Thử nghiệm khả năng kháng nấm saprolegnia ký sinh trên cá chép (cyprinus carpio) của một số hóa chất trong phòng thí nghiệm luận văn tốt nghiệp đại học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
------***------

TRẦN THỊ HIỀN

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG
NẤM Saprolegnia KÝ SINH TRÊN CÁ CHÉP
(Cyprinus carpio) CỦA MỘT SỐ HĨA CHẤT
TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

VINH - 2011

i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
------***------

THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KHÁNG
NẤM Saprolegnia KÝ SINH TRÊN CÁ CHÉP
(Cyprinus carpio) CỦA MỘT SỐ HĨA CHẤT
TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Người thực hiện: Trần Thị Hiền
Lớp:

48K1- NTTS

Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Vân
ThS. Nguyễn Thị Thanh

VINH - 2011

ii


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực tập tốt nghiệp vừa qua, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp
đỡ của rất nhiều cá nhân và tập thể, qua đây tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất
cả sự quan tâm và giúp đỡ đó.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc đến cơ giáo Th.s Nguyễn Thị
Thanh người đã quan tâm chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện
luận văn tốt nghiệp.
Trong q trình thực hiện luận văn tơi ln nhận được sự quan tâm chỉ bảo tận
tình của Ts. Phan Thị Vân, Kỹ sư Nguyễn Thị Nguyện, Th.s Võ Anh Tú. Tôi xin
được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới sự giúp đỡ đó.
Tơi xin cảm ơn Trường Đại Học Vinh cùng tồn thể các thầy cơ giáo khoa
Nông Lâm Ngư Trường Đại Học Vinh đã tham gia giảng dạy giúp đỡ tơi trong q
trình học tập của mình.
Tơi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo cùng tồn thể các cô, các anh, chị thuộc
Trung tâm nghiên cứu quan trắc, cảnh báo mơi trường và phịng ngừa dịch bệnh thủy
sản khu vực miền Bắc - Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, đã tạo cơ sở vật chất và
nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện nội dung đề tài tốt nghiệp.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các bạn của tôi, những người đã động viên và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học xa nhà. Lòng biết ơn sâu sắc nhất con xin gửi tới
bố mẹ cùng anh chị em trong gia đình, những người đã chăm sóc chu đáo, ni dạy
và dành cho con những tình cảm tốt đẹp trong cuộc sống.
Vinh, tháng 07 năm 2011
Sinh viên
Trần Thị Hiền

iii


MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN..................................................................................................iii
TÀI LIỆU THAM KHẢ0................................................................................40
Tài liệu tiếng Việt............................................................................................40

iv


DANH MỤC VẾT TẮT
Vasep:

Hiệp hội xuất khẩu thủy sản Việt Nam

ctv:

Cộng tác viên

&:

Và

NTTS:

Nuôi trồng thủy sản

H2O2 :

Hydrogen Peroxide

PVP – Iodine:

Polyvinyl - Pyrvidone Iodine

TCCA:

Viên sủi VICATO khử trùng

NĐ:

Nồng độ

NSC:

Nguyên sinh chất

ĐVTS:

Động vật thủy sản

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
Bảng 3.1.

Nội dung
Đường kính khuẩn lạc nấm sau thời gian nuôi cấy ở các mức nhiệt độ

Tran
g
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Bảng 3.2

Kết quả sàng lọc nồng độ của các loại hóa chất

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Bảng 3.3.

Khả năng diệt nấm Saprolegnia parasitica của Castellani

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Bảng 3.4.

Khả năng diệt nấm Saprolegnia parasitica của PVP – Iodine

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Bảng 3.5

Khả năng diệt nấm Saprolegnia parasitica của Acid acetic

found
Error:
Refer

ence

vi


sourc
e not
Khả năng diệt nấm Saprolegnia parasitica của TCCA nồng độ
0,2ppm - 0,6ppm

Bảng 3.6a

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Khả năng diệt nấm Saprolegnia parasitica của TCCA nồng độ
4ppm - 8ppm

Bảng 3.6b

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Bảng 3.7

Tỷ lệ sống của cá Chép sau thí nghiệm

vii

found
39


DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Hình 1.1

Nội dung
Sợi nấm Saprolegnia sp

Trang
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Hình 2.1

found
Error:

Quy trình phân loại nấm

Refer
ence
sourc
e not
Hình 2.2

Sơ đồ nghiên cứu thử nghiệm khả năng diệt nấm của hóa chất

found
Error:
Refer
ence
sourc
e not

Hình 3.1
Hình 3.2.
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10.
Hình 3.11.
Hình 3.12
Hình 3.13

Tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc nấm
Đặc điểm hình thái sợi nấm
Sự hình thành túi bào tử
Quá trình tạo các bào tử riêng biệt
Q trình giải phóng bào tử
Động bào tử sơ cấp
Sự phát triển của bào tử
Q trình hình thành bào tử hữu tính
Sự phát triển của bào tử hữu tính
Hiệu quả diệt nấm của hóa chất thí nghiệm sau 24 giờ
Hiệu quả diệt nấm Saprolegnia parasitica của Castellani
Hiệu quả diệt nấm Saprolegnia parasitica của PVP – Iodine
Hiệu quả diệt nấm Saprolegnia parasitica của Acid acetic

viii

found
19
20
21
22
22
23
24
25
26
29
31
33

35


Hình 3.14

Hiệu quả diệt nấm Saprolegnia parasitica của TCCA

ix

38


MỞ ĐẦU

Ni trồng thủy sản ngày càng có vị trí quan trọng trong ngành kinh tế của
nước ta, theo hiệp hội xuất khẩu thủy sản Việt Nam (Vasep) trong năm 2010, ngành
thủy sản Việt Nam đã thiết lập kỷ lục mới với kim ngạch xuất khẩu trên 5 tỷ USD.
Cả nước đã xuất khẩu trên 1,35 triệu tấn thủy sản, trị giá trên 5,03 tỷ USD, tăng
11,3% về khối lượng và 18,4% về giá trị so với năm 2009, đây là một trong ba ngành
có đóng góp lớn nhất cho kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam [26].
Trong những năm gần đây ngành thủy sản đã chủ động hơn trong việc tạo ra
con giống, xây dựng được quy trình sản xuất các loại cá theo ý muốn và đáp ứng đủ
nhu cầu con giống phục vụ cho nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên sự phát triển của công
nghệ sản xuất giống còn thiếu quy hoạch đồng bộ, kỹ năng về quản lý môi trường và
dịch bệnh chưa đạt yêu cầu, trong những năm gần đây bệnh trên cá nước ngọt và
trứng của chúng đã xuất hiện nhiều vùng trong cả nước gây nhiều tổn thất cho phong
trào nuôi cá nước ngọt.
Nấm là một trong những tác nhân bệnh gây ảnh hưởng lớn về kinh tế trong
các trại sản xuất cá giống. Bệnh nấm xảy ra ở nhiều loài cá nước ngọt và trứng cá,
bệnh có thể gặp ở khắp mọi nơi trên thế giới và trứng của chúng, Saprolegnia sp là

một trong những tác nhân gây bệnh nấm cá nghiêm trọng, gây ra tổn thất hàng triệu
đô la cho các trại sản xuất cá giống trên thế giới [23]. Trong các lồi cá ni phổ biến
ở Việt Nam như cá Chép, cá Mè, cá trắm Cỏ, cá Trơi… đều có thể bị nhiễm nấm,
Saprolegnia sp kí sinh gây chết trứng các loài cá nước ngọt, đặc biệt là trứng cá Chép
(Cyprinus carpio) chịu ảnh hưởng rất lớn của loại bệnh này. Trong thực tế nếu khơng
có biện pháp thích hợp để phịng trị bệnh thì hiệu quả của các đợt sinh sản nhân tạo
cá Chép thường rất thấp do tác hại của Saprolegnia sp gây ra [3].
Trước đây, Xanh malachite là loại hóa chất đặc hiệu có tác dụng trong việc
phòng trị bệnh do Saprolegina sp gây ra. Tuy nhiên, từ năm 2002 Xanh malachite bị
cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản vì Xanh malachite được biết là loại hóa chất có
ảnh hưởng xấu đến mơi trường và sức khỏe con người, có thể gây đột biến gen và gây

1


ung thư. Ngồi xanh Malachite thì formalin cũng có tác dụng tốt trong việc xử lý nấm
nhưng gần đây chất này cũng bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản do chúng
cũng là hóa chất làm ảnh hưởng đến sức khỏe động vật thủy sinh [16]. Chính vì vậy
khi cá nhiễm nấm sẽ gặp nhiều khó khăn trong việc trị bệnh.
Trước tình hình đó việc nghiên cứu, tìm hiểu một số loại hóa chất có khả
năng diệt nấm trong ni trồng thủy sản an tồn hơn với động vật nuôi và con
người ngày càng trở nên cấp thiết hơn nhằm mục đích phát triển ni trồng thủy sản
bền vững.
Xuất phát từ những lý do trên tôi thực hiện đề tài: “Thử nghiệm khả năng
kháng nấm Saprolegnia ký sinh trên cá Chép (Cyprinus carpio) của một số hóa
chất trong phịng thí nghiệm”.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hóa chất với nồng độ phù hợp có khả năng diệt nấm Saprolegnia
ký sinh gây bệnh trên cá chép.

2


CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm sinh học của nấm Saprolegnia sp gây bệnh trên cá nước ngọt
• Hệ thống phân loại
Ngành:

Eumycota

Lớp:

Oomycetes

Bộ:

Saprolegniales
Họ:
Giống:

Saprolegniaceae
Saprolegnia

• Hình thái cấu tạo
Saprolegnia là nấm dạng sợi thuộc nhóm nấm bậc thấp, cấu tạo sợi nấm đa
bào nhưng khơng có các vách ngăn, có phân nhánh và chia làm 2 phần, một phần gốc
bám chắc vào cơ thể cá, phần ngọn tự do ngồi mơi trường nước. Nấm có khả năng
sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau: Sinh sản dinh dưỡng bào tử, sinh sản vơ

tính bằng túi bào tử, sinh sản hữu tính bằng tiếp hợp. Bào tử nấm có tiên mao, có thể
vận động trong nước nên khả năng lây lan bệnh rất cao [9].

Hình 1.1. Sợi nấm

Saprolegnia sp
[29]

3


• Hình thức sinh sản
+) Sinh sản sinh dưỡng
Bằng cách phát triển ở đầu mút của khuẩn ty hình thành các bào tử màng dày, các
hạch nấm các tế bào này đứt ra khỏi cơ thể mẹ và phát triển thành sợi nấm mới [9].
+ )Sinh sản vơ tính
Trong q trình sinh sản vơ tính bắt đầu từ túi bào tử hình thành các bào tử
động riêng biệt được giải phóng ra ngồi bơi vận động tự do trong mơi trường sau đó
chuyển qua giai đoạn đứng yên để chuyến sang dạng bào tử hình quả thận vận động
sau một thời gian bào tử nảy mầm phát triển thành sợi nấm, khi chất dinh dưỡng đầy
đủ đỉnh đầu sợi nấm phồng lớn các nguyên sinh chất bắt đầu tập trung ở phần đỉnh và
xuất hiện vách ngăn, ngăn cách giữa nơi tập trung nguyên sinh chất và phần ngoài sợi
nấm để hình thành túi bào tử, hồn thành q trình sinh sản [9].
+ )Sinh sản hữu tính
Trong sinh sản hữu tính giao tử đực và giao tử cái có thể cùng xuất hiện trên một
sợi nấm hay hai sợi nấm khác nhau tùy thuộc vào từng loài. Giao tử đực hình trụ có một
số nhánh gọi là vịi thụ tinh có nhiều nhân và cũng được tách khỏi sợi nấm bằng vách
ngăn. Khi các giao tử đực bám vào túi nỗn thì vách ở chỗ tiếp xúc tan đi, nhân và nội
chất của túi tinh đổ sang túi noãn. Nhân của noãn cầu kết hợp với một nhân của túi tinh
tạo thành hợp tử. Hợp tử sau một thời gian nghỉ thì phát triển thành thể sinh động bào tử.

Trong thể sinh động bào tử nhân phân chia giảm nhiễm và hình thành nên các động bào
tử, các động bào tử phóng thích ra phát triển thành sợi nấm [9].
1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh nấm ở cá nước ngọt trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh nấm ở cá nước ngọt trên thế giới
Trong các tác nhân gây bệnh cho động vật thủy sản thì nấm được coi là
nguyên nhân đứng thứ 2 chỉ sau vi khuẩn, gây ra những tổn thất kinh tế trong ni
trồng thủy sản, có thể gây ra những hậu quả nặng nề, trứng và cá bột bị nhiễm nấm sẽ
làm giảm đáng kể tỷ lệ trứng nở và cá giống. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã khẳng
định nấm Saprolegnia sp là một trong những loài nấm gây bệnh cơ hội nguy hiểm
cho các loài cá ở giai đoạn giống và cá trưởng thành, chúng tấn công khi sức đề

4


kháng của cá yếu, cá bị thương tổn, bị các tác nhân gây bệnh khác xâm nhập và các
yếu tố môi trường thay đổi bất lợi cho cá. Năm 1963, Monsma đã làm một chuỗi thí
nghiệm gây nhiễm 4 giống nấm lên trứng và cá khỏe của 2 loài cá hồi nuôi
(Micropterus dolomieu và Lepomis pallidus). Kết quả là trứng và cá khỏe thí nghiệm
khơng bị nhiễm nấm. Sau khi gây nhiễm khơng thành cơng tác giả tiến hành thí
nghiệm gây nhiễm nấm trên những con cá nuôi đã được tạo các vết thương nhân tạo,
kết quả là tất cả cá thí nghiệm đều bị nhiễm nấm [6]. Nghiên cứu của Rechenbach Klinke (1966) cho rằng nấm bậc thấp thường gây ra các bệnh trên cá nước ngọt, khi
cá đã bị suy nhược hoặc tổn thương mới bị mắc bệnh vì trên da cá khoẻ mạnh thì các
bào tử nấm không thể nảy mầm được. Trong số tác nhân gây bệnh thì Saprolegnia và
Achlya là giống nấm thường hay bắt gặp nhất [8]. Vào năm 1969, Willoughby đã tìm
hiểu một số bệnh thường gây chết cá hồi ở Scotlen, Italia, ngun nhân chính là do
một số lồi Saprolegnia sp. Bệnh thối mang ở cá hồi cũng do Saprolegnia sp gây ra
[15]. Thí nghiệm gây nhiễm nấm Achlya và Saprolegnia trên cá Lebistes reticlatus,
Xiphophorus helleri bị rạch vết thương trước khi gây nhiễm của Norland và Tintigner
(1973) cho thấy 75% cá bị nhiễm nấm trong lơ thí nghiệm [7]. Tuy nhiên thí nghiệm
của Nish (1976 & 1997) khi gây nhiễm nấm Saprolegnia lên cá hồi đã khẳng định vết

thương không phải là điều kiện chủ yếu cho sự lây nhiễm nấm mà còn do một vài
nhân tố khác làm suy yếu cơ chế phòng thủ tự nhiên của cá tạo điều kiện cho nấm
xâm nhập như stress, mật độ nuôi dày hay bị sốc nhiệt. Ngồi ra khi bỏ đói cá hồi
trưởng thành kết hợp với các nhân tố trên càng làm cho cá dễ dàng bị nhiễm nấm.
Năm 1980, Nish và Hughes nhấn mạnh hơn nữa tầm quan trọng của stress trong việc
gây nhiễm nấm trên cá [6]. Có nhiều giống lồi nấm có khả năng gây bệnh trên cá
như Branchiomyces, Democystidium, Allomyces, Letolegnia, Achlya... Tuy nhiên gây
bệnh trên cá và trứng cá nước ngọt thường là nấm thuộc bộ mốc nước
(Saprolegniales) thuộc lớp nấm nỗn (Oomycetes). Trong đó quan trọng là họ
Saprolegniaceae rất phổ biến trong môi trường nước cả ở dạng ký sinh và hoại sinh
trên cá, Saprolegniaceae gây thiệt hại nghiêm trọng trên nhiều loài cá nước ngọt đặc
biệt là giai đoạn ấp trứng [12].

5


Theo Kishio Hatai và cộng sự (1980) cho rằng Saprolegnia sp là tác nhân gây
bệnh chính trong q trình xảy ra dịch do sự nhiễm nấm xuất hiện trên cá hồi nước
ngọt và trứng của chúng tại một số trại sản xuất giống ở Hokkaido (Nhật Bản).
Nhiễm Saprolegnia sp là một trong những vấn đề quan trọng bởi chúng gây chết với
tỷ lệ lớn ở các ao nuôi cá hồi, nghiên cứu của Neish và Hughes (1980), Alderman
(1982) đã chỉ ra rằng Saprplegnia sp thường xuyên xuất hiện ở nhiều loài cá hồi ở
giai đoạn trưởng thành và trên trứng của chúng [17]. Nghiên cứu của Hatai và
Hasbiai (1993) cho rằng các tác nhân gây bệnh nấm cá chủ yếu là nấm Saprolegnia,
Achlya do tốc độ phát triển nhanh trên bề mặt trứng đặc biệt là những trứng không
được thụ tinh từ đó làm lây nhiễm sang những trứng khác. Đối với những cá giống và
cá trưởng thành khi bị sốc do điều kiện môi trường, nhiệt độ thấp Saprolegnia có khả
năng xâm nhập vào các cơ cá phá hủy cấu trúc mô cơ của cá. Trong một nghiên cứu
khác của chính tác giả cũng đã cho rằng bệnh nấm do Saprolegnia sp đã gây chết cá
với tỷ lệ chết cao, được ghi lại lần đầu tiên ở cá hồi trong thủy vực nước ngọt tại một

trại nuôi ở quận Myagnia, Nhật Bản. Cũng tại đây vào năm 1994, tác giả đã chỉ ra
rằng tỷ lệ chết hàng năm ở cá hồi Coho (Oncorhynchus kisutch Walbaum) do
Saprolegnia parasitica Coker gây ra lên tới 50% [13]. Willoughby (1994) cho rằng
loài Saprolegnia sp gây ra hiện tượng ”winter kill”, xảy ra khi thời tiết lạnh, lúc đó
bào tử động của Saprolegnia sp được sinh sản nhanh hơn [27]. Hatai và Yuasa (1995)
đã nghiên cứu mối quan hệ giữa đặc điểm sinh học và khả năng gây bệnh của nấm
Saprolegnia trên cá hồi vân đã định danh được 2 loài Saprolegnia parasitica và
Saprolegnia diclina và khẳng định rằng sự nhiễm nấm Saprplegnia đặc biệt là S.
parasitica Coker, S. diclina Humphrey ngoài sức đề kháng của cá yếu, cá bị thương
tổn, bị các tác nhân gây bệnh khác xâm nhập và các yếu tố mơi trường thay đổi bất
lợi cho cá thì sự nhiễm nấm Saprolegnia ở cá nước ngọt cịn có liên quan đến ký chủ
đặc trưng, chúng chỉ xảy ra trên những loài cá nhất định [24].
Tại Nepal nấm là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng đối với giai đoạn ấp nở trứng
cá hồi, lồi nấm thường gặp nhất đó là Saprolegnia sp, chúng xuất hiện như đám bông
và lan nhanh trên tồn bộ cơ thể, khi bị bệnh nặng có thể gây chết cá [22]. Ở miền Bắc

6


Canada vào năm 2000 xảy ra một đợt bùng phát tự nhiên do nấm đã làm chết một số
lượng lớn cá hồi vân và tác động đến sự sống của đàn cá. Bệnh nấm cá được gọi là
Saprolegniosis, bệnh gây ra chất lượng thịt kém, cá nuôi và cá tự nhiên kém ăn [10].
Moratada M. A. Hussein, Kishio Hatai và Tetsuichi Nomura (2001) đã tìm thấy bệnh
nấm Saprolegniosis ở trứng và cá hồi nuôi (Salmoinds) tại một trại sản xuất giống ở
Hokkaido, Nhật Bản. Hầu hết các trường hợp ban đầu đều có biểu hiện lâm sàng ở đặc
điểm sinh học đó là sự phát triển của sợi nấm trên bề mặt cơ thể cá đặc biệt là ở đầu,
vây và đi nhưng khơng thấy sự có mặt của nấm bên trong các cơ quan nội quan. Có
33 mẫu được phân lập từ những vết thương trên đều nhiễm nấm thuộc họ Saprolegnia.
Căn cứ vào hình thái học và đặc điểm sinh học đã kết luận được 15 mẫu nhiễm
Saprolegnia parasitica, 16 mẫu nhiễm Saprolegnia salmonis và 2 mẫu nhiễm

Saprolegnia australis [17]. Năm 2001, nghiên cứu của Bazyli Czeczuga và ctv đã tìm
thấy 127 lồi nấm nước, trong đó có 28 loài được biết là ký sinh trên cá nước ngọt, chủ
yếu là thuộc giống Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces [12].
Vào năm 2003 Chukanhom & Hatai đã chỉ ra rằng bệnh do nấm thường xuyên
xảy ra ở giai đoạn trứng trên nhiều lồi cá khác nhau. Trong q trình ấp trứng nếu bị
nhiễm nấm thì trứng sẽ bị hỏng (ung) và tỷ lệ trứng hỏng đôi khi lên đến 80% - 100%
[11]. Theo tài liệu về hội chứng dịch bệnh lở loét ở cá trong chương trình dự án phát
triển của FAO khẳng định rằng nấm ln được coi là có vai trò quan trọng trong
nguyên nhân tổng hợp của hội chứng dịch bệnh lở loét (EUS). Những giống nấm có
liên quan đến các biểu hiện của EUS như Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces, tuy
nhiên Saprolegnia là phổ biến nhất có liên quan đến lở loét da. Những cá đang ở giai
đoạn sớm của bệnh hoặc ở giai đoạn vết thương đang lành thì khó có thể phân lập
được nấm [25].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh nấm ở cá nước ngọt tại Việt Nam
Hiện nay ở Việt Nam bệnh ở động vật thủy sản đã được đi sâu nghiên cứu,
cùng với các tác nhân gây bệnh là virus, vi khuẩn, ký sinh trùng thì nấm cũng đã
được nghiên cứu nhiều.

7


Hà Ký (1967) đã kiểm tra thấy nấm thủy my trên trứng cá Chép tại trại ni cá
nước ngọt Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc Ninh và trại cá Thanh Liệt - Hà Nội. Năm 1996
tại viện nghiên cứu NTTS I bộ môn Bệnh động vật thủy sản đã đi sâu nghiên cứu tác
nhân gây bệnh nấm cho động vật thủy sản và đã phân lập được nấm gây bệnh cho cá
nước ngọt chủ yếu là Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces [4].
Nguyễn Thị Hà (1997) trong “Điều tra nghiên cứu bệnh nấm ở cá trắm cỏ
Ctenopharygodon idellus nuôi ở vùng Tiên Sơn, Bắc Ninh” đã xác định được 3 giống
nấm là Saprolegnia, Achlya, Branchiomyces. Trong đó, nấm Saprolegnia nhiễm trên
trứng là 52,5%, Achlya chiếm 47,5% thường thấy trên cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ, lở

loét. Tỷ lệ nhiễm nấm Branchiomyces sp trên cá hương là 50%, cá giống là 46,7%
[6]. Nghiên cứu của Bùi Quang Tề (1998) đã phân lập được 51 mẫu cá nhiễm nấm từ
68 mẫu cá trắm cỏ thu từ các địa phương với tỷ lệ nhiễm 75%, từ 140 mẫu cá trắm cỏ
nuôi ở Viện Nghiên cứu NTTS I đã phân lập được 114 mẫu cá nhiễm nấm với tỷ lệ
nhiễm 74,3%. Các giống nấm đã phân lập được là Saprolegnia sp, Achya sp,
Aphanomyces sp, Phoma, Pythium…[1]. Theo điều tra của bộ môn Bệnh cá Viện
Nghiên cứu NTTS I từ năm 1999 - 2002 ở các tỉnh phía bắc và ven biển miền Trung
kết quả ở các lồi cá nước ngọt như trắm Cỏ, cá Chình, cá Trê, cá Chép, Mirigal,
phân lập được các giống chủ yếu là Aspergillus, Saprolegnia chúng gây thiệt hại rất
lớn cho người ni [6].
Các nghiên cứu của Đỗ Thị Hịa và ctv (2004) cho thấy tại Việt Nam đã xuất
hiện hội chứng lở loét trên cá nuôi và cá tự nhiên ở hầu hết các địa phương khác nhau
từ năm 1990, Saprolegnia gây ra bệnh nấm thủy my trên cá nước ngọt, thường phát
triển vào mùa nhiệt độ thấp (18 - 25oC), gây chết trứng của các loài cá nước ngọt, đặc
biệt là trứng cá Chép (Cyprinus carpio), hiệu quả của các đợt sinh sản nhân tạo cá
Chép thường rất thấp do tác hại của nấm thuỷ my. Trứng cá bị nhiễm nấm thuỷ my
thường chết (ung), với nhân trứng chuyển sang màu trắng đục, nếu khơng có tác động
kịp thời có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ cá bột, hoặc đơi khi phải xố bỏ hồn tồn.
Ngồi ra cịn gây bệnh trên nhiều loài cá nước ngọt như cá Chép, cá Mè, cá Trắm Cỏ,
cá Trôi [3].

8


Theo nghiên cứu của Lê Văn Khoa (2006), đã khẳng định Saprolegnia là một
loài nấm gây bệnh phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, gây bệnh nấm thuỷ my ở cá
nước ngọt, bệnh rất dễ lây lan, khó phát hiện và gây thiệt hại lớn cho người ni [5].
1.3. Tình hình nghiên cứu hố chất để phịng trị bệnh do nấm trên cá nước ngọt
Trước đây cá nhiễm nấm Saprolegnia được điều trị bởi Xanh malachite, một
chất nhuộm hữu cơ được xem là rất hiệu quả để diệt các mầm bệnh. Willoughby và

Roberts (1992), Schreier và ctv (1996), khi thực hiện kiểm tra hiệu quả các loại
thuốc diệt nấm trên động vật thủy sản và đối với môi trường các tác giả đã kết luận
Xanh malachite và Formalin là những thuốc diệt nấm cá mạnh nhất tuy nhiên chúng
có ảnh hưởng cấp tính trên hệ sinh thái thủy sản. Cịn Fitzpatrick và cộng sự (1995)
thì cho rằng với giải pháp 37% Formaldehyde có hiệu quả trong điều trị
Saprolegnia nhưng nó cũng gây độc và ảnh hưởng tới môi trường nuôi. Tuy nhiên
Xanh malachite đã bị cấm sử dụng trên thế giới do những ảnh hưởng của nó gây ra
và gần đây Formalin cũng đã bị hạn chế sử dụng trong ni trồng thủy sản. Điều
này dẫn đến gặp nhiều khó khăn trong việc phòng trị các bệnh nhiễm
nấm Saprolegnia do đó nhu cầu cấp thiết là tìm ra các phương pháp thay thế để
kiểm soát bệnh Saprolegniosis xảy ra trên trứng cá và cá nước ngọt [16].
Đã có nhiều nghiên cứu về các hợp chất để tìm ra các chất có hiệu quả trong
phịng trị nấm và khơng ảnh hưởng đến chất lượng nở của trứng, cá giống, cá nuôi
và trên hệ sinh thái. Năm 1997 Kishio Haitai và các cộng sự của ông đã thử nghiệm
nước Hydrogen Peroxide (H2O2 ) ở tỷ lệ hoạt tính là 31% để diệt nấm ở trứng cá hồi
(Rainbow trout) kết quả cho thấy ở nhiệt độ 13oC trong thời gian 60 phút, H2O2 ở
nồng độ độ 1500 µg/ml gây hại cho trứng cá hồi cầu vồng. Đặc biệt khi dùng H 2O2
ở nồng độ 250 - 1000µg/ml có khả năng ức chế, kìm hãm và tiêu diệt sự phát triển
của nấm Saprolegnia sp, hạn chế gần như hoàn toàn sự nảy mầm của các bào tử
nấm. Khi dùng để trị bệnh do Saprolegnia sp gây ra trên trứng cá hồi ở nhiệt độ 13
sau thời gian 60 phút cho kết quả rất khả quan, tỷ lệ nở của các lơ thí nghiệm có
dùng thuốc với nồng độ 250, 500 và 1000 µg/ml có tỷ lệ nở tương ứng là 37,4%,
46,6%, và 67,6% trong khi ở lô đối chứng là 7,8%. Khi xử lý bằng H 2O2 với nồng

9


độ 500µg/ml H2O2 trong 60 phút ở 20oC đã có tác dụng ức chế giai đoạn zoosporic
trong quá trình phát triển của nấm và với nồng độ 1000µg/ml H 2O2 trong 60 phút ở
20oC thì ức chế quá trình sinh dưỡng của nấm. Trị bệnh với 1000µg/ml H2O2 trong

60 phút ở 13oC là có hiệu quả nhất để kiểm sốt lây nhiễm nấm. Nó hạn chế sự nhiễm
nấm và làm tăng tỷ lệ nở của trứng cá hồi. Như vậy H2O2 là một loại thuốc có tác dụng
diệt nấm ở động vật thủy sản, tuy vậy tùy theo điều kiện nhiệt độ nước mà lựa chọn
nồng độ phù hợp [3], [19], [16], [14].
Niulubol Kitancharoen, Kisshio Hatai và ctv (1997) đã nghiên cứu hiệu quả
kháng nấm Saprolegnia ở trứng cá Hồi. Họ đã chứng minh trong 1 giờ ở nhiệt độ
13oC nồng độ tối đa của NaCl không gây độc đối với trứng cá hồi là 25ppt. Nghiên
cứu này cho thấy rằng với nồng độ NaCl 25ppt trong 1 giờ, 2 lần trong một tuần thì
trứng bị nhiễm nấm giảm và tăng tỷ lệ nở của trứng cá hồi. Tiếp tục trị bệnh với
NaCl ở nồng độ lần lượt là 3ppt, 5ppt, 7ppt thì tỷ lệ nở của trứng đều giống nhau,
nhưng khi trị bệnh với NaCl ở nồng độ 3ppt, 5ppt thì hiệu quả diệt nấm kém, ở
nồng độ 7ppt khả năng diệt nấm là rất tốt [18].
Theo nghiên cứu của Hussein và các cộng sự (2001) kết luận rằng việc sử
dụng H2O2 là một hợp chất hướng tới cộng đồng nuôi trồng thủy sản và đưa lại lãi
suất ngày càng tăng. Hợp chất này được coi là tương thích với môi trường và là một
hướng đi hiệu quả trong việc điều trị bệnh cho cá nuôi, là thuốc diệt nấm, diệt
khuẩn, diệt ký sinh trùng trên trứng cá và cá ni [14].
1.4. Một số đặc điểm của hóa chất thử nghiệm
• Hydrogen Peroxide (H2O2)
H2O2 là một hợp chất hóa học có tính oxi hóa cao có khả năng làm mất hoạt
tính của các men trong tế bào sinh vật và tiêu diệt nó. H 2O2 thường được sử dụng
như là chất khử trùng để làm sạch vết thương của người và H 2O2 cũng đã được sử
dụng trong nuôi trồng thủy sản để điều trị một số bệnh bao gồm cả ký sinh trùng
bên ngoài, vi khuẩn, nấm và các bệnh ở các giai đoạn khác nhau của cá ni. Dùng
H2O2 có thể làm tăng hàm lượng oxy hịa tan trong nước.
H2O2 → H2O + [O]

10

Gần đây H2O2 đã được FDA chấp nhận là có thể được sử dụng để phịng trị
bệnh trong ni trồng thủy sản mà không gây hại đến động vật nuôi, môi trường
sinh thái cũng như không gây hại trong sản phẩm sử dụng. H 2O2 là một hóa chất
tương đối rẻ để sử dụng trong ni trồng thủy sản [21].

• Acid acetic (CHCOOH)
Acid acetic hay còn gọi là etanoic, là một axít hữu cơ (Acid Cacboxylic), mạnh
hơn acid cacbonic. Phân tử gồm nhóm methyl (-CH3) liên kết với nhóm carboxyl (COOH). Acid acetic được dùng khá nhiều trong NTTS và Acid acetic là một trong 18
hóa chất khơng phải kháng sinh và được FDA cho phép sử dụng trong nuôi trồng thủy
sản [28].
• PVP - Iodine
Polyvinyl - Pyrvidone Iodine (PVP - Iodine) là một hợp chất hóa học bao gồm
Polyvinylpyrrolidone và Iodine. Có nồng độ hoạt chất từ 9,0% đến 12% Iodine, PVP
- Iodine có tác dụng sát trùng mạnh, có khả năng diệt khuẩn, nấm và ký sinh trùng
gây bệnh ở động vật thủy sản. Trong nước Iodine có thể chuyển hóa thành các dạng
khác nhau và Iodine thẩm thấu qua vách và màng tế bào của vi khuẩn, nấm, nguyên
sinh động vật, virus làm mất khả năng hoạt tính của các men trong tế bào và tiêu diệt
chúng. Trong số các dạng khác nhau của Iodine thì chỉ có I 2, HOI và I- là có tác dụng
tốt để khử trùng, trong đó I2 và HOI có tác dụng diệt khuẩn mạnh [9].
Trong nuôi trồng thủy sản PVP - Iodine được sử dụng như chất khử trùng ở
trại giống và ngồi ao ni, để trị các loại bệnh do nấm, nguyên sinh động vật hay vi
khuẩn tác động bên ngồi cơ thể động vật ni, pha lỗng rồi tạt xuống ao với nồng
độ PVP - Iodine 30% là 1,0 mg/L, 3 ngày/lần [9].
• Castellani
Castellani là dung dịch dạng lỏng thành phần bao gồm acid phenic, resorcinol.
Castellani có tính sát khuẩn tại chỗ, bơi tại chỗ để phịng và chống bội nhiễm. Từ
trước tới nay Castellani chỉ được dùng để chữa viêm da, nấm da bội nhiễm ở người
mà ít được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản.
• Viên sủi VICATO khử trùng (TCCA)

11


Viên sủi VICATO khử trùng có thành phần chính là Tricloisocyanuric acid
(TCCA) là một hợp chất hóa học, tan nhiều trong các dung môi phân cực lớn như
clorua, axit vô cơ đặc, khi tan trong nước nó hình thành HCLO có tính diệt trùng
mạnh là một loại thuốc sát trùng thông dụng nhất [2].
Trong nuôi trồng thủy sản TCCA được dùng để khử trùng cho ao đầm ni.
TCCA có tác dụng khử trùng nước ao nuôi tôm, với nồng độ 1ppm TCCA có tác
dụng diệt được một số vi sinh vật trong nước, nồng độ 5 - 15ppm TCCA có khả năng
diệt toàn bộ vibrio trong nước.ở nồng độ 5 - 10ppm TCCA có tác dụng làm giảm vi
khuẩn tổng số trong nước 20 - 24 lần, ở nồng độ 15ppm đã diệt hết vi khuẩn trong
nước. Trong ao nuôi cá ở nồng độ 0,2 - 0,4 ppm TCCA có thể làm giảm đáng kể vi
sinh vật gây bệnh cho cá đặc biệt là vi khuẩn gây bệnh cho cá thuộc nhóm
Aeromonas spp [2].

12


CHƯƠNG 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• Đối tượng nghiên cứu
- Nấm Saprolegnia phân lập từ trứng cá Chép (Cyprinus carpio).
- Cá Chép khỏe mạnh khơng mang mầm bệnh có khối lượng 3g - 5g, chiều
dài 3 - 5cm để làm thí nghiệm.
• Vật liệu nghiên cứu
Các hóa chất thử nghiệm: Acid acetic, Castellenin, Hydrogen Peroxide
(H2O2), PVP - Iodine, Viên sủi VICATO khử trùng (TCCA).

2.2. Dụng cụ, mơi trường ni cấy
• Dụng cụ và trang thiết bị
- Dụng cụ: Đèn cồn, panh, dao, kéo, găng tay, đĩa peptri đựng môi trường, la
men, lam lõm, các dụng cụ thử nghiệm khả năng chịu đựng của cá trong các hóa chất.
- Thiết bị: Buồng cấy vơ trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy dụng cụ, nồi hấp tiệt
trùng, kính hiển vi.
• Mơi trường ni cấy
Mơi trường GY agar (1% Glucose, 0,25% Yeast extract, 1,5% Agar)
Môi trường GY broth (1% Glucose, 0,25% Yeast extract)
Môi trường nghèo dinh dưỡng nhân tạo APW (Autoclave Pond Water) sử
dụng nước ao đã lọc thô bằng màng lọc, lọc lại giấy lọc thấm, đổ vào bình thuỷ tinh
pha nước cất (Tỷ lệ nước ao và nước cất là 1: 2) Sau đó cho vào nồi hấp khử trùng
121oC trong thời gian 15 phút.
2.3. Nội dung nghiên cứu
• Ni cấy, phân lập nấm Saprolegnia sp ký sinh trên trứng cá Chép (Cyprinus carpio).
• Thử nghiệm khả năng ức chế, tiêu diệt nấm Saprolegnia bằng một số hóa chất
với các nồng độ (NĐ) khác nhau.

13


• Thử nghiệm khả năng chịu đựng của cá Chép giống với nồng độ và thời gian
sử dụng một số hóa chất có thể diệt được nấm Saprolegnia sp.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân loại nấm
Phân loại nấm theo phương pháp hình thái học của Kishio Haitai (1992) và
Willioughby (1994).
Trứng cá Chép (Cyprinus carpio) bị nhiễm nấm

Phân lập nấm

Ni cấy thuần chủng

Đặc điểm hình thái

Đặc điểm sinh sản

Hình thái, kích thước sợi nấm
Các đặc điểm đặc trưng của khuẩn
lạc

Các hình thức sinh sản

Phân loại đến lồi
Hình 2.1. Quy trình phân loại nấm
• Phương pháp thu mẫu
Trứng cá chép có dấu hiệu bị nhiễm nấm được thu tại phịng Di truyền và
chọn giống Viện nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 1 đưa về phịng thí nghiệm kiểm
tra dưới kính hiển vi nếu phát hiện sự có mặt của sợi nấm sẽ tiến hành rửa trong nước
cất khử trùng 3 lần trước khi ni cấy để nghiên cứu tiếp theo.
• Phương pháp phân lập nấm
Mẫu nấm được cấy vào môi trường GY agar có bổ sung 2 loại kháng sinh là
Peniciline và Streptomycine để diệt vi khuẩn (lưu ý phải hơ dụng cụ cấy trên ngọn

14


lửa đèn cồn trước khi cấy mẫu), sau đó giữ ở nhiệt độ 20ºC trong tủ ấm theo dõi sự
phát triển của nấm trong 24 giờ, 48 giờ, 96 giờ. Sau khi khuẩn lạc nấm phát triển sẽ
được nuôi cấy thuần chủng bằng phương pháp ni cấy một bào tử.
• Phương pháp nuôi cấy nấm thuần chủng (phương pháp nuôi cấy một bào tử)

Sau khi nấm đã phát triển, cắt một miếng mơi trường có nấm đặt vào mơi
trường tăng sinh GY broth sau 24 - 48 giờ rồi cấy chuyển nấm vào môi trường nghèo
dinh dưỡng nhân tạo (APW) để nấm sinh bào tử động. Sau 24 - 48 giờ có bào tử
động dùng micropipet hút 15 - 20μl dung dịch có chứa bào tử động cho vào mơi
trường GY agar mới, dùng dụng cụ trang đều dung dịch có chứa bào tử động ni
cấy ở nhiệt độ 200C, theo dõi thường xuyên sự phát triển của khuẩn lạc nấm khi thấy
xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ, chọn một khuẩn lạc riêng rẽ vào môi trường nuôi
cấy mới, khuẩn lạc được chọn là khuẩn lạc thuần chủng phục vụ cho phân loại, lưu
giữ giống và các nghiên cứu cơ bản khác.
• Phương pháp phân loại nấm
Dựa vào các đặc điểm hình thái sợi nấm, kích thước, các đặc điểm đặc trưng
của một số khuẩn lạc nấm trên môi trường ni cấy và các hình thức sinh sản vơ tính,
sinh sản hữu tính để phân loại đến lồi.
+) Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc nấm
- Từ khuẩn lạc nấm thuần dùng ống hình chữ T bằng kim loại có đường
kính 5mm để cắt khối nấm hình trịn nhỏ, sau đó dùng đầu kim khử trùng chuyển
khối thạch hình trịn có đường kính 5mm vào vị trí trung tâm của đĩa mơi trường,
ni ở 3 mức nhiệt độ 15 oC, 20 oC, 25oC, mỗi mức nhiệt độ lặp lại 3 lần. Tiến
hành đo kích thước khuẩn lạc hằng ngày cho đến khi khuẩn lạc nấm phát triển
đầy đĩa mơi truờng.
- Đo đường kính khuẩn lạc nấm: Dùng bút viết kính kẻ 2 đường thẳng vng
góc cắt nhau ở vị trí trung tâm của khối nấm, tiến hành đo đường kính khuẩn lạc nấm
tại 4 vị trí mép rìa khuẩn lạc trên 2 đường thẳng.
- Tốc độ tăng trưởng của khuẩn lạc nấm được xác định bằng đường kính trung
bình của khuẩn lạc qua các lần lặp đo được hằng ngày, so sánh đưa ra kết quả.

15


+) Phương pháp xác định hình thái sợi nấm

- Từ đĩa GY agar có khuẩn lạc nấm thuần phát triển, dùng dao giải phẩu cắt
một khối nấm nhỏ (khoảng 0,5cm2) thả vào đĩa Petri có chứa 25ml mơi trường GY
Broth nuôi cấy ở 20oC trong 1 ngày.
- Dùng kéo cắt sợi nấm trong môi trường GY Broth rửa qua nước APW khử
trùng 2 - 3 lần sau đó thả vào đĩa Petri chứa nước APW.
- Dùng panh đưa sợi nấm trong mơi trường APW lên lam kính lõm, đậy lamen
quan sát dưới kính hiển vi ở các độ phóng đại khác nhau (10X & 40X).
- Quan sát các đặc điểm hình thái của sợi nấm, túi bào tử, bào tử, sự hình
thành bào tử, phương thức giải phóng bào tử, sự vận động của bào tử.
+) Phương pháp xác định kích thước hiển vi của nấm
- Tiến hành đo kích thước: Đường kính sợi nấm, bào tử, túi bào tử.
- Mỗi yếu tố tiến hành đo 50 lần, tính kích thước trung bình của mỗi yếu tố.
2.4.2. Phương pháp thử nghiệm khả năng ức chế, tiêu diệt nấm Saprolegnia sp
bằng một số hóa chất trong phịng thí nghiệm
Q trình xác định nồng độ của hóa chất thí nghiệm diệt nấm Saprolegnia sp
được thể hiện ở sơ đồ sau:
Nấm Saprolegnia đã được phân loại

Đối chứng

Acid acetic

Castellenin

NĐ 1

NĐ 2

H2O2

Iodine

NĐ 3

TCCA

NĐ n

Đánh giá khả năng ức chế nấm của hóa chất thử nghiệm
Đánh giá khả năng tiêu diệt nấm của hóa chất thử nghiệm
Lựa chọn được hóa chất với nồng độ thích hợp có khả năng diệt nấm
Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu thử nghiệm khả năng diệt nấm của hóa chất

16