Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ôn ở một số giống lúa bản địa của việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

PHƯƠNG HỮU PHA

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC
ĐỊNH CÁC GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG
ĐẠO ƠN
Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. Trần Đăng Khánh
PGS. TS. Đồng Huy Giới


NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

2


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn
của PGS. TS. Trần Đăng Khánh và PGS. TS. Đồng Huy Giới. Các kết quả nghiên cứu

được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019
Tác giả luận văn

Phương Hữu Pha

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trần Đăng Khánh và PGS. TS. Đồng Huy Giới đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt q trình
học tập và thực hiện luận văn.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di
truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, đặc biệt cảm ơn NCS Nguyễn Trường Khoa đã giúp
đỡ, cùng phân tích và cho phép sử dụng một số vật liệu, số liệu sử dụng trong luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt để tôi hoàn thành luận văn./.
Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2019
Tác giả luận văn

Phương Hữu Pha

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ................................................................................................................ I
Lời cảm ơn ................................................................................................................... II
Mục lục ......................................................................................................................III
Danh mục chữ viết tắt................................................................................................... V
Danh mục bảng .......................................................................................................... VI
Danh mục hình .......................................................................................................... VII
Trích yếu luận văn .................................................................................................... VIII
Thesis abstract .............................................................................................................. X
Phần 1. Mở đầu ...........................................................................................................1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................1

1.2.

Mục tiêu của đề tài...........................................................................................2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................2

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ..........................................................................3

Phần 2. Tổng quan tài liệu .........................................................................................4
2.1.

Giới thiệu về cây lúa ........................................................................................4

2.1.1.

Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới ...........................................................4

2.1.2.

Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam ...........................................................5

2.2.

Tình hình thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ......................................................6

2.2.1.

Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới. .................................................6

2.2.2.

Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ơn ở Việt Nam. .................................................7

2.3.

Tình hình nghiên cứu hệ gen của lúa ................................................................8

2.4.

Tình hình nghiên cứu các gen kháng đạo ôn trên cây lúa ................................10

2.5.

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới và ứng dụng tin sinh học ..........................11

2.5.1.

Hệ thống giải trình tự gen Illumina ................................................................13

2.5.2.

Ứng dụng tin sinh học trong phân tích kết quả giải trình tự gen ......................13

2.6.

Chỉ thị phân tử SNP .......................................................................................15

2.7.

Chỉ thị ADN trong xác định gen liên quan đến kháng đạo ôn .........................16

2.7.1.

Chỉ thị ADN ..................................................................................................16

2.7.2.

Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử ..............................................................17

2.8.

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn ...................19

iii


Phần 3. Vật liệu và phương pháp .............................................................................20
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................20

3.2.

Vật liệu nghiên cứu........................................................................................20

3.2.1.

Nguồn vật liệu ...............................................................................................20

3.2.2.

Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .....................................................................20

3.3.

Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................22

3.3.1.

Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome....................22

3.3.2.

Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21 ........27

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................32
4.1.

Kết quả tầm soát gen Pit kháng đạo ơn dựa trên dữ liệu trình tự genome của
các giống lúa bản địa đã được giải mã ............................................................32

4.2.

Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pit có khả năng kháng đạo ơn................36

4.3.

Kết quả tầm sốt gen Pi21 kháng đạo ơn dựa trên dữ liệu trình tự genome của
các giống lúa bản địa đã được giải mã ............................................................42

4.4.

Kết quả thiết kế chỉ thị xác định gen Pi21 có khả năng kháng đạo ơn .............46

Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................53
5.1.

Kết luận ........................................................................................................53

5.2.

Kiến nghị ......................................................................................................53

Danh mục các cơng trình, cơng bố ...............................................................................54
Tài liệu tham khảo .......................................................................................................55

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

aa

Amino acid

Axit amin

ADN

Axit Deoxyribonucleic

Vật liệu di truyền

AFLP
Bp

Amplified Fragment Length
Polymorphism
Base pair

Đa hình chiều dài các đoạn
được nhân bản chọn lọc
Cặp bazơ nitơ

cs

Cộng sự

Cộng sự

CDS

Coding ADN Sequence

Vùng mã hóa gen

CSDL

Cơ sở dữ liệu

Cơ sở dữ liệu

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

GATK

Genome Analysis Tool Kit

Đơn phân của ADN đã
đươ ̣c triphosphoryl hóa
Bộ cơng cụ phân tích hệ gen

MABC

Marker Assisted Backcrossing

MAS

Marker Assisted Selection

NGS

Next generation sequencing

nu

Nucleotide

Cơng nghệ giải trình tự thế

hệ mới
Đơn phân của RNA, AND

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs

Quantitative Trait Loci - Locus

RAPD

Random Amplification of
Polymorphic ADN
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Single Nucleotide Polymorphisms
Simple Sequence Length
Polymorphism
Simple Sequence Repeat

Kiểm soát tính trạng số
lượng
Đa hình ADN được nhân
bản ngẫu nhiên
Đa hình chiều dài mảnh
phân cắt giới hạn

Đa hình nucleotide đơn
Đa hình các đoạn lặp đơn
giản
Sự lặp lại của trình tự đơn
giản

RFLP
SNP
SSLP
SSR

v

Chọn lọc nhờ chỉ thị phân
tử kết hợp lai trở lại
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Diện tích trồng và sản lượng lúa ở Việt Nam từ năm 2007 - 2017.
(Tổng cục thống kê, 2018) ........................................................................... 5
Bảng 3.1. Bảng vật liệu nghiên cứu ........................................................................... 20
Bảng 4.1. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pit ở các giống
lúa đã giải trình tự ..................................................................................... 33
Bảng 4.2. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pit ở các
giống lúa đã giải trình tự ........................................................................... 37
Bảng 4.3. Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen Pi21 ở các
giống lúa đã giải trình tự ........................................................................... 44
Bảng 4.4. Bảng thống kê số lượng amino acid của các gen ứng viên Pi21 ở các
giống lúa đã giải trình tự ........................................................................... 47

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Mơ hình SNP(ww.nutrigeneticsspecialists.com/singlepost
/2017/03/27/What-is-a-SNP) .................................................................. 16
Hình 3.1. Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải
trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 và MEGA 6.0 .................. 26
Hình 3.2. Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11.0 ..................... 29
Hình 3.3. Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm MEGA
6.0 và BLAST ....................................................................................... 31
Hình 4.1. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo
ôn Pit của một số giống lúa bản địa ........................................................ 34
Hình 4.2. Vị trí 3 nucleotide bị thiếu ảnh hưởng làm mất 2 amino acid sau khi
dịch mã ................................................................................................. 35
Hình 4.3. Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17
nucleotide thông qua phần mềm Vetor NTI 11.0 ..................................... 39
Hình 4.4. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pit trên 17 giống lúa ............................. 40
Hình 4.5. Kết quả BLAST với mồi PitF: TCTT AACGACTGCCC AA AACT....... 41
Hình 4.6. Kết

quả

BLAST

với

mồi

PitR:

AGATTACAGAGATTGG

AAATTCTC ......................................................................................... 41
Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pit nhận biết gen Pit ở
các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1) ........... 42
Hình 4.8.

Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng đạo ôn Pi21
của một số giống lúa bản địa .................................................................. 46

Hình 4.9. Ảnh thiết kế mồi nhân đoạn ADN có chứa vùng chèn thêm 17
nucleotide thơng qua phần mềm Vetor NTI 11.0 ..................................... 49
Hình 4.10. Kiểm tra sự bắt cặp của cặp mồi Pi21 ở vùng CDS trên 17 giống lúa ...... 50
Hình 4.11. Kết quả BLAST với mồi Pi21F: GACCCGGAGAAGCTGTGCAA
GA ........................................................................................................ 51
Hình 4.12. Kết quả BLAST với mồi Pi21R: CTTTGGGCAGCACCACTGCC ......... 51
Hình 4.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR đối với cặp mồi Pi21 nhận biết gen Pi21
ở các giống lúa bản địa của Việt Nam (thứ tự các mẫu theo bảng 1) ........ 52

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Phương Hữu Pha
Tên Luận văn: Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến
tính kháng đạo ơn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam.
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
- Tầm soát các gen Pit, Pi21 liên quan đến tính kháng đạo ơn ở một số giống lúa
bản địa của Việt Nam đã giải trình tự.
- Thiết kế được các chỉ thị ADN đặc trưng cho từng gen Pit, Pi21 kháng đạo ôn
phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tầm sốt gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome:
- Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 (SoftGenetics LLC,
State College, PA, USA) (Biswas et al., 2015) . /NextGENe.php và
phần mềm phân tích di truyền tiến hóa phân tử MEGA 6.0 cho hệ điều hành Windows để
dóng hàng và cột cho 17 giống lúa ( (Tamura et
al., 2013, Huu Trung Khuat và cs., 2017).
Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit, Pi21:
- Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được công
bố vào ngày 15/12/2008 - đây là phần mềm của hãng Invirogen, Carlsbad (Jia et al., 2002).
- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương
pháp CTAB của (Obara et al., 1998) có cải tiến.
- Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler. Tổng
thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: 5 µl ADN (nồng độ 10ng); 0,15 µM mồi; 0,2 mM
dNTPs; 1X Buffer PCR; 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose
và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.
Kết quả chính và kết luận
Tất cả 17 giống lúa bản địa nghiên cứu đều mang trình tự tương đồng với cả gen
Pit và Pi21.
Đối với gen Pit đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 3
nucleotide và 8 đoạn trình tự tương đồng có độ dài ít hơn 20 nucleotide (bao gồm 3
nucleotide bên trên và đoạn mất 17 nucleotide)

viii


Đối với gen Pi21 đã thu nhận được 9 đoạn trình tự tương đồng có độ dài bằng và
tám đoạn trình tự tương đồng của các giống cịn lại có độ dài ít hơn 24 nucleotide.
Đã thiết kế được trình tự mồi đặc hiệu với gen Pit (PitF: TCTTAACGAC
TGCCCAAAACT/ PitR: AGATTACAGAGATTGGAAATTCTC) và Pi21 (Pi21F:
GACCCGGAGAAGCTGTGCAAGA/Pi21R: CTTTGGGCAGCACC ACTGCC), cặp
mồi này đã được chứng minh là có khả năng nhân lên đoạn gen từ ADN của các giống
lúa bản địa của Việt Nam.

ix


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Phuong Huu Pha
Thesis title: Design and application of DNA markers to identify genes related to rice
blast resistant ability in some Vietnamese native rice varieties.
Major: Biotechnology

Code: 60 42 02 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture
Research Objectives:
- Screening of Pit genes, Pi21 related to rice blast resistance in some Vietnamese
native rice varieties sequenced.
- Designing DNA indicators for each Pit, Pi21 gene typical for rice blast
resistance in researching and selecting of rice blast resistance.
Materials and Methods:
Genetic screening method Pit and Pi21 based on genome sequencing:

- Assemble and name SNP by using software NextGENe_V2.4.2.3 (SoftGenetics
LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al., 2015).
/NextGENe.php and the genetic analysis software MEGA 6.0 for Windows operating
system to align rows and columns for 17 rice varieties ( />.php) (Tamura et al., 2013, Huu Trung Khuat et al., 2017).
Method of designing primers for gene Pit and Pi21 to test resistance gene Pit, Pi21:
- The specific primers designed by Vector NTI Advance software 11.0 was published
on December 15, 2008 - this is the software of Invirogen, Carlsbad (Jia et al., 2002).
- Rice leaf samples (3 weeks) were collected and total DNA extracted by CTAB
method (Obara et al., 1998) with improvement.
- PCR reaction was conducted on Veriti 96 well Thermal cycler. The total reaction
volume is 15 µl, including: 5 µl of DNA (concentration 10ng); 0.15 µM primers; 0.2
mM dNTPs; 1X Buffer PCR; 2.5 mM MgCl2 and 0.25 Taq polymerase units.
- PCR products were analyzed by electrophoresis method on polyacrylamide gel
6.0% or on agarose gel and were detected under ultraviolet light by ethidium bromide
staining method.
Main findings and conclusions:
All 17 Vietnamese native rice varieties sequenced had homologous sequences
with both Pit and Pi21 genes

x


With Pit gene, nine homologous sequences with less than 3 nucleotides were
recorded and 8 homologous sequences with less than 20 nucleotide lengths.
With Pi21 gene, nine homologous sequences of equal length and eight
homologous sequences of the remaining varieties have been obtained that are less than
24 nucleotides lengths.
Having designed a specific primer sequence with the Pit (PitF:
TCTTAACGACTGCCCAAAACT/ PitR: AGATTACAGAGATTGGAAATT CTC)
and

Pi21
(Pi21F:
GACCCGGAGAAGCTGTGCAAGA/Pi21R:
CTTTG
GGCAGCACCACTGCC) genes, this primer has been shown to be able to replicate
gene segments from DNA of Vietnam's native rice varieties.

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lúa gạo (Oryza sativa L.) là một trong những loại lương thực chính của
Việt Nam và nhiều nước trên thế giới và đóng vai trị rất quan trọng trong nền
sản xuất nông nghiệp. Hiện nay, mức tiêu thụ lúa gạo đang tăng và nhu cầu về
chất lượng gạo cũng tăng dần theo chất lượng cuộc sống. Các nghiên cứu đã chỉ
ra rằng để đáp ứng nhu cầu gia tăng về lúa gạo thì sản lượng lúa gạo của tồn thế
giới phải tăng thêm 40% vào năm 2030. Đây là một thách thức lớn đối với các
nhà chọn giống để phát triển các giống lúa có năng suất cao, phẩm chất tốt và
chống chịu sâu bệnh cũng như điều kiện bất thuận khác của môi trường (Selvaraj
et al., 2011). Mặc dù năng suất tiềm năng của cây lúa là 10 tấn/ha nhưng thực tế
người nơng dân chỉ thu được trung bình 5 tấn/ha. Sự khác biệt về năng suất này
là do các tác nhân bất lợi sinh học và phi sinh học, đặc biệt sâu, bệnh gây hại ở
lúa. Trong các tác nhân gây bệnh trên lúa thì bệnh đạo ơn ở lúa gây ra bởi nấm
Magnaporthe oryzae là những bệnh phổ biến nguy hại nhất đối với lúa. Khi lúa
bị nhiễm đạo ôn cổ bông dẫn đến năng suất giảm nghiêm trọng, đe dọa an ninh
lương thực toàn cầu (Liu et al., 2014). Sử dụng các giống kháng bệnh đạo ôn là
một trong những biện pháp hiệu quả và kinh tế nhất để kiểm sốt bệnh đạo ơn ở
lúa. Cho đến nay các nhà khoa học đã tìm ra 102 gen kháng đạo ôn (Su et al.,
2015; Zheng et al., 2016). Trong đó có 27 gen đã được nhân dịng là Pib, Pb1,

Pita, Pi9, Pi2, Pizt, Pid2, Pi33, Pii, Pi36, Pi37, Pikm, Pit, Pi5, Pid3, Pid3-A4,
Pi54, Pish, Pik, Pikp, Pia, PiCO39, Pi25, Pi1, Pi21, P50 và Pi65 (t). Do sự biến
đổi thường xuyên trong quần thể nấm Magnaporthe oryzae, nên tính kháng bền
của các giống lúa với gen kháng có thể bị mất đi nhanh chóng, đặc biệt khi giống
lúa được trồng ở vùng sinh thái khác. Do đó, để có được một giống kháng bền và
phổ rộng thì việc tích hợp nhiều gen kháng vào một giống lúa là một chiến lược
nhân giống quan trọng và có thể được thực hiện để kiểm sốt bệnh đạo ơn ở lúa
(Fukuoka et al., 2012; Xiao et al., 2017).
Việc phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử có vai trị quan trọng trong
lai tạo và chọn giống ở thực vật, đặc biệt là việc phát hiện và phân tích các
QTLs/gen (quantitative trait loci) và vị trí của chúng trên bản đồ liên kết; nhân
dịng các gen cho những tính trạng nhất định dựa trên bản đồ liên kết phân tử;
quy tụ gen; việc chọn lọc dựa trên chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection

1


(MAS)); việc xác định và phân tích đa dạng di truyền và phân tích cấu trúc hệ
gen. Khi được ứng dụng trong chương trình lai tạo và chọn giống, các chỉ thị
phân tử cho phép đẩy nhanh q trình tích hợp các gen mà chi phối tính đa hình
của tính trạng và cung cấp thông tin đáng tin cậy về quan hệ họ hàng và quan hệ
phát sinh chủng loại giữa các loài. Việc áp dụng rộng rãi các chỉ thị trong lai tạo
giống cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ cho thấy ngày
càng có nhiều chỉ thị phân tử được phát triển để phục vụ cho công tác chọn tạo
giống. Rất nhiều loại chỉ thị đã được phát triển như: RFLP, RAPD, AFLP, SSR,
SSLP, SNP. Những chỉ thị này rất khác nhau về độ phân giải, độ bao phủ hệ gen
và mức độ liên kết với tính trạng quan tâm. Mặt khác, nhà chọn giống cũng quan
tâm đến những đặc điểm như: mức độ đơn giản của việc thiết kế các thí nghiệm,
các yêu cầu về kỹ năng đặc biệt sử dụng trong lai tạo (Ranade and Yadav, 2014).
Trong những năm gần đây, với sự gia tăng về dữ liệu trình tự hệ gen, các đa hình

đơn nucleotit (SNP) và sự đa dạng trong cấu trúc hệ gen đã được dùng để phát
triển những chỉ thị có độ tin cậy cao. Sự phát triển của những chỉ thị với mật độ
dày đặc cũng như việc xác định trình tự nucleotit của cả hệ gen của nhiều cây có
quan hệ họ hàng gần gũi cho phép so sánh những chỉ thị, so sánh hệ gen, và sự
phân bố của những chỉ thị này trong khắp hệ gen (Ranade and Yadav, 2014).
Tiếp cận theo định hướng nghiên cứu mới này, việc Thiết kế và ứng dụng các
chỉ thị ADN xác định các gen liên quan đến tính kháng đạo ơn ở một số giống
lúa bản địa của Việt Nam là rất cần thiết. Kết quả thu được sẽ là cơ sở để tham
khảo và tiến hành các nghiên cứu tiếp theo nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo
giống lúa kháng đạo ôn.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Tầm soát các gen Pit, Pi21 liên quan đến tính kháng đạo ơn ở một số
giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải trình tự.
Thiết kế được các chỉ thị ADN đặc trưng cho từng gen Pit, Pi21 kháng đạo ôn
phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa kháng đạo ôn.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đề tài chỉ tập trung vào các nội dung tầm soát và thiết kế chỉ thị ADN
nhận dạng các gen Pit, Pi21 tính kháng đạo ơn ở 17 giống lúa của Việt Nam đã
được giải trình tự. Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền của Viện
Di truyền Nông nghiệp từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019.

2


1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Kết quả đề tài sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu
khoa học về tính kháng đạo ôn, đồng thời góp phần vào công tác nghiên cứu
chọn tạo giống lúa có khả năng kháng đạo ơn phù hợp với điều kiện canh tác lúa
ở Việt Nam.
Những thành công bước đầu trong thiết kế các chỉ thị ADN xác định các gen

liên quan đến tính kháng đạo ơn sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong cơng tác
chọn tạo giống nói chung, khơng chỉ đối với khả năng kháng đạo ơn mà cịn đối với
nhiều khả năng kháng khác, đáp ứng nhu cầu lương thực của con người.

3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA
2.1.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới
Lúa gạo (Oryza sativa L.) là lương thực chính cho hơn 3,5 tỷ người tức là
khoảng một nửa dân số thế giới. Và ước tính, loại lương thực này cung cấp cho
con người tới 20% lượng calo hằng ngày. Nhu cầu lúa gạo tồn cầu ước tính tăng
từ 723 triệu tấn trong năm 2015 lên 763 triệu tấn vào năm 2020 và lên 852 triệu
tấn vào năm 2035, tăng tổng cộng 18% (129 triệu tấn) trong 20 năm tới.
Bên ngoài châu Á, lượng tiêu thụ lúa gạo tiếp tục tăng đều đặn, với sự tăng
trưởng nhanh nhất ở châu Phi cận Sahara. Trong hai thập kỷ qua, tiêu thụ lúa gạo
trên đầu người ở vùng cận Sahara châu Phi đã tăng hơn 50%. Tương tự, tiêu thụ
lúa gạo tiếp tục tăng trưởng đều đặn ở cả Hoa Kỳ và Liên minh châu Âu khi
người tiêu dùng đa dạng hóa từ protein sang chế độ ăn nhiều chất xơ và cũng vì
người nhập cư từ châu Á đang tăng lên. (Mohanty, 2013).
Việc tăng năng suất lúa gạo từ diện tích đất hiện tại vẫn là chiến lược chính
để tăng sản lượng. Do đó, việc cải thiện tiềm năng năng suất của lúa gạo là một
chiến lược chính để tăng sản lượng lúa gạo thế giới. Vì thế, một phương pháp
tồn diện bao gồm cả cải thiện hệ gen và cải thiện canh tác là quan trọng để tìm
ra tiềm năng năng suất của các giống lúa. Để sản xuất 129 triệu tấn lúa bổ sung
vào năm 2035, tiềm năng năng suất của lúa cần tăng từ 10 đến 12,3 tấn / ha trong
điều kiện tưới tiêu thuận lợi. Điều này có thể là không dễ dàng, nhưng lịch sử
nghiên cứu và nhân giống lúa đã cho thấy những triển vọng tươi sáng để chúng ta
đạt được những con số đó trong tương lai.

Sản lượng lúa thế giới tăng từ 256 triệu tấn năm 1960 lên 680 triệu tấn trong
năm 2010. Điều này đạt được nhờ tăng năng suất, chủ yếu thông qua việc áp dụng
các nguyên tắc di truyền học Mendel và nhân giống cây trồng thông thường. Việc
đạt được mục tiêu tăng thêm 129 triệu tấn trong 20 năm tới là một thách thức lớn
hơn. Nguyên nhân là bởi chúng ta phải đối phó với các mối đe dọa liên tục đối với
lúa gạo như bệnh bạc lá do vi khuẩn, bệnh đạo ôn, tungro và bệnh cháy lá; côn
trùng, chẳng hạn như rầy nâu, sâu đục thân và mật túi; và các căng thẳng phi sinh
học, chẳng hạn như hạn hán, nhiễm mặn, lạnh, nóng, vv, đặc biệt là trong bối cảnh
biến đổi khí hậu tồn cầu. Thách thức lớn hiện nay là làm thế nào để vượt qua những
hạn chế này và tăng năng suất lúa theo cách thân thiện với mơi trường, sử dụng ít
hóa chất hơn, ít nước hơn, ít đất hơn và ít lao động hơn (Khush, 2013).

4


2.1.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam
Tại Việt Nam, lúa gạo đóng vai trị quan trong bậc nhất đối với nền nông
nghiệp. Điều này thể hiện rõ ở việc lúa gạo góp phẩn ổn định an ninh lương thực,
tạo ra việc làm trong lĩnh vực nông nghiệp, là nguồn thu nhập của cư dân nơng
thơn và đóng góp đáng kể vào doanh thu xuất khẩu của nước ta. Theo Bộ Nông
nghiệp và Phát triển nông thôn, lúa gạo được trồng hai vụ một năm bởi 80% lao
động nông thôn. Sản lượng lúa gạo chiếm 90% trên tổng sản lượng ngũ cốc. Lúa
gạo không những là thực phẩm chính trong bữa ăn hàng ngày của Việt Nam mà
cịn là nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến như: bia, rượu, nước
ngọt, bánh, mì,... vv. Việt Nam là nước sản xuất lúa gạo lớn thứ năm trên thế giới
với sản lượng khoảng 42,8 triệu tấn vào năm 2017. Sản lượng lúa gạo cũng tăng
mặc dù diện tích lúa giảm, sản lượng quốc gia năm 2007 là 35,9 triệu tấn, nhưng
đến năm 2017 sản lượng đạt 42,8 triệu tấn. tấn (tăng 6,9 triệu tấn). Việc tăng sản
lượng lúa gạo như trên đã đảm bảo cả an ninh lương thực quốc gia và xuất khẩu
lúa gạo hàng năm (Tổng cục thống kê, 2018).

Bảng 2.1. Diện tích trồng và sản lượng lúa ở Việt Nam từ năm 2007 - 2017.
Năm

Diện tích (Nghìn ha)

Sản lượng (Nghìn tấn)

2007

7,21

35,94

2008

7,40

38,73

2009

7,44

38,95

2010

7,49

40,00

2011

7,66

42,40

2012

7,76

43,74

2013

7.90

44,04

2014

7,82

44,97

2015

7,83

45,10

2016

7,74

43,17

2017

7,71

42,76
Nguồn: Tổng cục thống kê (2018)

5


Theo tính tốn, năng suất lúa gạo bình qn cả nước là 5,55 tấn / ha
2017, năng suất bình quân năm 2007 là 4,99 tấn / ha (tăng 0,55 tấn / ha),
này có thể là do chuyển đổi diện tích trồng lúa kém hiệu quả và năng suất
cho các cây trồng khác và ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong sản

năm
điều
thấp
xuất

nông nghiệp ngày càng rộng rãi hơn (Thống kê, 2018).
Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn năm 2018, lúa gạo đã được
trồng 50% trên đất nông nghiệp, sử dụng gần 80% lao động nông thôn. Sản

lượng lúa gạo chiếm 90% sản lượng ngũ cốc hàng năm ở Việt Nam.
Việt Nam là nước xuất khẩu lúa gạo lớn thứ hai với lượng lúa gạo xuất
khẩu trung bình hàng năm là 4,5-5,5 triệu tấn / năm, thậm chí năm 2012 là 8,0
triệu tấn. Theo Tổng cục Thống kê năm 2018, kể từ năm 1995, Việt Nam xuất
khẩu gần 2 triệu tấn lúa gạo, đưa lúa gạo thành mặt hàng xuất khẩu đứng thứ ba
sau dầu thô và than; 5 năm sau (2000), xuất khẩu lúa gạo tăng lên 3,5 triệu tấn,
chiếm vị trí đầu tiên trong xuất khẩu và 10 năm sau (2010), xuất khẩu lúa gạo đạt
6,9 triệu tấn, đứng ở vị trí thứ ba sau than và dệt với xuất khẩu giá trị đạt hơn 2,6
tỷ USD. Từ năm 2007 đến năm 2017, xuất khẩu vẫn tăng ổn định, đưa lúa gạo
trở thành mặt hàng mang lại nguồn thu lớn nhất cho Việt Nam.
Theo số liệu thống kê của Hải quan Việt Nam, tháng 12 năm 2017, Việt
Nam xuất khẩu 351,44 nghìn tấn lúa gạo, thu về 164,46 triệu USD, nâng tổng
kim ngạch xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam cả năm về lượng là 5,79 triệu tấn ứng
với giá trị 2,62 tỷ USD, tăng 20,4% về lượng và 21,2% về giá trị so với cùng kỳ
năm 2016. Năm 2017, Trung Quốc là thị trường nhập khẩu lớn nhất mặt hàng lúa
gạo của Việt Nam, với kim ngạch nhập khẩu đạt 1,03 tỷ USD, tăng 31,35% so
với cùng kỳ năm 2015, chiếm 39,25% tổng kim ngạch xuất khẩu lúa gạo của Việt
Nam. Philippines là thị trường nhập khẩu lớn thứ hai, với kim ngạch tăng 33,2 %,
ứng với kim ngạch 222,58 triệu USD. Thị trường lớn thứ 3 về nhập khẩu lúa gạo
của nước ta là Malaysia, với kim ngạch 210,01 triệu USD, chiếm 8,03% thị phần
(Thống kê, 2018).
2.2. TÌNH HÌNH THIỆT HẠI GÂY RA BỞI BỆNH ĐẠO ÔN
2.2.1. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn trên thế giới
Bệnh đạo ôn do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, là một trong những bệnh
thường gặp và gây hại nhiều nhất cho lúa. Theo WAD Jayawardana năm 2014,
có hơn 85 quốc gia trên thế giới phát hiện bệnh đạo ơn. Bệnh có khả năng thích

6

ứng cao với các điều kiện mơi trường như khí hậu ơn hịa, độ ẩm cao ở vùng đất
thấp và vùng núi nhiệt đới. Bệnh có thể làm cho cây lúa bị cháy lá hoàn toàn nếu
bị nhiễm sớm ở giai đoạn cây con. Nếu bệnh đạo ôn lây nhiễm ở giai đoạn ra
hoa, thối gốc lóng, lở cổ rễ, gãy thân của lúa và gãy cổ làm cho hạt lép hoặc giảm
trọng lượng hạt.
Theo một số báo cáo, sản lượng thiệt hại do bệnh đạo ơn có thể lên đến
80% ở các vùng dịch bệnh, và ước tính 10% số bông nhiễm bệnh, tổn thất năng
suất là 6% và tỷ lệ chất lượng hạt kém (hạt gạo vỡ, tỷ lệ cao cám, chưa đủ tiêu
chuẩn) tăng lên 5%. Với thiệt hại của nó, bệnh đạo ơn là một trong những bệnh
phá hoại mạnh nhất với lúa gạo, và là mối đe dọa nghiêm trọng đối với nguồn an
ninh lương thực của thế giới (khoảng 157 triệu tấn hàng năm) (Rakesh
Kaundal et al., 2006).
Với tình hình biến đổi khí hậu xảy ra trong những năm gần đây kéo theo
tình hình dịch tễ học trên lúa thay đổi phức tạp hơn, đã ảnh hưởng đáng kể đến
năng suất và sản lượng lúa (Rosangela Bevitori và Raquel Ghini, 2014). Bệnh
đạo ôn được ước tính sẽ gây thiệt hại đến sản xuất lúa gạo 55 triệu đô la Mỹ mỗi
năm chỉ riêng ở Đông Nam Á và gần như giết chết lượng lúa gạo đủ để nuôi 60
triệu người mỗi năm (Talbot, 2007).
2.2.2. Thiệt hại gây ra bởi bệnh đạo ôn ở Việt Nam.
Hiện nay, bệnh đạo ôn đã gây thiệt hại nghiêm trọng ở một số nước như
Nhật Bản, Ấn Độ, Philippines và Việt Nam. (Cục Bảo vệ thực vật, 2015).Ở Việt
Nam, bệnh đạo ôn đã được phát hiện ở khu vực phía Nam rất sớm, từ thời thuộc
địa Pháp vào năm 1921. Có 600.000 ha lúa bị nhiễm đạo ơn trong tổng số 5 triệu
ha lúa trong năm 1992 và 366.412 ha trong tổng số 7.651.400 ha lúa bị nhiễm
bệnh đạo ôn trong năm 2010 (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2015). Ở
Việt Nam, bệnh đạo ôn xảy ra ở cả Bắc, Trung và Nam (Cục Bảo vệ thực vật,
2015). Tuy nhiên mức độ bệnh xảy ra ở miền Bắc và miền Trung thường nặng
hơn, ước tính khoảng 10% lúa bị nhiễm, tổn thất năng suất 6% và tỷ lệ hạt chất
lượng kém tăng 5%. Ở miền Bắc, các giống lúa dễ bị nhiễm bệnh vẫn được trồng
phổ biến trên đồng ruộng, trong khi thời tiết thường có nhiều thay đổi phức tạp,

tạo điều kiện phát sinh các loài gây hại cho cây trồng. Các tỉnh Hải Phòng, Thái
Nguyên, Ninh Bình, Bắc Giang thường bị thất thu.
Ở đồng bằng sông Cửu Long, đạo ôn là bệnh nguy hiểm nhất, xảy ra quanh
năm nhưng thường phát triển mạnh và gây thiệt hại nặng trong vụ đông xuân, đặc

7


biệt là ở các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Kiên Giang,… Trong vụ lúa hè thu năm
2012, ở ĐBSCL có hơn 70.000 ha lúa bị nhiễm bệnh đạo ôn. Ở nhiều nơi, nông
dân phải bỏ đi hàng trăm ha lúa gieo bị nhiễm bệnh nặng nề chiếm tỷ lệ 25% trên
tổng diện tích gieo trồng. Trong vụ đơng xn 2016 - 2017, bệnh đạo ơn có tỷ lệ
nhiễm cao (> 20%) ở các cánh đồng có mật độ gieo hạt cao, phân đạm cao và dễ
bị nhiễm bệnh (Cục Bảo vệ thực vật, 2017). Theo Trung tâm Bảo vệ thực vật
phía Nam, tính đến cuối tháng 1/2013, tồn bộ khu vực phía Nam Việt Nam đã
có 56.818 ha bị nhiễm bệnh đạo ôn lúa và 4.675 ha bệnh đạo ôn với tỷ lệ phổ
biến từ 5 đến 15%. Năm 2013, các tỉnh phát hiện xuất hiện bệnh đạo ôn là Long
An, An Giang, Kiên Giang, Bạc Liêu, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Đồng Tháp, Đồng
Nai,... và riêng An Giang, bệnh đạo ôn lây lan trên 22.318 ha tăng hơn 2.000 ha
so với cùng kỳ vụ đơng xn trước đó. Tại khu vực bị nhiễm Long An là 17,58
ha, với tỷ lệ nhiễm bệnh là 5-10%, chủ yếu ở giai đoạn làm đòng. Ở miền Trung
Việt Nam và Tây Nguyên, bệnh đạo ôn ở tỉnh Phú Yên thiệt hại do đạo ôn trong
vụ đơng xn 1992-1993 ước tính khoảng 3 triệu USD. Bệnh đạo ôn với sự phân
bố lan rộng và thiệt hại nặng nề đã và đang là mối nguy hiểm lớn nhất đối với sản
xuất lúa gạo và tác động đến sinh kế của người dân Việt Nam nói riêng và trên
thế giới nói chung. Để hiểu và ngăn ngừa bệnh đạo ôn là một trong những nhiệm
vụ quan trọng của con người để giảm tổn thất đối với sản lượng lúa gạo (Cục Bảo
vệ thực vật, 2017).
2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN CỦA LÚA
Lý thuyết trọng tâm (central dogma) của sinh học phân tử cho thấy rằng tất

cả các quá trình sinh học của một sinh vật nên xuất phát từ thơng tin được mã
hóa trong ADN bộ gen của nó. Vì bộ gen được coi là một bản thiết kế của các
dạng sống của tế bào, kiến thức về tồn bộ trình tự bộ gen phải tương đương với
việc hiểu toàn bộ cơ chế sinh học. Vào những năm 1980, các nhà sinh học đã dự
tính rằng giải trình tự bộ gen sẽ đẩy nhanh các nghiên cứu sinh học phân tử đến
một mức độ lớn hơn nhiều so với các phân tích từng phần của một số ít gen. Tuy
nhiên, các cơng nghệ giải trình tự có sẵn tại thời điểm đó khơng đủ để xác định
hàng tỷ nucleotide trong một thời gian ngắn. Do đó, để có được trình tự tồn bộ
bộ gen của sinh vật nhân chuẩn cao hơn, một số công nghệ giải trình tự cải tiến
đã được phát triển trong thế kỷ 21.
Kể từ khi hồn thành giải trình tự bộ gen của Haemophilusenzae vào năm
1995 (Fleischmann et al., 1995), trình tự bộ gen đã đóng một vai trị quan trọng

8


trong sinh học hiện nay, mặc dù thời đại genome xuất hiện muộn hơn một chút
đối với thực vật, vi khuẩn và động vật. Việc giải trình tự bằng phương pháp
Sanger có tốc độ chậm với bộ gen lớn và nhất là trong việc xác định bộ gen sinh
vật nhân chuẩn do đó thường mất nhiều thời gian. Mặc dù trình tự bộ gen của
Arabidopsis thaliana, cây mơ hình được nghiên cứu tốt nhất, đã được xuất bản
năm 2000 (Arabidopsis Genome Initiative 2000), dữ liệu trình tự bộ gen cho cây
trồng khơng có sẵn cho đến năm 2002, khi bộ gen của cây japonica và indica
trồng lúa (Oryza sativa L.) đã được giải mã bằng phương pháp shotgun toàn bộ
bộ gen (Goff et al., 2002, Yu et al., 2002). Tuy nhiên, hai trình tự bộ gen này đã
bị phân mảnh với tỷ lệ lớn, phản ánh những hạn chế của phương pháp giải trình
tự này. Việc tìm ra phương pháp giải trình tự bộ gen chính xác hơn sẽ đáp ứng
nhu cầu cho các nghiên cứu về bộ gen tiếp theo. Rất lâu trước khi công bố bộ gen
thu được bằng phương pháp shotgun, những nỗ lực khác đối với việc giải trình tự
bộ gen cây lúa đã được hình thành và bắt đầu vào đầu những năm 1990 tại Nhật

Bản (Sasaki, 1998); tuy nhiên, những kỹ thuật này không đủ để sắp xếp bộ gen
hoàn chỉnh tại thời điểm đó. Năm 1998, dự án giải trình tự bộ gen lúa quốc tế
(IRGSP) được tổ chức bởi các nhà nghiên cứu tiên phong từ mười quốc gia và
khu vực, bao gồm cả Nhật Bản (Matsumoto et al., 2016). Dự án hợp tác quốc tế
này đã sử dụng trình tự bộ gen chính xác dựa trên bản đồ vật lý của nhiễm sắc thể
nhân tạo có nguồn gốc PI (PAC)/ nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC) để tạo ra trình tự
bộ gen chất lượng cao.Trên thực tế, trình tự bộ gen kết quả đã được công bố vào
năm 2004 (Dự án giải trình tự bộ gen lúa quốc tế 2005), sau đó đã được cải thiện
vào năm 2013 (Kawahara et al., 2013), là chính xác và vẫn đóng vai trị là nền
tảng thiết yếu của bộ gen ngũ cốc (Matsumoto et al., 2016).
Kể từ khi phát hành công khai bộ gen IRGSP, các cơng nghệ giải trình tự
thế hệ tiếp theo (NGS) đã thay đổi đáng kể các nghiên cứu sinh học phân tử. Giải
trình tự bộ gen hiện nay khá dễ dàng và hiệu quả hơn so với phương pháp tiếp
cận gen. Ví dụ, nguyên nhân đột biến của một kiểu hình quan tâm có thể được
quan sát nhanh hơn bằng cách giải trình tự so với các phương pháp di truyền
phân tử thông thường khác. Các nghiên cứu giải trình tự thơng lượng cao như
vậy rất hiệu quả trên cây lúa vì chúng ta có thể ánh xạ các lần đọc mới được giải
trình tự vào bộ gen tham chiếu chất lượng cao.
Để xây dựng bộ gen tham chiếu chất lượng cao, cần có một cơng nghệ cải
tiến khác. Cơng nghệ giải trình tự thời gian thực đơn phân tử của Pacific

9


Bioscatics (PacBio) (Eid et al., 2009) hiện là một phương pháp đầy hứa hẹn cho
giải trình tự bộ gen de novo và do đó được áp dụng cho các lồi cây trồng (Sakai
et al., 2015; Du et al., 2017). Một nền tảng mới nổi khác là thiết bị MinlON, một
trình sắp xếp chuỗi nano đơn phân tử từ Oxford Nanopore Technologies
(Michael et al., 2017). MinlON có hiệu quả chi phí cao và thể hiện khả năng
mạnh mẽ để giải trình tự, dẫn đến việc sử dụng rộng rãi. Ngoài các phương pháp

này, sự kết hợp của Ulumina với Hi-C, có thể sử dụng lại dữ liệu chuỗi được tạo
trong quá khứ hứa hẹn một tiềm năng rất lớn (Dudchenko et al., 2017). Do đó, do
trình tự bộ gen de novo chi phí thấp/ chất lượng cao được dự đốn trong tương lai
gần, nhiều bộ gen tham chiếu của giống japonica, giống indica và các giống lúa
hoang dại sẽ được giải trình tự hỗ trợ việc nghiên cứu bộ gen của lúa sẽ được đẩy
nhanh hơn nữa.
2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC GEN KHÁNG ĐẠO ÔN TRÊN CÂY LÚA
Gen kháng đạo ôn là gen mã hóa cho một loại protein biểu hiện tính độc đối
với nịi nấm gây bệnh. Gen kháng đạo ơn phần lớn là đơn gen, trội. Ngồi ra cũng có
những gen trội khơng hồn tồn hoặc gen lặn nhưng rất ít. Mỗi gen kháng đạo ơn chỉ
có thể kháng với một hoặc vài lồi nấm gây bệnh. Thơng thường mỗi giống lúa
kháng chỉ mang một gen kháng. Vì vậy, khả năng kháng thấp, muốn giống kháng
tốt, bền vững thì giống phải quy tụ được nhiều gen kháng. Gen kháng đạo ơn ở lúa
chia thành: gen kháng chính và gen kháng phụ. Gen kháng chính biểu hiện thơng
qua hiệu quả chất lượng, di truyền đơn giản và đặc thù chủng. Gen kháng phụ là
những gen mà hoạt động của chúng mang tính bổ trợ đóng góp vào khả năng kháng
của cây chủ, nhờ những gen này mà phạm vi phát triển của bệnh được giới hạn.
Những gen kháng phụ ngày càng được quan tâm hơn khi những cá thể mang gen
kháng chính có sự biểu hiện kém bền về tính kháng..
Hiện nay đã có hơn 100 gen kháng đạo ôn được phát hiện từ các giống lúa
trồng thuộc nhóm japonica (45%), indica (51%), và 4% là các loài hoang dại có
quan hệ họ hàng với lúa trồng đã được xác nhận và công bố. Gen kháng đạo ôn
được phát hiện trên 12 nhiễm sắc thể của cây lúa. Các gen kháng được phát hiện tập
trung nhiều trên nhiễm sắc thể số 6, 11 và 12 (Singh et al., 2015; Tanwaeer et al.,
2015 ; Liang et al., 2016).
Đa số các gen kháng bệnh đạo ôn được phát hiện là gen trội, chỉ một số ít
các gen kháng lặn được cơng bố (Pi21 và pi55(t)) (Tanwaeer et al., 2015). Bên
cạnh các gen kháng đơn lẻ, các nhà khoa học cũng đã phát hiện được 347 QTLs

10

quy định tính kháng bệnh đạo ơn trên cây lúa (Koide et al., 2009). Trong đó, chỉ
có 27 gen đã được nhân dòng là Pib, Pb1, Pita, Pi9, Pi2, Pizt, Pid2, Pi33, Pii,
Pi36, Pi37, Pikm, Pit, Pi5, Pid3, Pid3-A4, Pi54, Pish, Pik, Pikp, Pia, PiCO39,
Pi25, Pi1, Pi21, P50 và Pi65 (t) (Liu et al., 2014; Su et al., 2015; Zheng et al.,
2016). Hầu hết các gen này mã hóa cho các protein chứa vùng liên kết với
nucleotide (Nucleotide Binding Site - NBS) và vùng chức năng chứa trình tự lặp
lại giàu leucine (Leucine-rich repeat- LRR (Hayashi et al., 2010; Li et al., 2016;
Guo et al., 2016). Đây là cấu trúc protein của nhóm gen kháng phổ biến nhất ở
thực vật. Sản phẩm của các gen kháng này có khả năng phát hiện một sản phẩm
do một gen gây độc của nấm bệnh đạo ôn quy định (Avirulence gene) (Hayashi
et al., 2010; Rahim et al., 2013; Guo et al., 2016).
Gen kháng đạo ơn chính (major gene) bao gồm 63 gen được phát hiện trên
12 nhiễm sắc thể của cây lúa. Các gen kháng được phát hiện chủ yếu tập trung
nhiều trên nhiễm sắc thể số 6, 11 và 12 (Ballini et al., 2008; Ashkani et al.,
2013). Trên nhiễm sắc thể số 6 đã phát hiện được ít nhất 14 gen hay alen (Pi2,
Piz, Piz-t, Piz-5, Pi8 (t), Pi9, Pi13, Pi13 (t), Pi25 (t), Pi26 (t), Pi27 (t) Pid2,
Pigm (t), và Pi40 (t)). Các gen này nằm tập trung ở vùng giữa của nhiễm sắc thể
số 6. Trên nhiễm sắc thể số 11, có ít nhất 14 gen hay alen (Pi18 (t), Pi38 (t), Pi44
(t), PiCO39(t), Pilm-2, Pi7(t), Pi1, Pi7, Pi47(t), Pi43(t), Piks, Pikg(t), Piy(t), và
Pizy(t) đã được xác định. Trên nhiễm sắc thể 12, ít nhất 17 gen hay alen kháng đã
được xác định bao gồm: Pita, Pita-2, Pitq6, Pi6(t), Pi12(t), Pi12(t), Pi19(t),
Pi20(t), Pi21(t), Pi24(t), Pi31(t), Pi32(t), Pi39(t), Pi62(t), Pi157(t) IPi và IPi
(Hayashi et al., 2006; Yohei et al., 2009; Miah et al., 2015).
Có 17 gen kháng đạo ơn phụ (minor gene) được lập bản đồ phân tử trên 9
nhiễm sắc thể trong số trong số 12 nhiễm sắc thể của cây lúa, ngoại trừ nhiễm sắc
thể số 7, 9 và 10.
2.5. CƠNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI VÀ ỨNG DỤNG TIN
SINH HỌC

Trong thế kỷ trước, việc đọc trình tự ADN cịn gặp nhiều khó khăn do máy
móc có giá thành cao, mất thời gian để đọc toàn bộ hệ gen do vậy chỉ phù hợp cho
kiểm tra các gen riêng lẻ và một số xét nghiệm chẩn đoán phân tử sử dụng trong các
phịng thí nghiệm y học như di truyền phân tử, di truyền dược học, bệnh về máu và
vi sinh .v.v. Ngày nay, các công ty thương mại đã cho ra đời các thế hệ máy đọc
trình tự dựa trên nhiều cơng nghệ mới (Next Genration Sequencing - NGS). Các kỹ

11


thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng huỳnh
quang phân tích tự động (Pettersson et al., 2009). Các công nghệ đọc trình tự mới
ln hướng tới làm tăng thơng lượng (throughput), làm giảm thời gian và giá thành
(Schadt et al., 2010). Mặc dù vậy, phương pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của
các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng ADN polymerase trong quá trình khuếch đại
ADN in vitro) được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trước đây vẫn được thực hiện
xen kẽ khi cần thiết (Sanger et al., 1977).
Đọc trình tự được thực hiện sau phản ứng khuếch đại ADN (như ở phương
pháp Sanger) được thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai đoạn tổng
hợp sợi ADN bổ sung cho sợi khuôn (phương pháp pyrosequencing) (Nyren
2007). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ thuật đọc trình tự bằng tổng hợp, nền
tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay cịn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ
mới sau này. Với ưu thế thời gian đọc nhanh, trình tự đọc được rất chính xác,
cường độ phát quang định lượng được nên dù trình tự đọc được không dài (<100
bases) nhưng pyrosequencing thể hiện rõ ưu thế hơn hẳn phương pháp Sanger và
trở thành một kỹ thuật khơng thể thiếu trong các phịng thí nghiệm sinh học phân
tử (Poehlmann et al., 2007).
Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính. Nguyên lý
thứ nhất đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã được các
thế hệ máy Roche 454, lon Torrent và Illumina sử dụng. Nguyên lý thứ hai đó là

đọc trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) được sử dụng ở máy SOLiD
do George Church phát minh. SBL đã được sử dụng để xác định trình tự genome
và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới. Hiện nay, các dòng máy
của Illumina như là MiSeq, NextSeq và HiSeq được ứng dụng rộng rãi.
Sự phát triển mạnh mẽ của kỹ thuật NGS là một cuộc cách mạng trong cơng
nghệ đọc trình tự nói riêng và trong cơng nghệ sinh học phân tử nói chung. Với
các tiến bộ về thiết bị và hóa chất, hiện nay đọc trình tự bộ gen của một cơ thê
sống có thể được thực hiện tại các phịng thí nghiệm được cấp kinh phí vừa phải
với thiết bị đọc trình tự thế hệ mới như Illumina MiSeq, Ion-Torrent PGM...
trong thời gian ngắn (thậm chí chỉ trong 24 giờ) thay vì phải kéo dài hàng năm và
giá thành rẻ. Trình tự bộ gen vi khuẩn hay virus có thể được đọc dễ dàng với các
thiết bị có cơng suất nhỏ khoảng 6-10 Gbases mà không cần đến hàng trăm
Gbases. NGS là một công cụ mạnh nhất để phát hiện được các tác nhân gây
bệnh, các đột biến gen với tần suất thấp. Chính vì vậy, đọc trình tự thế hệ mới là

12