Luận văn nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp pectinase từ aspergillus niger CF2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................2
1.1. Tổng quan về enzyme pectinase.................................................................2
1.1.1. Cơ chất pectin..........................................................................................2
1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase...............................................................................3
CHƯƠNG 2MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....25
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................25
2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................25
2.3. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................25
2.3.1. Vật liệu..................................................................................................25
2.3.2. Hóa chất.................................................................................................25
2.3.3. Thiết bị...................................................................................................25
2.3.4. Mơi trường ni cấy..............................................................................26
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................26
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................31
3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2....................................................31
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp pectinase...31
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin..........................................................31
3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường.........................................................32
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ........................................................................33
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men..........................................................34
3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2.........................................36
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme............................36
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme.....................37
3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme..............................39

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................41
4.1. Kết luận....................................................................................................41
4.2. Kiến nghị...................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase.................................................................4
Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp.....................20
Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme....................................................20


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin...............................................................3
Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc...........................16
Hình 1.3: Hình ảnh nấm Aspergillus niger......................................................22
Hình 2.1: Mơi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khống..............27
Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn monogalacturonan..........................................29
Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày ni cấy trong tủ ấm ở 30oC............................31
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase..................................31
Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD
.........................................................................................................................32
Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2...........33
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme...................34
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp
pectinase của A.niger CF2...............................................................................34
Hình 3.7: Mơi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày........35
Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày 35
Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2 36

Hình 3.10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của pectinase từ A. niger CF2.....37
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger CF2...38
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger
CF2..................................................................................................................39
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tính ion kim loại đến hoạt độ enzyme..................40


ĐẶT VẤN ĐỀ
Enzyme pectinase bao gồm nhiều loại enzyme khácnhaunhư
polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tácthủyphân các phân tử
pectin tạo các sản phẩm khác nhau. Ban đầu, enzyme này được phát hiện
trong các dịch chiết trái cây như cà rốt, cà chua hay đại mạch. Đặc biệt phải
kể đến là phát hiện của nhà khoa học người Italia Enrico Fermi năm 1840 trên
đối tượng cà rốt.
Với vai trò quan trọng, pectinase được sử dụng rộng rãi, đem lại lợi ích
khá lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp nhẹ. Trước đây
nguồn enzyme chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật. Ngày nay, người ta
đã nghiên cứu tìm ra nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú, đa dạng và
mang lại lợi ích kinh tế. Một đặc điểm nổi bật của pectinase là các enzyme
này được dùng không giới hạn trong thực phẩm vì khơng ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Bằng ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển
nhanh,cho nhiều enzyme trong một thời gian ngắn, vi sinh vật là lựa chọn
hàng đầu của các nhà sản suất công nghiệp với mong muốn giảm giá thành,
tăng năng suất sản xuất lên cao nhất. Sự sản xuất pectinase quy mô công
nghiệp được thực hiện chủ yếu từ Aspergillus niger(Yogesh, 2009).
Trên cơ sở đó, mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu các điều kiện thích
hợp sinh tổng hợp pectinase từ Aspergillus niger CF2”góp phần nghiên
cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên men nhằm tăng hiệu suất
quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme pectinase từ đó phục vụ nhu cầu sản
xuất trong nước và mang lại giá trị kinh tế cho ngành công nghiệp.

1


CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về enzyme pectinase
1.1.1. Cơ chất pectin
Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng, được cấu tạo từ các acid
galacturonic bằng liên kết -1,4 glucoside. Tùy nguồn pectin khác nhau mà
pectin có khối lượng phân tử 80.000 200.000 Da.
Pectin tan trong nước ammoniac, dung dịch kiềm, carbonatte natri,
glycerine nóng.
Các pectin tự nhiên định vị trong thành phần của tế bào có thể liên kết
với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin khơng
tan. Chúng ta có thể phân hủy các protopectin không tan trong tế bào thành
các pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong mơi trường acid,
vì vậy các pectin tan này khơng đồng dạng vớinhau.
Trong thực vật, pectin tồn tại dưới ba dạng:
- Pectin hòa tan: là ester methylic của polygalacturonic acid, trong tự
nhiên có khoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester
hóa bằng methanol. Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch
acid và trong dung dịch đường có nồng độ 65%. Enzyme pectinase tác động
lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học
khơng đồng dạng. Cấu trúc hóa học cơ bản của pectin là -D-galacturonan
hay -D-galacturoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị Dgalactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4). Mặt khác, mức độ oxy
hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhất định
các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl. Trong một số trường
hợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường có sự ester hóa giữa các nhóm
carboxyl và các nhóm acetyl.

- Pectin acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm
2


carboxyl được ester hóa bằng methanol. Pectinate là muối của pectinic acid.
Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị
galacturonic acid. Pectate là muối của pectic acid.
- Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có
cấu tạo hóa học phức tạp. Trong protopectin có các phân tử pectin, các phân
tử cellulose và các ion Ca2+, Mg2+ các gốc phosphoric acid, acetic acid và
đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid thì giải phóng ra pectin hịa
tan.
1.1.2. Hệ Enzyme Pectinase
1.1.2.1. Giới thiệu enzyme pectinase
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer
pectin và sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose,
arabinose, methanol,… đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Sự phân hủy pectin trong tự
nhiên thường xảy ra khi trái cây chín.Những enzyme này vì vậy có một vai trị
hết sức quan trọng trong q trình bảo quản trái cây và rau quả.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của peptin
1.1.2.2. Phân loại
Enzyme pectinase có thể phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng như
bảng 1.1.
- Pectinesterase (PE): xúc tác sự thủy phân của các nhóm methyl
ester. Enzyme thường tấn cơng vào các nhóm ester methyl của đơn vị
3

galaturonate nằm kề đơn vị khơng bị ester hố, phân cắt các nhóm methoxy
(COOCH3) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành acid pectinic hoặc
acid pectic và methanol. Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có
giá trị pH tối ưu khác nhau. Pectinesterase thường được hoạt hoá bởi các ion
Ca2+ và Mg2+.
Bảng 1.1: Phân loại enzyme pectinase
STT
1

Enzym (tên gọi theo
hệ thống)
Pectinpectinhydrolase

2

Poly--1,4
galacturonid-glycano
hydrolase-PG

3

Poly--1,4-Dgalacturonidgalacturo
n-hydrolase

4

Poly--1,4-Dgalacturonidmetilester
-glycanohydrolase

5

Poly--1,4-Dgalacturonid
digalacturonoliase

6

Poly--1,4-Dgalacturonid
glicanoliase

7

Poly--1,4-Dgalacturonid
metylester
glicanoliase

Enzym(tên
thường gọi)

Phản ứng xúc tác

Pectin + H2O = n metanol +
pectic acid
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopoly
galacturonid trong
galacturonase
galacturonid không theo một
(endo-PG)
trật tự nào
Thủy phân liên kết -1,4-DExopoly
galacturonid trong pectat,

galacturonase
trong galacturonic với sự
(exo-PG)
đứt mạch của acid
galacturonic
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopolymetilgalacturonid trong pectin
galacturonase
không theo một trật tự nhất
(Endo-PMG)
định.
Thủy phân liên kết -1,4-Dgalacturonid trong pectat với
Exo-pectatliase
sự tạo thành -4,5
(exo-PKTE)
aciddegalacturonic không
theo một trật tự nhất định.
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopectatlias galacturonid trong pectat,
trong galacturonic với sự tạo
e (PETE)
thành nối đôi không theo
một trật tự nhất định
Thủy phân liên kết -1,4-DEndopectinlias galacturonid trong pectin
với sự tạo thành nối đôi
e (Endo-PTE)
không theo một trật tự nhất
định
pectinesterase

4

- Polygalacturonase (PG): cịn có tên gọi khác là poly 1,4galacturoniglucanohydrolase, xúc tác sự phân cắt các mối liên kết -1,4glycoside. Các exo-PG (exo-poly -1,4-D-galacturonide) galacturonohydrolase,
phân cắt từ đầu không khử, và endo-PG (endo- poly -1,4-D-galacturonide)
glycanohydrolase tấn công ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất. Polygalacturonase
là một phức hệ enzyme gồm có nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối
với cơ chất.
- Pectate lyase (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate
không không bị ester hóa. Cả hai enzyme exo-PEL (exo-poly (1,4--Dgalacturonide)lyase) và endo-PEL (endo-poly (1,4--D-galacturonic) lyase)
đều tồn tại. Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là các cơ chất thích hợp
cho các enzyme này. Nói chung, cả hai enzyme này đều có khoảng pH tối đa
nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca2+ để hoạt động. Pectate lyase
khơng được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm. Các
enzyme VSV ngoại bào này đóng một vai trị rất quan trọng trong quá trình
gây bệnh ở thực vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và
làm mục mơ thực vật.
Ngồi ra cịn có:
- Pectin-transeliminase (poly 1,4--galaturonid-methylesteglucanolise)
là enzyme tác dụng lên pectin và pectinic acid.
- Polygalactorunate-transeliminase (poly1,4-- galaturonid–
glucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectic acid và pectinic acid.
- Pectin lyase (PNL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã
bị ester hóa. Tất cả các PNL đều là endo-enzyme.
1.1.2.3. Ứng dụng của enzyme pectinase
- Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase
duới dạng tinh khiết. Người ta không dùng chế phẩm dưới dạng canh trường

5


nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu

đem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%.
- Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các
nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ
tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ
dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu
nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ
khi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị
đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy, enzyme pectinase cịn góp phần
chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hồ tan nữa, do đó làm tăng
thêm chất lượng thành phẩm.
- Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một
trong sáu nhóm enzyme sau:
 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích
sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu
được luợng sản phẩm lớn.
 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không
chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và
thuỷ phân hồn tồn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt
tiêu nguyên nhân làm đục nước quả.
 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước
quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả.
 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang
nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm.
 Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản q trình oxy hoá và làm
cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong
rượu vang.

6

 Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong
sản suất siro thành phẩm.
Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên
cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý. Trong các đặc điểm của trái
cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản
phẩm.Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được
màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theoý muốn bằng cách
điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây
được chia làm hai loại:
 Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi…
 Trái cây có màu sẫm do chứa nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho
đỏ, mận đen, dâu…
 Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt
các enzyme sau:
- Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả.
- Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly
- Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc.
1.1.2.3.1. Làm trong nước quả
- Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu
tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rất
phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay
chủ yếu bằng phương pháp ép. Syrup quả nhanh đóng cục là do chứa 1 hàm
lượng pectine đáng kể. Qua phân tích hàm lượng pectinase trong 1 số quả như
sau:
•Syrup mơ: 0,107%
•Syrup mận: 0,153%
•Nước mận: 0,452%
Lượng pectin này làm cho syrup quả bị keo và đục, có độ nhớt cao,
nhất là khi quả có độ acid và hàm lượng đường cao như các lọai syrup kể trên
7

- Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì
pectinase

phải

có

enzym

endo

và

exo-polygalacturonase,

enzym

pectinestenase. Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là
những enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm. Vì endo và exopolygalacturonase sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzyme PE cũng
góp phần vào tác dụng của enzym này. Enzym proteinase của chế phẩm sẽ
thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát
của dịch quả dễ dàng. Sự có mặt của cellulase và hemicellulase ở trong chế
phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. Khi sử dụng cho các loại quả như táo,
lê thì trong chế phẩm khơng được phép có enzyme pectinaseliminase và
enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mơ quả
lại với nhau, do đó gây mủn hố mơ quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và kết
quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quả
mọng như dâu tây thì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì

enzym này sẽ làm mủn hố tế bào làm cho tính chất thốt nước của tế bào
tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống.
Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả
trong cũng khơng được phép có các enzym oxidase (ascohatoxydase,
poliphenoloxydase).
Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemicellulase và
cellulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế
phẩm.Trong đó vai trị dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ
protopectin của mô quả. Hemicellulase và cellulase sẽ cùng với PTE làm cho
độ đồng thể của nước quả có màu sáng thì trong chế phẩm khơng chứa enzym
oxi hố, cịn cho các ngun liệu có carotenoid và antoxian thì khơng chứa
enzym phá huỷ các chất này.
Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase,
người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhanh được đem
xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm. Trong trường hợp có sử
8


dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho
tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong q
trình ép sau này.
Dùng pectinase khơng chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm
trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả. Bởi lẽ nhờ
tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quả sẽ bị phá huỷ hoàn
toàn. Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một
phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất
hoà tan.
Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại
trừ được trường hợp làm trong khơng hồn tồn.
Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hồn

tồn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn.
Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể
chia làm 3 giai đoạn:
+ Giai đoạn “bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một
cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “phá vỡ”
+ Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi
kết tủa hoàn toàn.
+ Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các
pectin kết tủa bởi ion canxi
- Để làm trong nước trong quả nên sử dụng chế phẩm enzyme có hoạt
độ 1,950 đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp Cu-pectat) hoặc 0,768
đvhđ/1g canh trường (theo phương pháp so màu). Dưới tác dụng của
pectinase, pectine - một polysacharide được tạo thành từ sự liên kết giữa các
mạch của phân tử acid galacturonic (C6H10O7) mà một phần đã được este hoá
với rượu metylic (CH3OH) bị phân huỷ hoặc bị phân cắt liên kết glucozic.
Pectine là 1 chất điện ly cao phân tử (polime) mang điện tích âm (-) dọc theo
chiều dài của mạch phân tử có sự sắp xếp các nhóm điện tích cùng dấu (9


COO-) nên mạch có xu hướng duỗi thẳng tạo nên bề mặt hấp phụ lớn trong
tồn bộ dung dịch có chứa pectin. Nước quả đục là hệ huyền phù trong đó
phần tử thịt quả có kích thước nhỏ, bề mặt riêng lớn và có năng lượng rất lớn
nên khơng bền vững về mặt nhiệt động học. Mặt khác, chúng là những phân
tử tích điện nên dưới tác dụng của lực hút phân tử chúng liên kết lại tạo thành
những phân tử lớn dễ dàng lắng xuống. Trong nước quả, sự có mặt của hợp
chất polyphenol (đặc biệt là tanin) tạo nên với pectine những kết tủa khơng
tan v.v... Sự có mặt của pectinase sẽ thúc đẩy nhanh quá trình cơ bản nêu trên.
Xác định giá trị mật độ quang OD (Optical Density) ở λ = 600 nm theo thời
gian để so sánh tốc độ lắng thịt quả giữa các mẫu.
- Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền

sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Khi ta cho
pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép
tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,030,05% hoặc chế phẩm thơ là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ
phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8 giờ. Dịch quả thu được bằng
pectinase sẽ trong hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ.
1.1.2.3.2. Trong sản xuất rượu vang
Giúp cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ. Enzyme
pectin được thêm vào các loại trái cây trước khi bổ sung các men rượu trong
quá trình sản xuất rượu vang đỏ để cải thiện màu sắc và độ đục. Rượu vang
đỏ được bổ sung enzym có màu sắc tốt hơn so với các loại rượu vang không
được bổ sung enzyme. Những loại rượu này cũng cho thấy sự ổn định lớn hơn
so với các loại rượu vang không được bổ sung enzyme.
1.1.2.4. Một số phương pháp sản xuất enzyme pectinase
1.1.2.4.1. Nguồn gốc thu nhận
 Từ vi sinh vật: Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme
thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú. Vi sinh vật phân giải
pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:
10


 Nấm mốc: A.niger, A.oryase, A.terreus, A.saito, A.japonicus…
 Nấm men: S.ellipsoideus, S.fragilis, S.ludwigii …
 Vi khuẩn: B.polymixa, B.felseneus, Clostridium roseum…
1.1.2.4.2. Phương pháp ni cấy bề mặt
Quy trình sản xuất
Mơi trường

Dụng cụ nuôi cấy

Hấp khử trùng

Hấp khử trùng

Để nguội

Để nguội

Phối vào dụng cụ

Cấy vào môi trường

Nuôi cấy trong 36
giờ
Thu nhận enzyme
thô

11

Nhân giống

Giống vi sinhvật




Thuyết minh quy trình:

 Mơi trường ni cấy
Là mơi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngơ
mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khống. Mơi trường rắn thường dùng

nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng
và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra
nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải
đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao.
Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo mơi trường thống khí
tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hồn chỉnh để ni cấy
gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dinh dưỡng khác
(mầm mạ, nước khoai tây… để cung cấp thêm nguồn nitơ, photphat, kali…).
Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì
nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi
trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh.
 Ni cấy: Các khay có mơi trường đã cấy mốc được đặt vào phịng
ni có sẵn các giá.
 Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở
1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm.
 Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay
đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 30 0C thì
tiến hành cấy giống.

 Giống
Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh
nhiễm tạp. Giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi
trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để
cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo
phương pháp tách bào tử khỏi mơi trường và chứa trong các bình có nút kín.

12


Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào

10kg mơi trường.

 Ni cấy
Các khay có mơi trường đã cấy mốc được đặt vào phịng ni có sẵn
các giá. Phịng ni có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.
Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-32 0C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C
thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy
sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme.
Q trình ni cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3
giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14 giờ đầu: giai đoạn này có những thay
đổi sau:
 Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa.
 Bắt đầu hình thành enzym, khơng địi hỏi phải thơng khí nhiều chỉ
cần làm thống khoảng 2 – 3 thể tích khơng khí / thể tích phịng / giờ.
 Khối mơi trường cịn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có
sự thay đổi.
 Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18 giờ: giai đoạn này có những
thay đổi sau:
Mốc phát triển nhanh, hơ hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt
thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi
trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần. Các chất dinh dưỡng trong
môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế
bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ.
Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 400 - 450C. Thời kì này cần phải thơng khí
mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phịng/giờ để cung cấp O 2 cho mốc thở và
đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt

13

độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 30 0 C và độ ẩm trong phòng
khoảng 90%.
Các loại enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được
hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng.
 Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20giờ: giai đoạn này có
những biến đổi
Q trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng
sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thơng khí
khơng q 20 – 25 thể tích khơng khí/thể tích phịng/giờ, giữ nhiệt độ buồng
ni duy trì ở 300C.
Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian ni cấy
có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, enzyme vẫn được
hình thành ở giai đoạn này.
Mơi trường sau khi ni cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền
nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm. Sản phẩm này là chế
phẩm enzyme thô.
1.1.2.4.3. Thu nhận enzyme
a. Phương pháp thu nhận
Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme địi hỏi phải có
phương pháp tách và thu nhận riêng:
 Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong mơi
trường ni cấy ngồi tế bào, thường hồ tan trong nước do đó dễ trích ly và
tinh sạch.
 Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh
vật và không được tiết ra mơi trường bên ngồi. Những tế bào vi sinh vật sau
khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là
giải phóng tồn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp
thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn

14


enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh
sạch.
Enzyme nội bào
Khó tách
Phải phá vỡ thành tế bào
Thường lẫn chung với các chất khác của tế

Enzyme ngoại bào
Dễ tách
Không cần phá vỡ thành tế bào
Không lẫn chung với các thành

bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất phần nội bào, nếu có chỉ là một
nguyên sinh, lipid…)
vài enzyme ngoại bào khac
Chỉ bền vững trong môi trường nội bào
Bền vững hơn
Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ
trình cơng nghệ phức tạp, giá thành đắt

hơn

+ Từ mơi trường nuôi cấy bề mặt
Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch
muối trung tính, các dung mơi hữu cơ (cồn, axeton). Nhiều kết quả thí nghiệm cho
thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong
sản xuất. Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme

trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường
dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 28 0C. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một
ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá
trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C.
Phương pháp tách chiết và làm sạch enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện
nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và
axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giảm hằng số điện môi của môi trường. Như
ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi. Vì vậy, các enzyme,
các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung
mơi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.
Độ hịa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ
cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh
mất hoạt tính của enzyme dịch phải được làm lạnh xuống 3 – 5 oC. Khi trộn phải
khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa, lắng xuống dưới cần tách ly ngay.

15


Hình 1.2: Sơ đồ tinh sạch enzyme từ canh trường nấm mốc
+ Từ môi trường nuôi cấy bề sâu
 Phương pháp hiếu khí
Sự tích tụ enzyme trong mơi trường được bắt đầu khi sự phát triển của
vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hố mạnh và khi
lượng phospho vơ cơ được sử dụng hồn tồn, pH của mơi trường ni cấy
thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp
sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả
khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh
hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm.
Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm
lượng từ 2-10%. Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm

16


được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào
tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42 giờ. Lượng sợi nấm đem gieo cấy
thường là 2%. Trong q trình ni cấy, hàm lượng các chất hồ tan trong mơi
trường giảm từ 6% xuống cịn 1,5-1,8%.
Để thu chế phẩm khơ, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô
đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi
sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi
vào phải đạt 165-180oC và đi ra đạt 60-70oC. Thời gian lưu của chế phẩm
enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm
sau khi sấy phải khơng q 40oC. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín
để tránh hút ẩm.
 Phương pháp yếm khí
Mơi trường: bã củ cải 2%; (NH 4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3
0.3%; nước chiết ngơ 0.5%
Clostridium pectinofermentants15 có khả năng tổng hợp pectinase một
cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời
với sự tích luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn
định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ, pH ban đầu của môi trường dinh
dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh
trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Q trình ni
cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35oC.
C.felsineum cũng có thể được ni cấy yếm khí để thu pectinase. Thành
phần mơi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH 4)2HPO40,4%;
K2HPO4 0,7%; KH2PO4 0,3%; NaCl 0,1%; MgSO4 0,025%; FeSO4 dạng vết;
CaCO3 0,5%; dịch nấm men tự phân 0,05%; ascorbic acid 0,5%.
Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết
tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết

tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8. Nếu kết tủa

17


bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với
hoạt độ ban đầu.
Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hồ bằng 0,2 thì sẽ thu được
chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hồ là
0,9-1,0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và
exopolygalacturonase.
1.1.2.5. Đặc điểm của enzyme pectinase

 Pectinesterase:
Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu
khác nhau: pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn nấm mốc là 4,5 đến 5,5 còn
của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2,0
đến6,5. Trái lại pH tối ưu của pectinesterase từ nguồn thực vật là từ 6 đến 7,5
– 8.
Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là 40 đến 45 0C. Từ 55
đến 620C thì enzyme bị vơ hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của enzyme
pectinesterase từ thực vật cao hơn: từ 55 – 600C.
Pectinesterase có thể nhận được từ canh trường nấm mốc A.niger có
nhiệt độ tối ưu là 30 – 45 oC, pHopt= 4,5-5,5 và bị vô hoạt ở 55- 62 oC và từ
thực vật (pHopt=7,5-8, toopt= 55-60oC). Khả năng hoạt động của chúng phụ
thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá của pectin. Ion natri và đặc biệt
là ion canxi, cũng như chlorua của Na, K và Ca sẽ hoạt hóa pectinesterase từ
nấm mốc Conithyrium diplodiella và từ A.niger. Trái lại các cation hóa trị 3
và 4 (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhơm sunfat và sắt clorua) sẽ kìm hãm tác
dụng của pectinesterase

 Polygalacturonase:
Hầu hết các nghiên cứu về Polygalacturonase đều trên cơ sở các nguồn
vi sinh vật. Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại
bào của các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: Saccharomyces
fragilis, Asperigillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochlibolus carbonum,
18


neurosrora crassa, các loàiAscomycete, Rhizopus arrchizus và Fusarium
oxysrorum.
pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau, phụ thuộc vào
nguồn

thu

và

cơ

chất.

Chẳng

hạn

polygalacturonase

dịch

hóa

(endopolygalacturonase) khi tác dụng trên acid pectinic thì pH tối ưu nằm
trong khoảng từ 4,0 – 5,5. Cũng enzime đó nhưng khi tác dụng trên pectin thì
lại có pH tối ưu trong khoảng 5,5 – 6. Cịn polygalacturonase đường hóa khi
tác dụng trên pectin thì pH tối ưu từ 3 – 4 nhưng khi tác dụng trên acid
pectinic thì ph tối ưu cao hơn một ít ở vùng 4,4- 6.
Các polygalacturonase chủ yếu bền vững ở vùng pH từ 4 – 6.
Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger nếu được hoạt hóa
bằng thủy ngân thì có thể bền vững khi pH= 2,5.
Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng từ 40
-450C. Trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị vô
hoạt khi ở nhiệt độ 50 và 55 - 650C.
1.1.2.6. Trung tâm hoạt động của pectinase
Enzyme pectinase chứa vùng có 8 – 10 vịng xoắn kép về phía phải với
2 vịng tạo thành khe liên kết với cơ chất.
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa axit amin Aspartate và
Lysine. Có 1 Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả
năng xúc tác của enzyme.
1.1.2.7. Tình hình ứng dụng enzyme trong cơng nghiệp trên thế giới
Từ khi phát hiện ra enzyme và khả năng chuyển hóa của enzyme lồi
người đã tăng nhanh q trình sản xuất và ứng dụng enzyme trong cơng
nghiệp. Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme
được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều. Các enzyme quan
trọng, được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp được trình bày qua bảng
sau:

19

Bảng 1.2: Tỉ lệ ứng dụng của các loại enzyme trong công nghiệp

Bảng 1.3: Giá trị kinh tế của các loại enzyme

1.1.3. Tổng quan về Aspergillus niger
1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu
A. niger đã là chủ đề được nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp
trong nhiều thập kỷ qua. Năm 1919, A. niger được sử dụng để sinh tổng hợp
citric acid và đánh dấu tầm quan trọng trong sản xuất citric acid trong quy mơ
cơng nghiệp. Ngồi ra, A. niger cịn có khả năng sinh tổng hợp acid gluconic,
acid fumaric. Tuy nhiên, kể từ năm 1960, A. niger đã trở thành nguồn sinh
tổng hợp một loạt các enzyme tham gia vào kỹ thuật chế biến hoa quả, bánh
và trong các ngành công nghệ tinh bột và thực phẩm. Công nghệ gen đã áp
dụng thành cơng để cải thiện quy trình sản xuất và sử dụng các chủng A.
20


niger như một hệ thống biểu hiện các protein ngoại lai. Các nghiên cứu đẩy
mạnh trong thập kỷ qua đã mang lại nhiều thành công và các sản phẩm mới
(E. Shuster và cs,2002).
A. niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố rộng rãi
trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều
vùng trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử dụng chủ yếu trong cơng
nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α - amylase, glucoamylase, pectinase,
protease, cellulase), trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản
xuất một số acid hữu cơ như citric acid, acid gluconic,…(Pansear và cs,2010).
1.1.3.2. Đặc điểm, phân bố
A. niger là một loại nấm sợi và một trong những lồi phổ biến của chi
Aspergillus có nhiều công dụng trong công nghệ sinh học, A. niger phát triển
ở nhiệt độ tối ưu 35–37oC, pH từ 1,4–9,0.

Cơ quan sinh sản của A. niger có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào
tử đính phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các
đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc. Từ tế bào gốc tạo thành sợi
cuống không vách ngăn, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình
cầu, khơng màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể
bình màu nâu, dài 1015 m là nơi sinh ra các thể bình. Thể bình có một tầng
hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể
bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng thể
bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già. Bào tử
đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4 – 5m nhưng thường nhỏ hơn
(Onions và cs, 1981). Loài A. niger được phân biệt với các loài khác trong chi
Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen.

21