
Các lồi Phytophthora tấn cơng một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác
nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới. Bệnh Phytophthora đã
được nghiên cứu sâu tại Châu Âu. Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới
ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở
những vùng này; như bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái.
Nấm Phytophthora sp. có thể tấn cơng riêng lẻ nhưng đa số có sự kết hợp với các
nấm khác như Fusarium, Pythium và Rhizoctonia.
Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế
giới và có hơn 1000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch
hại (Gregory, 1983). Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp. tấn công trên cây
tiêu thường xảy ra trong mùa mưa, khi có khí hậu nóng và ẩm. Bệnh xảy ra trên
những vườn thoát nước kém, đất bị úng nước hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát
triển. Nấm Phytophthora sống trong đất dưới hình thức các sợi nấm (mycelium)
hoặc các bào tử có vách dày gọi là nỗn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại
hàng năm trong đất. Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm
(mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa
các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores). Các động bào tử chỉ phóng
thích ra ngồi bào tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nước hoàn toàn. Khi ra

11