Luận văn thạc sĩ nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm linh chi (ganoderma SP ) trong điều kiện in vitro

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ KIỀU LAN

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT ĐỐI
KHÁNG VỚI BỆNH NẤM MỐC XANH GÂY BỆNH
TRÊN NẤM LINH CHI (GANODERMA SP.)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO

Ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Cảnh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là

trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào.
Em xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khố luận đã
được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Lan

i


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Bộ môn Công nghệ vi sinh,
được sự giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cơ giáo, các cán bộ tại
phịng thí nghiệm của Bộ mơn, cùng sự cố gắng và nỗ lực học tập của
bản thân, em đã hồn thành luận văn tốt nghiệp của mình.
Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà
trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học cùng tồn thể các thầy
cơ giáo đã truyền đạt cho em những kiến thức vơ cùng bổ ích và quý báu
trong suốt thời gian học tập, rèn luyện và thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Cảnh – giảng
viên khoa Công nghệ sinh học đã định hướng đề tài và tận tình hướng
dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ tại phịng thí nghiệm
Bộ mơn Cơng nghệ vi sinh, tồn thể các anh, chị, bạn bè và các em đang
thực tập và nghiên cứu tại phịng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Và cuối cùng, với tất cả lịng kính trọng và biết ơn vơ hạn, em xin gửi lời
cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ và những người thân của em đã nuôi nấng, động viên
và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2017
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kiều Lan

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan................................................................................................................................... i
Lời cảm ơn....................................................................................................................................... ii
Mục lục.............................................................................................................................................. iii
Danh mục bảng.............................................................................................................................. v
Danh mục hình.............................................................................................................................. vi
Danh mục chữ viết tắt............................................................................................................. vii
Trích yếu luận văn..................................................................................................................... viii
Thesis abstract............................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu.............................................................................................................................. 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài............................................................................................ 1

1.2.

Mục đích của đề tài...................................................................................................... 1

1.3.

Yêu cầu của đề tài........................................................................................................ 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu....................................................................................................... 3
2.1.

Nấm Linh Chi................................................................................................................... 3

2.1.1.

Nguồn gốc và sự phân bố....................................................................................... 3

2.1.2.

Tình hình trồng nấm Linh chi................................................................................. 4

2.1.3.

Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học................................................................. 5

2.1.4.

Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi................................................... 8

2.1.5.

Ứng dụng vi sinh vật vào đối kháng bệnh hại thực vật........................14

Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu............................................................ 17
3.1.

Vật liệu nghiên cứu................................................................................................... 17

3.1.1.

Nguyên liệu và địa điểm nghiên cứu............................................................... 17

3.1.2.

Thiết bị và hóa chất................................................................................................... 17

3.1.2.

Môi trường..................................................................................................................... 18

3.2.

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 20

3.2.1.

Phương pháp thu nhận và phân lập mẫu..................................................... 20

3.2.2.

Phương pháp nuôi cấy, làm thuần................................................................... 20

3.2.3.

Phương pháp giữ giống......................................................................................... 20

3.2.4.

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo..................................................................... 21

3.2.5.

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học............................................ 21

iii


3.2.6.

Phương pháp định loại nấm sợi ( Nguyễn Lân Dũng, 2006) ..............22

3.2.7.

Phương pháp tách chiết DNA tổng số............................................................ 24

3.2.8.

Vi sinh vật....................................................................................................................... 26

Phần 4. Kết quả và thảo luận................................................................................................ 29
4.1.

Kết quả phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm

linh chi.............................................................................................................................. 29
4.1.1.

Kết quả phân lập......................................................................................................... 29

4.1.2.

Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên nấm linh chi............................................ 30

4.1.3.

Định danh chủng nấm LC1.................................................................................... 32

4.1.4.

Kết quả xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng LC1
34

4.1.5.

Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng các yếu tố đến sinh trưởng của nấm LC1. 35

4.2.

Kết quả tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi

sinh vật có khả năng đối kháng với nấm lc1 gây bệnh trên nấm linh chi

trong điều kiện in vitro............................................................................................ 38
4.2.1.

Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm LC1. 38

4.2.2.

Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn
41

4.2.3.

Đặc điểm sinh lý – sinh hóa.................................................................................. 44

4.3.

Đánh giá khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh

vật đã tuyển chọn trên trực tiếp cây linh chi đã bị nhiễm bệnh.......52
4.4.

Thảo luận........................................................................................................................ 54

4.4.1.

Phân lập và nghiên cứu nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi
54

4.4.2.

Tuyển chọn vi sinh vật đối kháng với nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm

Linh chi............................................................................................................................ 55
Phần 5. Kết luận và kiến nghị.............................................................................................. 57
5.1.

Kết luận............................................................................................................................ 57

5.2.

Kiến nghị......................................................................................................................... 57

Tài liệu tham khảo...................................................................................................................... 58
Phụ lục.............................................................................................................................................. 61


iv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Kết quả phân lập nấm nấm mốc gây bệnh.......................................... 29
Bảng 4.2. Kết quả quan sát nấm LC1 gây bệnh bằng kính hiển vi..............32
Bảng 4.3. Hoạt tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm mốc xanh gây
bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
..................................................................................................................................... 40

Bảng 4.4. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc xanh gây
bệnh trên nấm Linh chi bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
..................................................................................................................................... 41

Bảng 4.5. Một số đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 116 sau 5 ngày nuôi ở 30oC
44

Bảng 4.6. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau của chủng xạ khuẩn 116
46

Bảng 4.7. Khả năng sử dụng các nguồn nitrogen khác nhau của chủng xạ
khuẩn 116

49


v


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi................................................. 7
Hình 2.2. Cấu tạo thành tế bào của nấm........................................................................ 8
Hình 4.1. Kết quả lây nhiễm nhân tạo............................................................................ 31
Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR..................................................................... 33
Hình 4.3. Kết quả xây dựng cây phân loại cho chủng LC1................................ 34
Hình 4.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm mốc LC1.......35
Hình 4.5. Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên nấm mốc xanh........................... 36
Hình 4.6. Ảnh hưởng của pH tới nấm mốc xanh..................................................... 37
Hình 4.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên nấm mốc xanh........................................ 38
Hình 4.8.

Kết quả thử hoạt tính kháng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi

của một số chủng xạ khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
....................................................................................................................................... 39

Hình 4.9. Vi khuẩn đối kháng với nấm LC1................................................................ 41
Hình 4.10. Hình thái, màu sắc khuẩn lạc chủng xạ khuẩn 116 trên môi trường

ISP2 sau 5 ngày ni cấy ở 30°C................................................................ 42
Hình 4.11. Hình thái chuỗi bào tử và hệ sợi khuẩn ty của chủng xạ khuẩn 116
.............................................................................................................................................................. 42

Hình 4.12. Hình thái, màu sắc chủng xạ khuẩn 116 ni cấy trên một số mơi trường
.............................................................................................................................................................. 44

Hình 4.13. Hình thái, màu sắc khuẩn lạc của Vi khuẩn trên mơi trường LB sau 3

ngày ni cấy ở 30°C........................................................................................ 45
Hình 4.14. Hình thái bào tử của các chủng vi khuẩn.............................................. 45
Hình 4.15. Khả năng sử dụng một số nguồn cacbon của chủng xạ khuẩn 116
.............................................................................................................................................................. 48

Hình 4.16. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của

chủng xạ khuẩn 116........................................................................................... 50
Hình 4.17. Kết quả kiểm tra ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của chủng xạ

khuẩn 116................................................................................................................. 51
Hình 4.18. Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn 116 ở các nhiệt

độ,20,30,37, 40 và 50°C..................................................................................... 53
Hình 4.19. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn ..........................53
Hình 4.20. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn...............54
Hình 4.21. Thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn 116 trên trực tiếp cây Linh chi

bị nhiễm nấm mốc xanh 55


vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

CKS

Chất kháng sinh

MT

Môi trường

VSV

Vi sinh vật

KH& KT

Khoa học và kĩ thuật

PDA

Potato Dextro Agar

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Nguyễn Thị Kiều Lan
Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng với nấm mốc

xanh gây bệnh trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro.
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu: Phân lập và nghiên cứu về nấm mốc xanh gây bệnh
trên nấm Linh chi (Ganoderma sp.) . Từ đó tuyển chọn các chủng vi sinh vật có
khả năng đối kháng mạnh với nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro. Sau đó tiến
hành thử khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của các chủng vi sinh vật đã
tuyển chọn được trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh.

Phương pháp nghiên cứu:
Tất cả thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện in vitro với đầy đủ
thiết bị, máy móc, hóa chất cần thiết và phòng cách li, từ tháng 2-9/2017.
Phương pháp phân lập, nuôi cấy, tái lây nhiễm nhân tạo, nghiên cứu
ảnh hưởng đến sinh trưởng của các yếu tố môi trường, pH, nhiệt độ, khả
năng sử dụng nguồn cacbon của nấm mốc gây bệnh. Phương pháp tách
chiết DNA và định danh chủng nấm gây bệnh.
Phương pháp hoạt hóa, ni cấy, thử khả năng đối kháng của xạ khuẩn và
vi khuẩn với nấm mốc gây bệnh bằng khuếch tán đĩa thạch. Nghiên cứu ảnh
hưởng tới sinh trưởng của xạ khuẩn, vi khuẩn qua các yếu tố: môi trường nuôi
cấy, pH, nhiệt độ, khả năng sử dụng nguồn nitrogen, khả năng chịu muối. Bố trí
thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng đối kháng của vi sinh vật đã tuyển chọn
được trong điều kiện in vitro với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây Linh chi.

Kết quả chính và kết luận:
1. Từ những mẫu nấm Linh chi Ganoderma lucidum bị nhiễm bệnh,

đã phân lập được chủng nấm mốc xanh kí hiệu LC1. Tiến hành lây nhiễm

nhân tạo thành cơng để khẳng tính gây bệnh của nấm mốc xanh LC1.
2. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng LC1 cho
thấy khuẩn lạc chủng LC1 có màu xanh, hệ sợi khí sinh, dễ phán tán bào tử. Sinh trưởng
rất tốt trên các mơi trường có nguồn đường đa (lactose, saccarose, mantose), tốt nhất

trên môi trường chứa D-glucose. Phát triển trong phổ nhiệt độ và pH
o

rộng, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 25-30 C và pH tối ưu là 5,5-6,5.

viii


3. Qua phân tích các đặc điểm sinh học kết hợp với kết quả định

danh cho thấy chủng LC1 có quan hệ họ hàng gần gũi với loài Penicillium
citrinum và chúng tôi đặt tên cho chủng này là Penicillium citrinum LC1.
4. Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn 116 và 2 chủng vi khuẩn GL01,

KCO3 đối kháng mạnh với nấm LC1 trong điều kiện in vitro.
5. Qua nghiên cứu đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn
116 có hệ sợi khí sinh phân nhánh, dạng thẳng, khơng có vách ngăn, chuỗi bào tử ngắn,
bào tử hình bầu dục chúng tơi dự đốn chủng xạ khuẩn 116 thuộc chi Streptomyces.

6. Qua thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn

116 với nấm mốc xanh trên trực tiếp cây nấm Linh chi bị nhiễm bệnh cho
thấy chủng 116 có thể năng giảm thiểu sự lây lan của vết bệnh nhưng khơng
thể diệt hồn tồn được bệnh nấm mốc xanh trên cây Linh chi bị bệnh.

ix


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Nguyen Thi Kieu Lan
Thesis title: Research on using resistant microorganisms againts Green
Mold Disease of Ganoderma sp. (Ganoderma sp.) in vitro.
Major: Biotechnology

Code: 60 42 02 01

Educational organnization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives:
Research and isolate the green mold diseases of Ganoderma sp. (Ganoderma
sp.), to select the strain of microorganisms that strongly resist to the green molds in
vitro. Experiment to test the resistance of selected strains of microorganisms
against the green mold disease directly in infected Ganoderma mushrooms.

Material and methods:
All experiments were conducted in in vitro conditions with adequate
equipment, machinery, chemicals and isolation rooms, from 2-9 / 2017.
Methods of isolation, culture, artificial re-infection, research on the influence
of environmental factors, pH, temperature on the growth, the ability to use carbon
sources of pathogenic molds, DNA extraction and identification of pathogenic fungi.

Methods of activation, culture, resistance test of actinobacteria and
bacteria against pathogenic molds by disk diffusion method. Research on the
influence of culture medium, pH, temperature, ability to use nitrogen source,
salt tolerance on the growth of actinobacteria, bacteria. Experiment designed

to test the resistance of selected microorganisms against the green mold
disease in infected Ganoderma mushrooms under in vitro conditions.

Main findings and conclusions:
1. From the specimens of infected Ganoderma lucidum. We isolated

the strain of pathogenic mold and signed LC1. Artificial reinfection
successful conducted to confirm the pathogenicity of the LC1 strain.
2. Research on morphological characteristics and biological characteristics of
LC1 showed that LC1’s colony has green color, it is aerial mycelium, spore easily
disperse. LC1 grow well in lactose, saccharose, and mantose environments, especially

on mediums containing D-glucose. Develop in wide temperature and pH
o

range, optimum temperature is between 25-30 C and optimum pH is 5.5-6.5.

x


3. By analyzing the biological characteristics associated with the

identification results, the LC1 strain closely relate to Penicillium citrinum
and we named it Penicillium citrinum LC1 .
4. An actinobacterial strain: 116 and two bacterial strains: GL01, KCO3

are selected have strongly resistance agianst to LC1 in in vitro condition.
5. By researching on the morphological and biological characteristics,

an actinobacteria strain: 116 is branched aerial mycelium , straight filaments,

aseptate hyphae, short chains of oval spores. We estimate that the
actinobacterium strain: 116 belong to the Streptomyces genus.
6. From the experiment to to test the resistance of selected

microorganisms against the green mold disease in infected Ganoderma
mushrooms under in vitro conditions. The result show that the actinobacteria
strain: 116 can reduce the spread of lesions but isn’t able to completely
eradicate the green molds disease on the infected Ganoderma mushrooms.

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nấm Linh chi, tên khoa học là Ganoderma lucidum, thuộc họ Nấm lim
(Ganodermataceae). Nấm Linh chi cịn có những tên khác như Tiên thảo,
Nấm trường thọ, Vạn niên nhung. Nấm Linh chi là một dược liệu mà con
người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc. Trong "Thần nông bản thảo" xếp
Linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm. Trong "Bản thảo
cương mục" coi Linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan),
giải độc, cường tâm, kiện não (bổ óc), tiêu đờm, lợi niệu, ích vị (bổ dạ dày);
gần đây các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật phát hiện nấm linh chi cịn có
tác dụng phịng và chống ung thư, chống lão hóa làm tăng tuổi thọ.
Ở các nước Đơng Nam Á, nhất là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài
Loan...việc nghiên cứu, phát triển và sử dụng Linh chi đang được cơng nghiệp
hóa với quy mơ rộng lớn, cả về phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ
động, chế biến và bào chế dược phẩm, đồng thời nghiên cứu hóa dược các hoạt
chất, tác dụng dược lý...Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều bệnh làm giảm chất
lượng và sản lượng gây thiệt hại đến năng suất nấm, nghiêm trọng hơn là gây
thất thu cho người trồng, đáng chú ý là bệnh nấm mốc xanh. Do đó chúng ta cần

phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc gây bệnh trên nấm Linh
chi đồng thời tìm kiếm và nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật
có khả năng đối kháng với nấm mốc xanh làm cơ sở để đưa ra giải pháp phòng
chống bệnh. Trong nền nông nghiệp hiện đại người ta sử dụng nhiều chất kháng
sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật để thay thế dần các hóa chất vốn đã rất độc hại
với con người và mơi trường. Vì thế việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học bằng
các chế phẩm sinh học là giải pháp an toàn và hiệu quả, khắc phục được nhược
điểm từ nông dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng.

Xuất phát từ những lý do trên và được sự cho phép của bộ môn
cũng như thầy hướng dẫn, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
sử dụng vi sinh vật đối kháng với bệnh nấm mốc xanh gây bệnh trên
nấm Linh chi (Ganoderma sp.) trong điều kiện in vitro”.

1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Phân lập và xác định chủng nấm mốc xanh gây bệnh trên nấm Linh chi.

1


Tuyển chọn một số vi sinh vật có khả năng đối kháng nấm
mốc xanh. gây bệnh trên nấm Linh chi và nghiên đặc điểm sinh học
của các chủng tuyển chọn được.
Đánh giá được khả năng đối kháng của vi sinh vật trên trực
tiếp cây Linh chị bị nhiễm nấm mốc xanh trong điều kiện in vitro.
1.3. YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI
Phân lập được chủng nấm mốc xanh từ các mẫu nấm Linh
chi bị nhiễm bệnh.
Lây nhiễm nhân tạo để xác định chính xác khả năng gây bệnh.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng nấm mốc xanh

gây bệnh đã phân lập.
Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng mạnh
nhất với nấm mốc xanh.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng vi sinh vật đối
kháng với nấm mốc xanh.
Xác định được khả năng đối kháng với nấm mốc xanh của
chủng vi sinh vật trên trực tiếp cây Linh chi trong điều kiện in vitro.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NẤM LINH CHI
2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) là một lồi nấm thường được
tìm thấy ở các nước Á Đông. Từ xưa đến nay, ở Trung Quốc, Nhật Bản và
một số nước châu Á khác đã sử dụng nấm Linh chi như một loại thảo
dược để giúp tăng cường sức khỏe và kéo dài tuổi thọ của con người.

Những loại nấm Linh chi được sử dụng rộng rãi trong y học
gồm: G. lucidum, G. luteum Steyaert, G. atrum Zhao, Xu and Zhang,
G. tsugae Murrill, G. applanatum (Pers.: Wallr.) Pat., G. australe (Fr.)
Pat., G. capense (Lloyd) Teng, G. tropicum (Jungh.)Bres., G. tenue
Zhao, Xu and Zhang, and G. sinense Zhao, Xu and Zhang.
Ở mỗi nơi nấm linh chi được gọi bằng nhiều tên khác nhau như

Reishi (Nhật Bản), Lingzhi (Trung Quốc), Yeongji (Hàn Quốc) và Ling-Chih
(Đài Loan). Ngồi ra cịn một số tên gọi khác như nấm vạn niên (Nhật bản)
hay nấm trường sinh (Trung Quốc). Theo hai cuốc sách rất nổi tiếng mô tả
về các loại dược thảo của Trung Quốc, “Shen Nong Ben Cao Jing” (25220 trước Công nguyên, thuộc triều đại Đông Hán) và “Ben Cao Gang Mil”

của Li Shi Zhen (1590 trước Công nguyên, thuộc triều đại nhà Minh), có 6
chủng nấm được biết đến tại thời điểm lúc bấy giờ. Trong đó có hơn 250
loại nấm Linh chi được đề cập. Tuy nhiên, trong các văn bản cổ chỉ đề cập
nhiều đến khả năng chữa bệnh của nấm Linh chi đỏ.

Từ thời cổ xưa có rất nhiều nhà nghiên cứu (cả ở Trung Quốc
và phương Tây) đã tìm hiểu về loại nấm này và họ cũng đã đưa ra
rất nhiều hệ thống để phân loại nấm Linh chi. Những nhà nghiên
cứu Trung Quốc cổ đại đã chia nấm Linh chi thành rất nhiều loại
khác nhau dựa vào quả thể cũng như hình dáng bên ngồi của nấm.
Ở phương Tây, theo bảng phân loại của Alexopolus năm 1979, Lingzhi
thuộc giống nấm Linh chi và là thành viên của họ Myceteae, lớp Basidiomycetes
chi Aphyllophorales và thuộc họ Polyporaceae. Đầu năm 1881, Karsten, nhà thực
vật học người Phần Lan, đã đưa ra đặc điểm phân loại của nấm Linh chi dựa vào

3


lớp biểu bì bên ngồi của nấm. Kể từ đó nấm Linh chi đỏ đã trở thành một đại
diện tiêu biểu cho chủng loại nấm này. Về sau, đặc điểm phân loại của nấm Linh
chi đã được thay đổi bởi một số nhà khoa học khác như Donk, Murrill, Furtano
và Steyaert, … Sau khi họ đã tìm ra những đặc tính khác của nấm Linh chi như
các bào tử của nấm Linh chi có hình quả trứng, lớp ngồi của thành tế bào
tương đối mỏng và trong suốt, ngược lại lớp trong của thành tế bào lại dày, màu
vàng nâu và có nhiều nốt nhỏ. Cũng từ đó, nấm Linh chi khơng cịn được phân
loại dựa vào màu sắc hay hình dạng bên ngồi nữa.

2.1.2. Tình hình trồng nấm Linh chi
Theo Wuang. X. J. (Chang, 1993) thì từ đầu thế kỷ 17 (1621) các loại
Nấm Linh chi đã được nuôi trồng ở Trung Quốc, chính bởi giá tri dược liệu

của chúng. Gần nay người lại tìm thấy trên núi Maiji tỉnh Gansu, một tấm bia
đá khắc năm 1124 ghi chép về nuôi trồng 38 loại nấm Linh chi. Ngày nay, thế
giới hàng năm sản xuất được khoảng 4.300 tấn, riêng Trung Hoa trồng
khoảng 3000 tấn còn lại là các nước khác như Hàn Quốc, Nhật Bản, Ðài Loan,
Hoa Kỳ, Thái Lan, Malaysia, Việt Nam, Sri Lanka và Indonesia.
Nhật bản có nghề trồng nấm truyền thống mỗi năm thu đạt gần 1 triệu
tấn nấm. Nhật Bản là nước có sản lượng nấm cao nhất thế giới. Nấm Linh chi
vẫn được coi là “thượng dược” được xếp vào hàng siêu dược liệu, trên cả
nhân sâm (Panax ginseng). Giá bán tính ra tại thị trường Nhật Bản lên tới trên
200 USD/kg thể quả khơ đóng gói. Hàn Quốc nổi tiếng với nấm Linh chi
(Ganoderma lucidum) mỗi năm suất khẩu thu về hàng trăm triệu USD. Ở
Trung Quốc từ những năm 1960 bắt đầu trồng nấm có áp dụng các biện pháp
cải tiến kỹ thuật nên năng suất tăng gấp 4-5 lần và sản lượng tăng vài chục
lần. Hàng năm Trung Quốc xuất khẩu hàng triệu tấn nấm sang các nước phát
triển thu về nguồn ngoại tệ hàng tỷ đô la. Hiện nay Trung Quốc đã dùng kỹ
thuật (Khuẩn thảo học) để trồng nấm nghĩa là dùng các loại cỏ, cây thân thảo
để trồng thay cho gỗ rừng và nguồn nguyên liệu tự nhiên ngày càng cạn kiệt.
Ở Đài Loan, Peng (1990), Hseu (1992) báo cáo đã sưu tầm, ni

trồng tới hơn 10 lồi Ganoderma khác nhau. Song Trung Quốc vẫn
được thừa nhận là trung tâm lớn nhất thế giới về nuôi trồng, sản xuất
nấm Linh chi (Zhao et Zhang, 1994). Hàn Quốc cũng chiếm một thị
phần đáng kể. Đài Loan áp dụng các kỹ thuật tiên tiến và cơng nghiệp
hóa trong nghề nấm đã có mức tăng trưởng tăng hàng trăm lần.

4


Các nước vùng Đông Nam Á gần nay cũng bắt đầu công nghệ nuôi trồng
nấm Linh chi. Malaysia chú trọng cải tiến các quy trình ni trồng nấm Linh chi

ngắn ngày trên các phế thải giàu chất xơ, thậm chí cho thu hoạch thể quả chỉ
sau 40 ngày (Teow et al., 1994). Ở Thái Lan đã có một số trạng trại cỡ vừa nuôi
trồng Ganoderma lucidum. Linh chi cũng được nuôi trồng từ 1929 ở Ấn Độ
(Bose,1929) và phát triển ở qui mô nhỏ. Ngày nay nhiều nước trên thế giới như
Thái Lan, Malaysia, Mỹ,... nuôi trồng và đã sản xuất nấm cùng các chế phẩm Linh
chi làm thuốc và dược phẩm dưỡng sinh. Hằng năm doanh thu của các chế
phẩm chống ung thư điều chế từ linh chi ở Đài Loan đạt trên 350 triệu USD.
Ở Việt Nam viện Dược liệu - Hà Nội đã trồng nấm Linh chi (giống Trung

Quốc) thành cơng vào năm 1987. Chín năm sau, các nhà khoa học thuộc Đại
học khoa học tự nhiên đã chọn được giống nấm Linh chi mọc hoang ở rừng
núi Lâm Đồng để nhân giống và đưa vào sản xuất tại trại trồng nấm Linh chi
của Xí nghiệp Dược Phẩm Trung ương 24, đạt kết quả tốt vào năm 1988.
Tại Việt Nam, Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác đã nói về Linh chi từ lâu
và Lê Q Đơn đã chỉ rõ đó là “Nguồn sản vật quý hiếm của đất rừng Đại Nam”.
Song gần nay, loài chuẩn Ganoderma lucidum mới được ni trồng thành cơng
trong phịng thí nghiệm (1978) và vào thập niên 90, Linh chi mới thật sự bùng nổ
tại TP. Hồ Chí Minh (Đỗ Tất Lợi et al., 1994), sản lượng hàng năm mới đạt khảng
10 tấn/năm (Cổ Đức Trọng, 1991, 1993). Nghề trồng nấm ở Việt Nam đang phát
triển những quy mô nhỏ lẻ hộ gia đình, trang trại mỗi năm sử dụng vài tấn
nguyên liệu có sẵn tới vài trăm tấn /1 cơ sở để sản xuất nấm.

Nhìn chung nghề trồng nấm linh chi phát triển mạnh và rộng khắp,
đem lại hiệu quả kinh tế rất lớn, nhất là trong 20 năm gần đây. Trong sinh
học nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật trong nghề nấm về chọn tạo
giống nấm, về kỹ thuật nuôi trồng và sự bùng nổ thông tin, nghề trồng
nấm đã và đang phát triển trên toàn thế giới, được coi là nghề xóa đói
giảm nghèo và làm giàu thích hợp với các vùng nơng thơn, miền núi.

2.1.3. Vị trí phân loại và đặc điểm sinh học

Linh chi (Ganoderma) có chu trình sống giống các loại nấm
đảm khác, vị trí phân loại như sau:
Ngành: Eumycote

5


Lớp: Basidiomycetes
Bộ: Polyporales
Họ: Ganodermataceae
Chi: Ganoderma
Loài: Ganoderma lucidum
Đặc điểm sinh học
*) Cấu tạo
Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi
xác lập thành một chi riêng, là Ganoderma Karst. (1881), đến nay tính ra
có hơn 200 lồi được ghi nhận, riêng Ganoderma lucidum đã có 45 thứ.

Quả thể nấm linh chi cây nấm gồm 2 phần cuống nấm và mũ
nấm (phần phiến đối điện với mũ nấm).
Cuống nấm dài hoặc ngắn hay khơng cuống, đính bên có
hình trụ đường kính 0,5-3cm. Cuống nấm cứng, ít phân nhánh, đơi
khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen,
bóng, khơng có lơng, phủ suốt lên mặt tán nấm.
Mũ nấm (tai nấm) hoá gỗ, x trịn, khi non có hình trứng, lớn dần
có hình quạt, hình bầu dục hoặc thận. Trên mặt mũ có vân gạch đồng tâm
màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu
tím, nhẵn, được phủ bởi lớp sắc tố bóng như láng vecni. Mũ nấm có
đường kính 2-15cm, dày 0,8-1,2cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc
hơi lõm. Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi

hình thành và phóng thích bào tử nấm. Bào tử nấm dạng trứng cụt với hai
lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài.
Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem, phân
chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên. Trên lát
cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng rất dày,
đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm).

Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2
- 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng,
vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm. Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng
hình chùy, khơng màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores).

6


Hình 2.1. Hình thái giải phẫu thể quả nấm Linh chi
- Phần thịt nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem - nâu nhợt - trắng kem,
phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Thấy rõ ở các lớp trên, các tia sợi hướng lên.
Trên lát cất trên giải phẫu hiển vi, chỉ thấy đầu trên các sợì phình hình chùy, màng
rất dày, đan khít vầo nhau, tạo thành lớp vỏ láng (dày khoảng 0,2 - 0,5 mm).

- Tầng sinh sản (bào tầng - thụ tầng - hyménium) là một lớp ống dày từ 0,2
- 1,8 cm màu kem - nâu nhạt gồm các ống nhỏ thẳng, miệng gần tròn, màu trắng,
vàng chanh nhạt, khoảng 3 -35 ống/mm. Đảm đơn bào (holobasidie) hình trứng
hình chùy, khơng màu dài 16 - 22 |nm, mang 4 đảm bào tử (basidiospores).

*) Thành phần hóa học và của nấm Linh chi
Theo Wachtel-Galor et al. (2011), loại nấm này có thành phần hoạt chất sinh
học khá đa dạng, chứa vitamin, khống chất, có tất cả acid amin thiết yếu (đặc biệt
giàu leucine và lysine). Hàm lượng chất béo thấp và tỉ lệ acid béo khơng no cao là

một trong những tính chất quan trọng tạo nên giá trị cho nấm Linh chi.

Không như nhiều lồi nấm khác có hàm lượng nước đến 90%, nấm
Linh chi tươi chỉ chứa khoảng 75% nước. Thành phần chủ yếu của G.
lucidum là chất xơ, carbohydrate, chất béo và protein, trong đó tỉ lệ xơ thơ là
trên 50% khối lượng khô (Mau et al., 2001; Wasser, 2010). Các nghiên cứu
cho thấy thể quả, khuẩn ty và bào tử của nấm có chứa khoảng 400 hoạt chất
sinh học khác nhau, chủ yếu là các polysaccharide, triterpenoid, nucleotide,
acid béo, sterol, steroid, protein/peptide, các nguyên tố vi lượng.

7


Trong nghiên cứu của Mizuno (1995), chiết xuất G. lucidum chứa các kim
loại như kali, magnesi, calci, natri, sắt, kẽm, mangan, đồng, selenium và
germanium; trong đó kali, magnesi, calci là những thành phần kim loại chính, và
germanium đứng thứ 5 trong số các kim loại có hàm lượng cao nhất (489 µg/g).

Polysaccharide và triterpenoid được xem là những hoạt chất quan
trọng nhất trong Linh chi (Skalicka-Woźniak et al., 2012; Wasser, 2010).
Dựa vào nhiều kết quả nghiên cứu, Wachtel-Galor et al. (2011) nhận
định rằng trong G. lucidum cịn có các hợp chất khác được xem là có tác
dụng dược lý như một số protein và lectin. Các protein có hoạt tính sinh học
đã được phát hiện bao gồm: Ling Zhi-8; G. lucidum peptide có hoạt tính bảo
vệ gan và chống oxy hóa; ganodermin có tác dụng kháng nấm từ thể quả G.
lucidum. Một số lectin được tách chiết từ thể quả và khuẩn ty của Linh chi có
khả năng làm đơng tụ hồng cầu hoặc tăng cường chức năng miễn dịch. Các
thành phần khác gồm enzyme như metalloprotease làm chậm quá trình đơng
máu; tác nhân ức chế α-glucosidase rất đặc hiệu từ thể quả của Linh chi,...

*) Cấu tạo thành tế bào của nấm
Thành tế bào nấm được câu tạo từ β-(1,3)-glucan , Mannoprotein và chitin

Hình 2.2. Cấu tạo thành tế bào của nấm
Nguồn: Carmen Sánchez (2016)

8


Thành tế bào tạo thành cấu trúc hỗ trợ và bảo vệ tế bào, ngồi
ra nó cịn hoạt động với chức năng lọc. Một chức năng quan trọng
của thành tế bào là hoạt động như một nồi áp suất, ngăn chặn sự
giãn nở quá mức khi nước đi vào tế bào (Carmen Sánchez, 2016).
2.1.4. Các bệnh thường gặp trong trồng Linh chi
Nấm Linh chi cũng như bất kì loại cây trồng nào đều có thể mắc phải nhiều
loại bệnh khác nhau do các nguyên nhân như sâu bệnh hại, bệnh nhiễm do

vi khuẩn, virus và nấm bệnh. Kết quả sẽ đẫn tới giảm chất lượng và

sản lượng nấm, nghiêm trọng hơn là gây thất thu cho người trồng.
Theo trung tâm ứng dụng tiến bộ KH& KT Quảng Trị, sâu bệnh
và một số loài động vật hại nấm bao gồm các nhóm sau:
Nhóm động vật hại nấm: Chuột, sên, ốc, mối, kiến. Để phòng
trừ các tác nhân gây hại này chúng ta chỉ có cách đánh bẫy, bả
chuột, rắc hố chất xua đuổi mối, kiến, gián, sên, ốc.
Rệp (Mites- bọ mạt) có kích thước rất nhỏ như hạt bụi, có màu
trắng nhạt, chúng sinh sản rất nhanh theo kiểu bọc ấu trùng, chúng
cắn sợi nấm và hút chất dinh dưỡng của sợi, quả thể làm chết sợi
và quả thể không lớn được, gây mất mùa tới 100%.
Các loại ruồi nấm: Ruồi nhỏ (Mycophila fungicola) kích thước

dài 1,0 - 1,2mm. và ruồi lớn (Drosophila immigrans) thân dài 3 - 4mm
sải cánh 7 - 9mm. Ấu trùng của ruồi ăn sợi nấm, con trưởng thành
chích hút vào mũ nấm làm nấm có các vết đen, ăn sâu vào mũ nấm.
Tuyến trùng (Nematodes) như 1 loại giun chỉ rất nhỏ chỉ dài khoảng
1mm, thường ở trong đất ẩm hoặc nước bẩn. Có 2 loại tuyến trùng: tuyến
trùng ký sinh trên hệ sợi nấm và tuyến trùng gây thối nhũn nấm. Tuyến
o

trùng chịu nóng yếu sẽ bị chết 100% ở nhiệt độ 60 C là 1 phút.

Sâu bệnh hại nấm chủ yếu là các loại côn trùng, rệp, nhện gây
tác động cơ học làm hư hại sợi nấm và quả thể không thể dùng các
loại thuốc trừ sâu như ở các loại cây trồng khác. Biện pháp chủ yếu
là phòng ngừa bằng cách giữ vệ sinh nhà nuôi trồng nấm. Cách ly
nguồn lây nhiễm sâu bệnh để hạn chế thiệt hại ở mức thấp nhất.
Hệ sợi và phát triển hình thành quả thể của nấm Linh chi phụ thuộc nhiều vào
các điều kiện sinh thái. Hình thái và năng suất nấm phụ thuộc vào giống nấm

9


và điều kiện nuôi trồng. Gặp điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO 2, pH bất lợi,
sợi nấm và quả thể nấm đều có phản ứng sinh bệnh nên người ta gọi loại bệnh
này là bệnh hại sinh lý của nấm. Bệnh hại sinh lý là loại bệnh khơng kèm theo
mầm bệnh xảy ra trong q trình ni trồng. Bệnh hại sinh lý của nấm xảy ra
trong giai đoạn sợi nấm phát triển hay giai đoạn hình thành quả thể. Bệnh chết
sợi giống biểu hiện khi giống nấm cấy vào các túi giống đã hấp khử trùng sau
một thời gian từ 3-5 ngày nuôi sợi không thấy giống ở các túi nấm khơng có hiện
tượng bung sợi hoặc sợi mọc nhưng không bám vào cơ chất. Nếu kéo dài thời
gian, hạt có sợi giống sẽ bị mốc xanh hoặc nhũn nát, khơng cịn màu trắng của

sợi giống nấm ban đầu. Có nhiều nguyên nhân làm chết sợi giống trong đó chủ
yếu là cơ chất khơng thích hợp, trong bịch cơ chất đã bị nhiễm khuẩn, có độc tố,
bịch nấm bị nhiễm mốc sinh nhiệt CO2, cơ chất quá khô hoặc quá ướt. Biện pháp
khắc phục là kiểm tra nguồn nguyên liệu và quá trình chế biến, thực hiện đúng
quy trình hấp khử trùng túi giá thể và che chắn khu vực ươm sợi nếu nhiệt độ
quá lạnh hoặc thơng thống nếu nhiệt độ q nóng. Bệnh sợi nấm mọc yếu,
nhanh chóng lão hóa được biểu hiện sợi giống nấm phát triển nhanh, hệ sợi
mảnh, mờ nhạt, không mọc sâu vào cơ chất (cơ chất không chuyển màu) hoặc
nhanh chóng kết sợi xù lên như bơng. Do cơ chất quá ẩm hoặc quá khô, một
nguyên nhân khác là do giống quá yếu do quá trình nhân giống các cấp giống
gốc bị nhân chuyền nhiều lần hoặc dovận chuyển, bảo quản không tốt giống bị
giảm sinh lực. Biện pháp khắc phục kiểm tra độ ẩm nguyên liệu cẩn thận trước
khi đóng túi, xử lý ngun liệu đúng quy trình kỹ thuật, chọn giống tốt, đảm bảo
yêu cầu chất lượng. Bệnh sợi nấm bị co sợi ban đầu sợi giống bung sợi và sinh
trưởng bình thường, nhưng khi sợi mọc gần đến đáy túi thì dừng lại, khơng mọc
tiếp và chuyển sang màu trắng thạch cao. Do độ ẩm trong cơ chất quá cao
thường đọng ở đáy bịch nấm, cơ chất bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó q trình xử
lý ngun liệu cho liều lượng vôi quá cao cũng là nguyên nhân gây ra tình trạng
co sợi. Biện pháp khắc phục có thể lật ngược túi nấm hoặc dùng kim chọc túi tại
chỗ đọng nước để nước chảy ra ngoài.
Các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển
hình thái quả thể nấm Linh chi. Nhiệt độ thích hợp cho việc nấm ra quả thể dạng
0

0

hình trứng là 20-35 C, tốt nhất là 30 C (Wagner et al., 2003), trong giai đoạn này,
nếu nhiệt độ thay đổi lạnh đột ngột thì tồn bộ quả thể sẽ ngừng phát triển, teo
đầu và trở nên khô cứng và có màu vàng nâu. Vì vậy cần chọn tạo giống

10