Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LÊ ANH TÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN LEVAN TỪ (Bacillus subtilis)
VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN
NUÔI CHO GÀ CẢNH GIAI ĐOẠN 1-14 NGÀY TUỔI

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. VŨ KIM DUNG

Hà Nội, 2020


i

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi dưới sự
hướng dẫn của TS. Vũ Kim Dung. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là

trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và được trích dẫn đầy đủ theo quy định. Cơng
trình chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác.
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020
Người cam đoan

Lê Anh Tú


ii

LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Lâm nghiệp, bằng sự
biết ơn và kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cơ giáo đã
nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi trong
suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thiện đề tài nghiên cứu này.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Kim Dung - Bộ mơn
Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm
nghiệp, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong q trình thực hiện đề
tài. Bên cạnh đó, tơi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn sinh viên
phịng Cơng nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Đại
học Lâm nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo bộ phận Feed Technology - Công ty Cổ
phần Chăn nuôi CP Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi
được tham gia học tập, nghiên cứu trong 2 năm học và giúp đỡ tôi trong việc thực
hiện phần ứng dụng của đề tài nghiên cứu.
Một lần nữa cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng
nghiệp đã động viên, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn này.
Tuy nhiên điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế, luận văn chắc chắn
khơng tránh khỏi những thiếu sót. Kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của các
thầy cơ giáo, bạn bè và đồng nghiệp để bài luận văn của tơi được hồn thiện hơn.

Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2020
Học viên

Lê Anh Tú


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................................... 3
1.1. Tổng quan về levan...........................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về levan .....................................................................................3
1.1.2. Tính chất.....................................................................................................6
1.1.3. Nguồn thu nhận levan ................................................................................7
1.1.4. Một số mơi trường ni cấy kích thích B. subtilis sinh levan ....................8
1.1.5. Ứng dụng của levan .................................................................................10
1.2. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh .............................................................................12
1.2.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh .........................................................12
1.2.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn ni gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ......15
Chương 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 22
2.1. Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................22
2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................22

2.3. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................22
2.3.1. Vi sinh vật .................................................................................................22
2.3.2. Mơi trường ...............................................................................................22
2.3.3. Hóa chất ...................................................................................................23
2.3.4. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................23
2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................23
2.4.1. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và
cs, 2019) .............................................................................................................23


iv

2.4.2. Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng
hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013) ..............24
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .................................25
2.4.4. Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan
(giai đoạn 1-14 ngày tuổi)..................................................................................26
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................30
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 31
3.1. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp
levan ......................................................................................................................31
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ sucrose ..............................................................31
3.1.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu .....................................................................32
3.1.3. Ảnh hưởng của nguồn nito .......................................................................33
3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ nito ....................................................................34
3.1.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp ................................................................36
3.1.6. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ........................................................................36
3.2. Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp levan .............................................................38
3.3. Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan .............................................................41
3.3.1. Ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được .........41

3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi đến hàm lượng
levan thu được ....................................................................................................43
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được .............44
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được ............45
3.4. Nghiên cứu quy trình sản xuất cám gà cảnh từ chế phẩm levan (giai đoạn 1 14 ngày tuổi) ..........................................................................................................46
3.4.1. Xác định tỷ lệ levan phối trộn ..................................................................46
3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ ép viên ......................................................48
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52
PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa đầy đủ

B. subtilis

Bacillus subtilis

Ca

Canxi

CP

Cruide Protein

CS

Cộng sự

Fat

Fat

FOS

Fructo - oligosaccharides

Fib

Fiber

GE

Gross Energy

GP

Glucose trypton

M

Moisture

MTCB

Môi trường cơ bản

P

Photpho

QC&Lab

Quality Control & Laboratory

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TGA

Trypton Glucose Agar


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên ..................................................7
Bảng 2.1. Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng
biến số .......................................................................................................................25
Bảng 2.2. Thành phần nguyên liệu trong công thức cám gà con giai đoạn 1 - 14
ngày tuổi ....................................................................................................................26
Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ ..................27
Bảng 2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên ......................27

Bảng 2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh .........................28
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng levan thu
được trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau ...........................................................39
Bảng 3.2. Kết quả phân tích phương sai mơ hình tối ưu bằng phần mềm DX11 .....41
Bảng 3.3. Kết quả phân tích dinh dưỡng cám trong cơng thức ................................47
Bảng 3.4. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng ................................................48
khi bổ sung chế phẩm levan ......................................................................................48
Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra cảm quan khi bổ sung chế phẩm levan trong công thức
thức ăn chăn nuôi ......................................................................................................49
Bảng 3.6. Kết quả phân tích vi sinh khi bổ sung chế phẩm levan trong thức ăn chăn
nuôi ............................................................................................................................49


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan .........................................................................3
Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea® ....................................................5
Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir®............................................................5
Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com) ............................6
Hình 1.5. Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên ..............................................13
Hình 1.6. Giống gà Quý phi ......................................................................................13
Hình 1.7. Giống gà lai cá ..........................................................................................14
Hình 1.8. Giống gà lơng xù .......................................................................................14
Hình 1.9. Giống gà Serama .......................................................................................15
Hình 1.10. Quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn chăn ni gà ...............................16
Hình 1.11. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi ......18
Hình 1.12. Lấy mẫu nguyên liệu đầu vào .................................................................18
Hình 1.13. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu bằng máy DS2500F ............................18
Hình 1.14.Kiểm tra nguyên liệu trước khi lưu silo ...................................................19

Hình 1.15. Hệ thống bồn chứa nguyên liệu ..............................................................19
Hình 1.16. Máy móc trong hệ thống sản xuất ...........................................................20
Hình 1.17. Hình ảnh bao cám gà ...............................................................................21
Hình 1.18. Hình ảnh cám gà......................................................................................21
Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng nồng độ sucrose đến khả năng sinh tổng hợp levan .31
Hình 3.2. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ sucrose
khác nhau...................................................................................................................31
Hình 3.3. Kết quả ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp levan ...32
Hình 3.4. Canh trường sau khi nuôi cấy chủng B. subtilis với các nồng độ pH khác
nhau ...........................................................................................................................33
Hình 3.5. Kết quả ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh tổng hợp levan ....34
Hình 3.6. Canh trường sau khi ni cấy chủng B. subtilis với các nguồn nito khác
nhau ...........................................................................................................................34
Hình 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ nito đến khả năng sinh tổng hợp levan ........35


viii

Hình 3.8. Canh trường sau khi ni cấy chủng B. subtilis với các nồng độ nito khác
nhau ...........................................................................................................................35
Hình 3.9. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp đến khả năng sinh tổng hợp levan ...36
Hình 3.10. Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp levan ....37
Hình 3.11. Canh trường sau khi ni cấy chủng B. subtilis với tốc độ lắc khác nhau .37
Hình 3.12. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu sinh tổng hợp levan ...........................40
Hình 3.13. Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh tổng hợp levan ...............................40
Hình 3.14. Kết quả ảnh hưởng của các loại dung môi đến hàm lượng levan thu được .. 42
Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích dịch chiết levan và dung mơi đến hàm
lượng levan thu được.................................................................................................43
Hình 3.16. Canh trường sau khi ni cấy chủng B. subtilis với tỷ lệ thể tích levan
và dung mơi khác nhau .............................................................................................43

Hình 3.17. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ kết tủa đến hàm lượng levan thu được 44
Hình 3.18. Kết quả ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến hàm lượng levan thu được ....45


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, những
nguyên liệu sinh học an toàn dần được sử dụng để thay thế cho các nguyên liệu hóa
học. Chúng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong cuộc sống.
Các nguyên liệu đó có khả năng đáp ứng những nhu cầu cần thiết và đảm bảo an
tồn trong các mục đích sử dụng. Vì thế, các nhà khoa học đã và đang tiến hành
nghiên cứu thu nhận các hợp chất có nhiều tính năng vượt trội từ vi sinh vật phục vụ
cho đời sống con người.
Levan là hợp chất polymer sinh học được tổng hợp từ vi khuẩn trên mơi
trường có thành phần chính là sucrose. Đây là polymer của fructose được tạo ra bởi
liên kết β - (2 - 6) fructo - furanosidic, có mặt trong nhiều loại thực vật và các sản
phẩm từ vi sinh vật. Levan cung cấp nguyên liệu cho hàng loạt các ngành công
nghiệp trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: y dược, thực phẩm và mỹ phẩm. Ứng
dụng tiềm năng của levan để làm chất nhũ hóa dùng trong sữa, chất ổn định, chất
làm đặc và đặc biệt là khả năng phục hồi sức khỏe và có giá trị trong các liệu pháp
điều trị ung thư...
Levan là một polymer của fructose có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm
men, nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2001). Levan tổng hợp từ các nguồn vi sinh vật
như: Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia amylovora, Erwinia herbicola,
Seraria sp. (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis (Kim và cs, 2000),
Acetobacter xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998) và B. subtilis (Shin và cs,
2005). Trong đó chủng B. subtilis Natto có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả
với hiệu suất 40,4 g/l trên mơi trường có chứa 200g/l sucrose (Shin và cs, 2005).
Nhưng nhìn chung, hiệu suất thu levan từ các nguồn vi sinh vật chưa cao. Vì vậy,

các nhà khoa học khơng ngừng tìm kiếm các nguồn thu nhận mới có khả năng thu
được hàm lượng levan cao hơn.
Ở Việt Nam, phong trào chơi gà cảnh ngày một phát triển. Một con gà cảnh có
trọng lượng 500 g lượng thức ăn tiêu tốn chỉ bằng 1/3 con gà cơng nghiệp, nhưng giá
trị của nó đem lại có thể cao gấp vài chục lần, thậm chí hàng trăm lần gà công nghiệp.


2

Việc bổ sung dinh dưỡng trong chế độ ăn cho gà cảnh hay chế phẩm sinh học
trong khẩu phần ăn, đặc biệt là giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi là giai đoạn sức đề kháng
kém, nhạy cảm dễ tăng tỷ lệ chết. Bổ sung dinh dưỡng trong giai đoạn này một cách
hợp lý sẽ phù hợp với sự phát triển của gà và giúp cân bằng được dinh dưỡng, tăng
sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cũng như cân đối về ngoại hình phục
vụ cho mục đích sử dụng.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu
thu nhận levan từ Bacillus subtilis và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn cho
gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi”.


3

Chương 1
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về levan
1.1.1. Giới thiệu về levan
Levan là thuộc một trong hai loại fructans (là các cacbohydrate thường tìm
thấy trong thực vật, tảo, vi khuẩn). Fructans gồm có hai loại chính là levan và
inulins được phân biệt bởi các loại liên kết. Các đơn phân trong phân tử levan liên
kết với nhau bằng liên kết ß (2 - 6) cịn trong phân tử inulins là liên kết ß (2 - 1)

(Han và cs, 1990). Theo phân loại levan thuộc nhóm thứ hai của fructans.
Levan là polymer của fructose được tạo ra bởi liên kết β - (2 - 6) fructo furanosidic (Ki- Hyo và cs, 2001; Mardo và cs, 2014). Các vi sinh vật có khả năng
tổng hợp levan gồm: Lactobacillus gasseri, B. circulans, E. amylovora, Seraria sp.,
Acetobacter xylinum NCI 1005, Z. mobilis và B. subtilis (Anwar và cs, 2010; Devi
và Alamu, 2013; Oliveira và cs, 2007). Levan là polysaccharide ngoại bào được
tổng hợp từ vi khuẩn trên mơi trường có thành phần chính là sucrose. Do các vi
khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp levansucrose để chuyển hóa sucrose thành
levan (Mardo và cs, 2014).
Năm 2012, một nghiên cứu được thực hiện bởi Esawy và cs cho thấy vi
khuẩn Bacillus spp được tách chiết từ mật ong có khả năng sinh tổng hợp levan.
Mặc dù cấu trúc của levan được đặc trưng bởi một mạch thẳng của liên kết ß (2 - 6)
nhưng có nhiều levan được tổng hợp từ vi khuẩn có cấu trúc phân nhánh với liên kết
ß (2 - 1). Các mạch nhánh thường ngắn và đôi khi chỉ có mơt đơn phân fructose.
Fructans ngắn nhất là 6 - ketose và đây cũng chính là fructan ngắn nhất trong các
loại levan. Levan là một trong số ít các polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại
dưới dạng furanose.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của levan


4

Levan được sản xuất từ các sinh vật khác nhau sẽ có sự khác biệt về trong
lượng phân tử và mức độ phân nhánh. Levan được tổng hợp từ vi khuẩn có khối
lượng phân tử lớn hơn levan thu được từ thực vật khoảng 2 - 100 kDa (Pontis và
Campillo, 1985; Keith và cs, 1991). Levan được sản xuất từ thực vật có trong lượng
phân tử khoảng 2 - 33 kDa (Rhee và cs, 2002). Levan được sản xuất từ q trình lên
men bởi vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử khoảng 107 Da, tương
ứng với 60000 đơn phân của fructose (Viikari và cs, 1986). Bên cạnh đó, levan
được sản xuất từ vi khuẩn B. subtilis Natto có hai loại trọng lượng phân tử khác

nhau, levan có khối lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử
thấp 11 kDa. Levan có trọng lượng phân tử khác nhau sẽ cần thiết cho từng mục
đích cụ thể (Shin và cs, 2005).
Trong đó chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với
40 g/l trên mơi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005).
Trong nghiên cứu của Jothi và cs (2019) cho thấy levan được tổng hợp bởi B.
subtilis MTCC 441 sử dụng sucrose làm nguồn carbon. Chiết xuất nấm men (YE) là
nguồn nitơ tốt nhất. Nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l, tốc độ lắc
150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan. Kết quả cho thấy năng suất levan
thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose.
Các nghiên cứu chỉ ra levan có khả năng chống ung thư (Calazans cs, 2000;
Yoo và cs, 2004). Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella
aquatilis và Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dịng khác nhau của tế
bào ung thư (El-Safty và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi
vai trò của chúng trong điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm
cholesterol (Yamamoto và cs, 1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể
(Calazans và cs, 1997; Yamamoto và cs, 1999). Levan có thể được sử dụng để sản
xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 - dianhydride) với độ ngọt bằng một nửa
độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy, levan được ứng dụng như một chất
làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho và cs,


5

2001). Trong vài thập kỷ qua, một số nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy các
chủng vi khuẩn để tăng cường khả năng tổng hợp levan đã được thực hiện. Oliveira
và cs (2007) tiến hành tối ưu điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương
pháp đáp ứng bề mặt với 2 nhân tố thay đổi, thu được hàm lượng levan cao nhất
21,68 g/l. Santos và cs (2013), cũng tối ưu điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto bằng
phương pháp này cho hàm lượng levan đạt 111,6 g/l với nồng độ sucrose (400 g/l)

và thời gian nuôi 16 giờ.
Hiện nay, levan đang được rất nhiều nhà khoa học và sản xuất quan tâm bởi
các đặc tính vượt trội như: khả năng hịa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính
mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt, chống ung thư và khả năng tạo màng
(Santos và cs, 2013). Vì vậy, levan được ứng dụng trong mỹ phẩm, thực phẩm và
dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013).
Levan được sử dụng trong chăm sóc cá nhân, y tế, cơng nghệ nanno (Gupta
và cs, 2010), nuôi trồng thủy sản và các ứng dụng thực phẩm (Oner và cs, 2016).
Natural Polymers Inc. (Hoa Kỳ); Real Biotech Co., Ltd., (Hàn Quốc) và Advance
Co., Ltd., (Nhật Bản) là những nhà sản xuất chính của levan ở quy mơ thương mại.
Hai ví dụ phổ biến của các sản phẩm thương mại dựa trên levan có sẵn trên thị
trường là Proteolea® và Slimexir® (Oner và cs, 2016).

Hình 1.2. Sản phẩm dưỡng da mặt

Hình 1.3. Sản phẩm dưỡng thể

với Proteolea®

với Slimexir®

Bên cạnh đó, một số các sản phẩm thực phẩm chức năng đã được bày bán tại các hệ
thống siêu thị tại Hàn Quốc, Nhật Bản của công ty RealBiotech (www.realbio.com)
(Beste và cs, 2016).


6

Hình 1.4. Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com)
1.1.2. Tính chất

Levan là một loại bột tinh thể màu trắng có tính chất như một chất kết dính
mạnh mẽ. Các hạt có dạng hình cầu đường kính 75 - 200 nm. Các thành phần và
tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp
levan (Khadiga và cs, 2015).
Không giống như polysaccharides được sử dụng như chất nhũ hóa và chất
làm đặc, levan khơng trương lên trong nước và độ nhớt thấp 0,38 dl/gm ở 250C (In
Young Bae và cs, 2007).
Levan rất dễ tan trong nước nóng và gần như khơng hịa tan (< 0,5%) trong
nước ở nhiệt độ phòng. Khả năng hòa tan trong nước nóng của levan cao hơn inulin
được đặc trưng bởi liên kết ß (2 - 6) so với liên kết ß (2 - 1) và cấu trúc mạch nhánh
có thể chỉ là một yếu tố hỗ trợ (Justin và cs, 2007).
Levan là một homopolymer của fructose khơng hịa tan trong hầu hết các
dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012):
- Methanol, ethanol, isopropanol, n - propanol;
- Acetone, methylethylketone, toluene;
- Ethyl lactate;
- N, N - dimethyloctanamide, N, N - dimethyl - decanamide;


7

- Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate;
- D - limonene;
- Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol;
- Dimethyl formamid;
- Ethoxyethyl acetate, anhydride acetic;
- Furfuryl alcohol;
- Dầu hỏa, xăng.
Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase,
nhưng rất dễ bị thủy phân bởi acid tạo thành fructose. Levan bị thủy phân hoàn toàn

thành các đơn phân fructose trong HCl 1N ở 700C (Kang và Cottrell, 1979). Levan
cũng được thủy phân bởi axit oxalic 0,5% (Shin và cs, 2005). Theo Szwengiel và cs
(2004) sản phẩm của quá trình thủy phân levan bởi axit yếu là các fructo oligosaccharides (FOS) ngắn và các đơn phân fructose.
Độ kết dính của levan rất mạnh. So với các polymer tự nhiên, levan có độ kết
dính mạnh hơn rất nhiều, được thể hiện qua bảng 1.1 (Bruna và cs, 2015).
Bảng 1.1. Độ kết dính của một số polymer tự nhiên
Polymer tự nhiên

Độ kết dính (psi)

Levan

991

Carboxymethylcellulose

193

Inulin

124

Guargum

63

Xanthan gum

33

Levan có một số đặc tính sinh học như: ức chế khối u, kích thích và tăng tính
thấm tế bào (Leibovici và Stark, 1984). Hơn nữa, levan cịn có khả năng tương thích
sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy, levan được ứng dụng nhiều trong y học
(Shin và cs, 2005).
1.1.3. Nguồn thu nhận levan
Levan là một cacbohydrate có thể được sản xuất bởi cả thực vật, nấm men,
nấm và vi khuẩn (Jang và cs, 2002). Levan được tìm thấy trong một số loại cỏ như:


8

Dactylis glomerata, Poa secunda và Agropyron cristatum. Levan cũng được chứa
trong lúa mì và lúa mạch (Hordeum vulgare), nấm (Aspergillus sydawi và A.
versicolor) (Han, 1990). Levan được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật như: Zymomonas
mobilis (Muro và cs, 2000), Bacillus circulans, Bacillus polymyxa, Erwinia
amylovora, Erwinia herbicola, Seraria sp (Oseguera và cs, 1996), Rahnella aquatilis
(Kim và cs, 2000), Pseudomonas syringae (Hettwer và cs, 1995) và Acetobacter
xylinum NCI 1005 (Tajima và cs, 1998). Levan được sản xuất từ các sinh vật khác
nhau sẽ có sự khác biệt về trọng lượng phân tử và mức độ phân nhánh.
Levan được sản xuất từ vi khuẩn được ni cấy trên mơi trường có thành
phần chính là sucrose. Dựa trên chất nền bằng phản ứng chuyển gốc fructose của
sucrose trong levan β - 2, 6 - fructan bởi enzyme D - glucose - fructosyl transferare
bởi một số vi sinh vật. Nhưng nguồn vi sinh vật để sản xuất levan ở quy mô công
nghiệp cho năng suất cao rất hiếm.
Gần đây các nhà khoa học đã tìm ra vi khuẩn B. subtilis Natto có khả năng
sản xuất ra một hỗn hợp poly acid glutamic và levan. Khi chúng được ni cấy
trong mơi trường có thành phần chính gồm đường sucrose và axit amin L Glutamic. Tuy nhiên, hỗn hợp poly acid -  - glutamic chủ yếu được sản xuất trong
mơi trường có chứa acid -  - glutamic và khơng có đường sucrose. Ngược lại, levan
chỉ được sản xuất khi vi khuẩn được nuôi cấy trong mơi trường có tới 20% (w/w)
đường sucrose nhưng khơng có glutamate. Các nhà khoa học cho rằng B. subtilis

Natto có tiềm năng sản xuất lượng lớn levan và sản phẩm dễ dàng tinh sạch (Shin
và cs, 2005).
1.1.4. Một số mơi trường ni cấy kích thích B. subtilis sinh levan
Levan sản xuất từ vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường có thành phần
chính là đường cacbonhydrate như sucrose.
Năm 2004, Szwengiel và cs, đã nuôi cấy B. subtilis DSM 347 trên mơi trường
có thành phần như sau: sucrose (150 g/l), acid citric (11,7 g/l), natri sulfat (4,0 g/l),
ammonium hydrogen phosphate (4,2 g/l), cao nấm men (5,0 g/l) và 100 ml/l của dung
dịch muối (với các thành phần: KCl (7,62 g/l), MgCl2 (4,18 g/l), MnCl2 (5,43 g/l),
FeCl3 (0,49 g/l), ZnCl2 (0,21 g/l)). Độ pH của môi trường nuôi cấy đã được điều


9

chỉnh tới 6,8 bằng dung dịch amoniac 25%. Môi trường được khử trùng ở 121oC
trong 20 phút. Sau 16 giờ nuôi cấy thu được levan với hàm lượng 35 g/l.
Năm 2005, Shin và cs đã tổng hợp được 40,4 (g/l) levan từ B. subtilis (Natto)
sau 21 giờ lên men trên mơi trường có sucrose (200 g/l), MgSO4.7H2O (0,5 g/l),
NaH2PO4.2H2O (3 g/l) và Na2HPO4.12H2O (3 g/l) ở pH 7.
Năm 2007, theo Oliverira và cs sau 24 giờ nuôi cấy Zymomonas mobilis
ATCC 31821 trên mơi trường sinh tổng hơp levan có các thành phần như sau:
sucrose (350 g/l), cao nấm men (2 g/l), KH2PO4 (1 g/l), (NH4)2SO4 (1 g/l),
MgSO4.7H2O (0,5 g/l) ở 25oC đã sinh tổng hợp được levan 21,7 g/l.
Nghiên cứu của Santos và cs (2013), cho thấy từ chủng B. subtilis được phân
lập từ thực phẩm Natto thương mại của Nhật Bản có khả năng sinh tổng hợp levan
rất cao so với các nghiên cứu trước đây. Chủng B. subtilis Natto được ni cấy trên
mơi trường có hàm lượng sucrose cao (400 g/l) ở 370C. Ngồi sucrose mơi trường
lên men cịn có nhiều thành phần khác như: cao nấm men (2,0 g/l), KH2PO4 (1,0
g/l), (NH4)2SO4 (3,0 g/l), MgSO4. 7H2O (0,06 g/l), MnSO4 (0,02 g/l). Sau 16 giờ
nuôi cấy tác giả đã tổng hợp được 111,6 g/l levan từ B. subtilis Natto.

Gần đây, Jothi và cs (2019), đã nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp levan từ
chủng Bacillus subtilis MTCC 441 trong điều kiện môi trường dịch chiết nấm men
(YE) nồng độ 2 g/l, nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, tốc độ lắc 150 vòng/ phút đã
tổng hợp được hàm lượng levan tương ứng là 0,395 g/g sucrose.
Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ảnh hưởng tới thành phần và
tính chất của levan. Theo Guilbert và Combes (1996), nồng độ sucrose trong môi
trường nuôi cấy ảnh hưởng đến trọng lượng phân tử của levan. Nồng độ sucrose
trong môi trường ni cấy tỷ lệ nghịch với kích thước chuỗi polymer của fructose.
Santos và cs (2013), đã nuôi cấy B. subtilis Natto trên môi trường giàu sucrose (400
g/l) sinh tổng hợp được hai loại levan trọng lượng phân tử khác nhau. Levan có khối
lượng phân tử cao 1794 kDa và levan có khối lượng phân tử thấp 11 kDa. Điều này
được lý giải bởi ban đầu, trong môi trường nuôi cấy nồng độ sucrose cao nên vi
khuẩn sẽ tổng hợp được levan có trọng lượng phân tử thấp 11 kDa, cịn sau đó trong
q trình ni vi sinh vât, vi khuẩn sử dụng nhiều sucrose, làm cho nồng độ sucrose


10

giảm đi rất nhiều nên sẽ tổng hợp được các phân tử levan có trọng lượng cao 1794
kDa (Santos và cs, 2013).
1.1.5. Ứng dụng của levan
Trong những năm gần đây, việc sử dụng loại polysaccharide mới từ vi khuẩn
đang phát triển mạnh, loại polysaccharide mới này được gọi là một polymer sinh
học có tính tương thích sinh học cao, thân thiện với môi trường và polysaccharide
sản xuất từ vi khuẩn này được xem là một nguồn năng lượng tiềm năng trong ngành
công nghệ sinh học.
Levan là một loại polymer sinh học cũng đang được rất nhiều người quan
tâm bởi các đặc tính vượt trội của levan như khả năng hịa tan tốt trong dầu và nước,
độ kết dính mạnh, khả năng tương thích sinh học tốt và khả năng tạo màng. Vì vậy,
levan được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như: mỹ phẩm, thực phẩm, dược

phẩm, y học (Hae và cs, 2003).
Trong lĩnh vực y học, levan được coi là một sản phẩm tuyệt vời của sinh học
bởi khả năng tương thích với hoạt động của cơ thể con người. Do có hoạt tính
polymer sinh học nên levan có thể dùng để sản xuất các fructose tinh khiết dùng
trong y tế, có khả năng chống ung thư (Calazans và cs, 2000; Yoo và cs, 2004).
Levan sản xuất từ Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và
Zymomonas mobilis có khả năng chống lại tám dòng khác nhau của tế bào u (El-Safty
và cs, 2012). Nhiều nghiên cứu về levan đã được thúc đẩy bởi vai trò của chúng trong
điều trị sâu răng (Aridson và cs, 2006) và làm giảm cholesterol (Yamamoto và cs,
1999), điều hòa các hoạt động miễn dịch trong cơ thể (Calazans và cs, 1997). Ngồi
ra, levan cịn tạo ra lượng hypocholesterol lớn (Yamamoto, 1999).
Một số levan cịn có các hoạt tính sinh học gần giống như huyết tương, vì
vậy có khả năng làm tăng khối huyết tương, hạ đường huyết trong điều trị bệnh tiểu
đường. Levan có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV (di - D - fructose - 2,6: 6.2 dianhydride). DFA IV thuộc nhóm các hợp chất di - fructose anhydride (DFAs) là
kết quả của một phản ứng transfructosylation intramolecular. DFA IV được đặc
trưng bởi độ ngọt bằng một nửa độ ngọt của sucrose và có tính ổn định. Vì vậy,
levan được ứng dụng như một chất làm ngọt trong các sản phẩm sử dụng cho bệnh
nhân tiểu đường (Jaecho và cs, 2001).


11

Năm 2009, Kang và cs đã nghiên cứu các khả năng gây độc của levan đối
với dòng tế bào nguyên bào sợi người. Kết quả nghiên cứu cho thấy, levan khơng có
khả năng gây độc đối với các dịng tế bào với nồng độ levan 100 mg/ml và 1 mg/ml.
Năm 2011, theo Dahech và cs levan có hiệu quả trong việc ức chế tăng
đường huyết gây ra bởi bệnh tiểu đường và nghiên cứu cho thấy khi bổ sung levan
vào chế độ ăn uống có thể hữu ích trong việc ngăn ngừa các biến chứng bệnh tiểu
đường ở chuột trưởng thành.
Năm 2012, Esawy và cs đã nghiên cứu levan được tổng hợp từ Bacillus spp

phân lập từ mật ong có khả năng kháng vi rút H5N1 và 40 loại denovirus.
Trong ứng dụng dược phẩm, levan được dùng làm màng bao của thuốc viên.
Levan có cấu trúc ít phân nhánh thường tạo độ nhớt kém có thể sử dụng như một
chất kết dính trong thuốc viên và dùng làm màng bao bên ngồi của viên thuốc (In
và cs, 2007).
Trong cơng nghệ thực phẩm, levan được sử dụng làm chất phụ gia thực
phẩm có đặc tính prebiotic và hypocholesterol. Prebiotic là những thành phần thức
ăn khơng bị tiêu hóa và hấp thụ bởi dịch dạ dày và ruột non mà có khả năng kích
thích sự phát triển và hoạt động của các vi khuẩn có lợi trong đường tiêu hóa (Olano
và cs, 2002). Bên cạnh đó, levan cũng được dùng làm chất tạo ngọt, chất nhũ hóa
trong sữa và chất kết dính. Ban đầu, levan được coi là một sản phẩm phụ của quá
trình lên men sản xuất ethanol, tăng độ nhớt của siro đường mía (Ernandes và
Garcia - Cruz, 2005).
Ngồi ra, levan được bổ sung vào các sản phẩm mỹ phẩm với vai trị làm ẩm
da, giảm các hiệu ứng kích thích da và tăng mùi hương cho sản phẩm (Calazans và
cs, 2000).
Ứng dụng của levan là một chất ổn định, chất làm đặc, tác nhân bề mặt, tác
nhân đóng gói, chất làm gia tăng hương vị, màu sắc ngoài ra còn là chất tạo mùi vị
(Selim và cs, 2013).
Một số nghiên cứu chỉ ra một số vi khuẩn có tiềm năng sản xuất lượng lớn
levan có khối lượng phân tử cao và dễ tinh sạch, không lẫn các sản phẩm phụ
polysaccharide khác. Như vậy, chi phí sản xuất levan thấp hơn sẽ làm tăng việc sử
dụng levan (Shin và cs, 2005).


12

Trong lĩnh vực thức ăn chăn nuôi, nghiên cứu của Sanders và cs (2003), đã
chỉ ra rằng levan có thể được sử dụng làm phụ gia thức ăn chăn nuôi với các đặc
tính prebiotic và hypocholesterol.

Levan được bổ sung vào khẩu phần ăn với hàm lượng 0,1% giúp cải thiện
hiệu suất tăng trưởng, làm tăng khả năng tiêu hóa và tăng số lượng Lactobacillus
trong phân đồng thời tác dụng có lợi đối với hệ thống miễn dịch ở lợn trong giai
đoạn đang phát triển (Li và cs, 2013).
Việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trưởng trong thức ăn chăn
ni đã bị cấm hồn tồn hoặc một phần ở một số quốc gia trên thế giới. Xin và cs
(2017), đã nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của levan đến hiệu suất tăng trưởng, khả
năng tiêu hóa chất dinh dưỡng và ảnh hưởng của vi khuẩn Coliform gây bệnh tiêu
chảy ở lợn sau cai sữa. Kết quả chỉ ra rằng bổ sung levan trong chế độ ăn làm tăng
hiệu suất tăng trưởng, cải thiện khả năng tiêu hóa chất dinh dưỡng, tăng số lượng vi
khuẩn axit lactic trong phân và có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng tương tự như
kháng sinh apramycin của lợn sau cai sữa (Zhang và Kim, 2014).
Probiotic là hợp chất vi sinh vật sống được coi là một thay thế tốt cho kháng
sinh, việc sử dụng các sản phẩm probiotic này trong chế độ ăn của gia cầm có tác
động tích cực đến sức khỏe và sự tăng trưởng. Hiện tại có nhiều nghiên cứu cho
thấy rằng sử dụng men vi sinh bổ sung vào chế độ ăn giúp cải thiện chất lượng thịt
gia cầm (Teoroda và cs, 2017). Các nghiên cứu của Yan và cs (2017) cũng cho thấy
khi bổ sung các loại chủng của Bacillus làm tăng trọng lượng của gà, cải thiện mùi
vị đặc trưng và gia tăng sự đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột.
1.2. Thức ăn chăn nuôi gà cảnh
1.2.1. Giới thiệu về một số giống gà cảnh
- Gà rừng cảnh:
Có hai giống chính là gà lơi và gà đỏ, gà rừng hiện là lồi vật ni được
săn đón trên nhiều hội sinh vật cảnh ở Việt Nam. Đây là giống gà khó ni và
khó tìm được cá thể thuần chủng nên người ta có thể chi một số tiền rất lớn để sở
hữu được nó.


13

Hình 1.5. Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên
(Nguồn: Giadinh.net)
- Gà Quý phi:
Giống như tên gọi, đây là giống gà “quý phái” và vô cùng mạnh mạnh mẽ.
Điểm đặc biệt là chiếc mào gà Quý phi giống như quả Phật thủ mà khơng loại gà
nào có được.
Bộ lơng của gà Quý phi cũng rất độc đáo với hai màu đen, trắng, lúc nào
cũng bồng lên như cái nón cùng với đơi mắt đỏ đặc trưng.

Hình 1.6. Giống gà Quý phi
(Nguồn: Giadinh.net)
- Gà lai cá:
Thời gian gần đây, gà vảy cá (gà lai cá), tên quốc tế là gà Sebright, đang trở
thành một vật nuôi “độc” dành cho những người mê sinh vật cảnh Việt Nam.


14

Hình 1.7. Giống gà lai cá
(Nguồn: Hoisvcvn.org.vn)
Chúng có điểm đặc trưng là những chiếc lơng vũ trịn trịa có viền đen bao
quanh, trông rất giống vảy cá. Điều này tạo nên một vẻ quyến rũ đặc trưng cho
những chú “gà lai cá” này.
Khơng những vậy, gà vảy cá cịn có một lịch sử rất đáng tự hào. Giống gà
này được tạo ra từ thế kỷ 19, trong một chương trình nhân giống chọn lọc do nhà
nghiên cứu người Anh John Saunders Sebright (1767 - 1846) tiến hành.
- Gà lông xù:
Gà lơng xù hay cịn gọi là gà Silkie là giống gà rất đặc biệt bởi chúng sở hữu
một bộ lông xù cực kỳ lạ mắt và đáng yêu. Gà lông xù có đủ các loại màu sắc từ
như màu vàng, trắng, đen... Mỗi con gà trưởng thành nặng từ 1,5 - 2 kg, vịng đời có

thể kéo dài tới 7 - 8 năm, nếu chăm sóc tốt có thể sống được 9 năm.

Hình 1.8. Giống gà lơng xù
(Nguồn: Giadinh.net)


15

Do sở hữu bộ lông tơ mịn, nhỏ nên giống gà lông xù không thể bay nhảy như
các loại gà bình thường. Đây là loại gà này đẻ rất ít trứng, chúng chỉ đẻ từ 7 - 10
quả trong một chu kì. Đây chính là lí do khiến số lượng loại gà này trở nên hiếm hoi
trên thị trường sinh vật cảnh Việt Nam.
- Gà Serama

Hình 1.9. Giống gà Serama
(Nguồn: Giadinh.net)
Được xem là giống gà nhẹ nhất thế giới, mỗi con gà Serama trưởng thành chỉ
có trọng lượng từ 300 - 500g. Tuy nhỏ bé, khó ni và rất tốn cơng tập luyện để có
được dáng đứng chuẩn, đây là giống gà được gây chú ý tới nhiều hội sinh vật cảnh
trên Thế giới.
1.2.2. Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
Do nhu cầu dinh dưỡng nên mỗi loại gà khác nhau đều dùng các loại cám
riêng biệt. Tuy nhiên, đối với gà con giai đoạn từ 1-14 ngày tuổi là giai đoạn còn
nhỏ nên nhu cầu dinh dưỡng của các loại gà trong giai đoạn này là giống nhau.
Dưới đây là quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn chăn ni gà


16

Hình 1.10. Quy trình cơng nghệ sản xuất thức ăn chăn ni gà

 Thuyết minh quy tình cơng nghệ
- Ngun liệu nhà máy sử sựng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bao gồm:
+ Nguyên liệu thô: Ngô, khô đậu tương, sắn lát, bã bia, bã cải;
+ Nguyên liệu mịn: Cám gạo, bột cá, bột thịt, bột lông vũ, nguyên liệu
khóang;
+ Nguyên liệu lỏng: Rỉ mật, dầu cá, dầu cám gạo.
- Dây chuyền tiếp nhận và xử lý nguyên liệu: Đây là cơng đoạn đầu tiên của
q trình sản xuất với mục đích tiếp nhận, dự trữ, bảo quản nguyên liệu cho nhà
máy. Sau đó, tiến hành xử lý sơ bộ và làm sạch để đưa vào các công đoạn tiếp theo.
+ Làm sạch: Nguyên liệu được loại bỏ các tạp chất bằng kích thước lưới sàng
5mm, sử dụng hệ thống nam châm để loại bỏ kim loại.
+ Nghiền nguyên liệu: Mục đích để đạt được kích thước theo yêu cầu, tăng
khả năng đồng đều giữa các thành phần nguyên liệu, phân bố đồng đều dinh dưỡng
và khả năng tiêu hóa. Hơn nữa, nguyên liệu được nghiền mịn sẽ thuận lợi cho quá
trình tạo viên, làm cho viên thức ăn có bề mặt bóng, dễ liên kết hơn với các cấu tử
thành phần.