Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá trắm cỏ (ctenopharyngodon idellus c v ) nuôi tại khu vực hà nội đối với vi khuẩn aeromonas hydrophila

ir '

p r GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
T M /Ờ N ií ĐAí HOC TttUỶ T o -

IỊ

ịỉ
VO UCNG TlííiV
;
!<
I

ị

ịỊ

lị

i

ỉ
>1:

: N. o

T ' T - ^ õ T 0 ^ : .0|C(:


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
T R Ư Ờ N G Đ Ạ I HỌC TH ỦY SẢN

VŨ D Ũ N G TIẾN

NGHIÊN CỨU ĐÁP ÚNG MIÊN DỊCH
CỦA CÁ TRẮM Cỏ (Ctenopharyngodon idellus c.& v.)
NUÔI TẠI KHU V ự c HÀ NỘI ĐỐI VỚI VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila
C h u y ê n ngành: N uôi cá nước ngọt và nghề cá nước ngọt
M ã số: 4.05.01

L U Ậ N Á N T IẾ N S ĩ N Ô N G N G H IỆ P

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS-TS. Đỗ N gọc Liên
2. TS. Lại Văn H ùng

Nha Trang, 2005


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của riêng
tôi. Tất cả các số liệu, nhận xét, kểt quả trong Luận án
này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong
bất kỳ cơng trình nào, ngoại trừ các số liệu đã được
công b ố trong một số cơng trình của tơi.
Tác giả Luận án
Ị

Vũ Dũng Tiến

LỜI CÁM ƠN

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS-TS Đỗ Ngọc Liên và TS Lại
Văn Hùng - những người thầy tận tình đã chăm lo hướng dẫn chu đáo cho tơi
trong suốt q trình làm nghiên cứu sinh của tơi;
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới TS Nguyễn Đình Mão - Chủ nhiệm Khoa,
TS Nguyễn Hữu Dũng, TS Đồ Thị Hồ, Khoa Ni trồng thủy sản Trường Đại
học Thuỷ sản đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong việc viết Luận án;
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS-TS Nguyễn Văn Mùi, TS Phan Tuấn
Nghĩa, PGS-TS Nguyễn Thị Quỳ và các thầy, cô giáo trong Ban Chủ nhiệm
Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
đã tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm trong suốt
những năm thực hiện đê tài nghiên cứu này;
Tôi xỉn chân thành cám ơn TS Lê Thanh Litu, Viện trưởng và TS Phạm
Anh Tuấn, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I, TS Bùi
Quang Tề, ThS Phan Thị Vân, ThS Bạch Thị Tuyết và các bạn đồng nghiệp ở
Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản ỉ (Bộ Thuỷ sản), CN Ngố Văn Quang
(Viện Hoá học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nhiệt tình giúp đỡ
tơi trong q trình thu mẫu cá bệnh ngồi tự nhiên, tiến hành thí nghiệm ướt
tại Viện và những điều kiện thuận lợi khác cho việc thực hiện Luận án;
Tôi xin chân thành cám ơn Dự án Tăng cường năng lực quản lý ngành
thuỷ sản (STOFA) đã hỗ trợ tơi một phần chi phí đi lại, in ấn và mua hố
chất.
Tơi xin chân thành cám ơn cấc đồng chí lãnh đạo Vụ Khoa học & Cơng
nghệ, Vụ Nuôi trồng thủy sản và Vụ Tổ chức-Cán bộ (Bộ Thủy sản) và bạn
bè, đồng nghiệp đã động viên tôi về mặt tinh thần trong q trình tơi thực hiện
Luận án;
Và cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân tình với mẹ vợ, vợ và các

con tơi đã chịu đựng khó khăn, gian khổ để tạo điều kiện thuận lợi tối đa cho
tôi trong việc thực hiện Luận án này.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cám ơn tất cả những người đã dành cho
tôi sự giúp đỡ chân tình và quỷ báu đó.
rry s

__• 7

Tác giá


MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cám ơn
Mục lục

i

Các chữ viết tắt

V

Danh mục các bảng

vi

Danh mục các hình, ảnh

viii

MỒ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1.

Miễn dịch ở cá xương

4

1.1.1. Miễn dịch tự nhiên à cá xương

4

1.1.2. Miễn dịch tiếp thu ở cá xương

9

1.2.

1.3.

1.1.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố đối với miễn dịch ở cá xương

15

Vi khuẩn Aeromonas và bệnh do chúng gây ra ở cá

16

1.2.1. Các tác nhân gây độc từ vi khuẩn gây bệnh

18

1.2.2. Nhận dạng và chẩn đoán vi khuẩn A. hydrophila

20

1.2.3. Các phương pháp kiểm soát bệnh cá do Aeromonas di động
gây nên

20

Dùng vacxin để phòng bệnh cho cá

21

1.3.1. Sơ lược lịch sử dùng vacxin cho cá

21

1.3.2. Hiệu quả của việc dùng vacxin cho cá

22

1.3.3. Các loại vacxin và quy trình chủng vacxin

23

1.3.4. Tối ưu hoá các yếu tố trong việc dùng vacxin cho cá

25

1.3.5. Tiêu chuẩn vacxin

26

1.3.6. Dùng vacxin chống vi khuẩn Aeromonas di động

26

1.3.7. Quản lý việc sản xuất vacxin

29


11

1.4.

Một số bệnh thường gặp ở cá trắm cỏ
1.4.1. Bệnh đốm đỏ
1.4.2. Một số bệnh khác

30
30
30

1.5.

Tình hình nghiên cứu về miễn dịch cá ở Việt Nam

30

CHƯƠNG 2. ĐƠÌ TƯỢNG, NGUN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CÚƯ

34

2.1.

Đối tượng nghiên cứu và nguyên liệu
2.1.1. Cá trăm cỏ
2.1.2. Vi khuẩn

34
34
41

2.2.

Phương pháp nghiên cứu

42

2.2.1. Thu và bảo quản huyết thanh cá

42

2.2.2. Xác định hàm lượng protein huyết thanh cá

43

2.2.3. Xác định thành phần protein huyết thanh cá trắm cỏ

43

2.2.4. Phân tích chất lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ bằng
kỹ thuật sắc ký lọc gel
2.2.5. Phân tích izozym

44
45

2.2.6. Điều chế và dùng thử vacxin phịng bênh đốm đỏ cho cá
trắm cỏ

46

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CÚƯ VÀ BÀN LUẬN
3.1.

Đáp ứng miễn dịch ở cá trắm cỏ biểu hiện qua hàm lượng protein

trong huyết thanh của chúng
3.1.1. Hàm lượng protein trong huyết thanh ở một số nhóm cá
trắm cỏ
3.1.2. Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ bố mẹ trước và
sau khi bị bệnh
3.1.3. Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ giống được tiêm
vi khuẩn với liều lượng khác nhau
3.1.4. Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ giống lớn được
tiêm vacxin và gây nhiễm trùng

49

49
49
50
51
53


111

3.2.

»

Đáp ứng miễn dịch ở cá trắm cỏ biểu hiện qua chất lượng protein
trong huyết thanh của chúng
3.2.1. Chất lượng protein của một số cá khoẻ

57

58

3.2.2. Chất lượng protein huyết thanh cá bố mẹ sau khi đẻ

60

3.2.3. Chất lượng protein huyết thanh cá bố mẹ

62

3.2.4. Phổ protein huyết thanh cá giống

64

3.2.5. Phổ protein huyết thanh cá giống được tiêm nước muối
sinh lý
3.2.6. Phổ protein huyết thanh cá giống bị gây nhiễm trùng bằng
dịch chiết ổ dịch
3.2.7. Phổ protein huyết thanh cá giống được tiêm vacxin dto Viện
Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I điều chế thử
3.2.8. Phổ protein huyết thanh cá giống bị gây nhiễm vi khuẩn
Aeromonas hydrophila
3.2.9. Phổ protein huyết thanh cá trắm cỏ bị bệnh tự nhiên

65
67
69
72
75

3.2.10. Sự thay đổi về chất lượng protein huyết thanh của cá trước
và saụ khi bị tiêm dịch chiết ổ dịch
3.3.

3.4.

3.5.

78

Bàn luận về đáp ứng miễn dịch của cá trắm cỏ biểu hiện qua chất
lượng protein huyết thanh của chúng
3.3.1. Sự khác nhau cơ bản về chất lượng protein huyết thanh
giữa nhóm cá khoẻ và cá bị bệnh
3.3.2. Sự khác nhau về chất lượng protein protein huyết thanh
giữa các nhóm cá khoẻ có khối lượng khác nhau
3.3.3. Phổ protein huyết thanh cá sau khi bị nhiễm bệnh

81

3.3.4. Chất lượng protein huyết thanh cá được chủng vacxin

83

3.3.5. Chất lượng protein huyết thanh cá đối chứng

83

Kết quả phân tích chất lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ bằng
kỹ thuật sắc ký lọc gel

3.4.1. Kết quả sắc ký trên cột ultrogel AcA-22

84
84

3.4.2. Kết quả sắc ký cột gel sepharoza 4B

85

Khối lượng phân tử IgM cá trắm cỏ

, 8

81

82
82

6


iv

3.6.

3.7.

Phổ điện di izozym huyết thanh cá ừắm cỏ

88

3.6.1. Phổ điện di izozym esteraza huyết thanh cá trăm cỏ

88

3.6.2. Phổ điện di izozym a xít photphataza huyết thanh cá trắm
cỏ
3.6.3. Nhận xét về sự biến đổi chất lượng izozym ỏ cá bệnh

91
94

Kết quả và bàn luận về việc điều chế và thử nghiệm vacxin phòng
bệnh đốm đỏ cho cá trăm cỏ

95

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

100

4.1.

Kết luận

100

4.2.

Đề nghị

101

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CÔNG Bố KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u
CỦA LUẬN ÁN

102

TÀI LIỆU THAM KHẢO

103

PHỤ LỤC

132

Phụ lục 1. Thành phần của hệ thống miễn dịch ở các bậc tiến hoá
Phụ lục 2. Sơ đồ hệ thống bổ thể
Phụ lục 3. Một số loài cá được nghiên cứu về miễn dịch
Phụ lục 4. Sơ đồ phân lập vi khuẩn Aeromonas hydrophiỉa và A. spp.
Phụ lục 5. Xây dựng các đồ thị chuẩn để xác định hàm lượng protein
Phụ lục 6. Cách điều chế một số dung dịch
Phụ lục 7. Cách xác định khối lượng phân tử theo phương pháp Weber và
Osbom cải tiến để giảm mức độ sai số trị số khối lượng phân tử protein

132
133
135
140
143

148
Ị 53

Phụ lục 8 . Đ iện di đồ protein huyết thanh một số mẫu cá trắm cỏ và bảng trị số
khối lượng phân tử các vạch protein của chúng

Phụ lục 9. Trích sao Cơng văn số 1249/TS-KHCN ngày 2/6/2005 của Bộ Thuỷ
sản gửi Bộ Khoa học và Công nghệ về việc đăng ký danh mục các nhiệm
vụ nghiên cứu khoa học và và phát triển công nghệ kiến nghị thực hiện từ
năm 2006 và Công văn số 277/VTSI ngày 18/5/2005 của Viện Nghiên cứu nuôi
trồng thuỷ sản I gửi Bộ Thuỷ sản về việc đăng ký nhiêm vụ khoa học công
nghệ giai đoạn 2006-2010 và năm 2006.

154

J<-<-


CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS

Amonium persulíate

BSA

Albumin huyết thanh bị

Chủng I

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila, chủng I

Chủng II

Vi khuẩn Aeromonas hydrophila, chủng II

Chủng III

Vi khuẩn Plesiomonas shigeloidesi

Chủng IV

Vi khuẩn Hafnia alvei

H

Khối lượng phân tử chuỗi nặng

HLPH

Hàm lượng protein huyết thanh

Ig

Immunoglobulin

IgM

Kháng thể lớp M

L

Khối lượng phân tử chuỗi nhẹ

MHC

Phức hệ phù hợp tổ chức chủ yếu (Major histo-compatibility
complex)

PCR

Kỹ thuật khuếch đại phản ứng chuỗi polymeraza (Polymerase
Chain reaction ampliíication techniques)

SDS

Sodium Dodecyl Sulíate

tbvk

Tế bào vi khuẩn

Viện Nghiên

Viện Nghiên cứu nuôi trổng thuỷ sản I, Bộ Thuỷ sản

cứu NTTS I
VI

Vacxin do Viện Nghiên cứu NTTSI điều chế thử

VI
DANH MỤC CÁC BẢNG

Tên bảng
Hàm lượng protein huyết thanh một số nhóm cá trắm
cỏ

50

Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ bố mẹ
trước và sau khi bị gây bệnh

52

Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ giống bị
gây nhiễm trùng ở những liều vi khuẩn khác nhau

53

Hàm lượng protein huyết thanh cá trắm cỏ giống
được tiêm vacxin và bị gây nhiễm trùng bằng dịch
chiết ổ dịch

55

Biến động hàm lượng protein huyết thanh của một số
nhóm cá trắm cỏ (thí nghiệm thực hiện năm 2002)

56

Trị số khối lượng phân tử protein huyết thanh cá khoẻ
xác định trên điện di đổ

59

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá bố mẹ sau khi đẻ

60

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá bố mẹ

63

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá giống khoẻ mạnh

64

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá giống được tiêm nước muối
sinh lý

66

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá giống bị gây nhiễm trùng

Trị số khối lượng phân tử xác định trên điện di đồ
protein huyết thanh cá giống

68


Vll
Bảng

Tên bảng

3.13

Trị số khối lượng phân tử protein huyết thanh cá

Trang

giống (khối lượng 0,04-0,06kg) bị gây nhiễm vi
khuẩn A. hydrophila, lấy máu 96 giờ sau khi gây
nhiễm trùng
3.14

Trị số khối lượng phân tử protein huyết thanh cá trắm
cỏ bị bệnh tự nhiên

3.15

76

Trị số khối lượng phân tử protein huyết thanh cá trắm

cỏ trước và sau khi bị tiêm dịch chiết ổ dịch

3.16

73

80

Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh đốm đỏ cho
cá trắm cỏ

96


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, ẢNH
Tên hình
Sắc ký IgM cá hổi Salmo salar trên cột trao đổi ion
MonoQ.

13

Lượng kháng sinh sử dụng để nuôi cá hổi và sản lượng
cá hồi ở Na-uy từ năm 1986 đến năm 1999

23

Cá trắm cỏ bị nhiễm bệnh đốm đỏ ngoài tự nhiên và cá
bị gây nhiễm trùng bằng vi khuẩn A. hydrophila a

36

Huyết thanh cá trắm cỏ

36

Bể ni cá thí nghiệm 3m3 trong phịng thí nghiêm ướt
tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I

38

Các bể ni thí nghiệm lm3 có mái che Viện Nghiên
cứu ni trồng thuỷ sản I

38

Cá trong bể thí nghiệm lm3 tại phịng thí nghiệm ướt
Viện Nghiên cứu ni trồng thuỷ sản I

39

Các bể thí nghiệm 80 lít trong nhà thí nghiệm ướt tại
Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản Viện I

39

Các bể thí nghiệm 4,5m3 ngồi trời tại Viện Nghiên cứu

40

ni trồng thuỷ sản I
Khu bể thí nghiệm 25m3 ngồi trời của Viện Nghiên

40

cứu nuôi trồng thuỷ sản I
Vi khuẩn A. hydrophila,

X

24.000 lần

Cột sắc ký, máy li tâm, máy điện di và máy quang phổ
Máy siêu âm

41
45


IX

Tên hình

Định tính hoạt độ proteaza ngoại bào của các chủng vi
khuẩn được dùng làm nguyên liệu điều chế vacxin

47

Điện di đổ protein huyết thanh cá trắm cỏ bố mẹ sau

khi đẻ, trước và sau khi bị tiêm dịchchiết ổ dịch

61

Điện di đồ protein huyết thanh mộtsố mẫu cá trắm cỏ

62

Điện di đồ protein huyết thanh mộtsố mẫu cá trắm cỏ

72

Điện di đồ protein huyết thanh mộtsố mẫu cá trắm cỏ

79

Sắc ký đồ protein huyết thanh cá trắm cỏ trên cột
ultrogel AcA-22 (thí nghiệm năm 2004)

85

Sắc ký đồ protein huyết thanh cá trắm cổ trên cột
sepharoza 4B (thí nghiệm năm 2005)

86

Điện di đồ protein huyết thanh cá trắm cỏ sau khi tinh
sạch bằng sắc ký lọc gel

87

Điện di đồ izozym esteraza huyết thanh cá trắm cỏ (thí
nghiệm năm 2002)

89

Điện di đổ izozym esteraza huyết thanh cá trắm cỏ (thí
nghiệm năm 2005)

90

Điện di đồ izozym a xít photphataza huyết thanh cá
trắm cỏ (thí nghiệm năm 2002)

92

Điện di đồ izozym a xít photphataza huyết thanh cá
trắm cỏ (thí nghiệm năm 2005)
Tỷ lệ chết lũy kế (%) của các dịng cá rơ phi
Oreochromis niloticus trong 6 ngày thử thách với vi
khuẩn Aeromonas hydrophila

93


MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nuôi trổng thùy sản là ngành phát triển
nhanh nhất trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm, “đã và đang góp phần quan
trọng trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế, đảm bảo an ninh thực phẩm, nguyên

liệu cho chế biến; tạo công ăn, việc làm; xố đói giảm nghèo và góp phần đưa
Ngành Thủy sản thực sự trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn
của nước ta” [3].
Tuy nhiên, vấn để bệnh thuỷ sản (“bệnh cá”) là khó khăn đầu tiên trong
việc phát triển ni nhiều đối tượng thuỷ sản có giá trị kinh tế. Đồng thời, việc
sử dụng các phương tiện vận chuyển hiện đại, hiệu quả trong kinh doanh thủy
sản tươi sống cũng dễ làm lây lan bệnh vào nhiều hệ thống nuôi [33], [97].
Thiệt hại hàng năm do bệnh cá gây ra cho thế giới là khoảng 3 tỷ đô la Mỹ.
Để phòng, trị bệnh cá, nhiều loại thuốc đã được sử dụng trong nuôi
trồng thuỷ sản, song dư lượng thuốc trong thực phẩm từ thủy sản có thể gây
ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người cho nên nhiều loại kháng sinh, hoá
chất đã bị cấm sử dụng trong ni trồng thủy sản. Vì vậy, việc nghiên cứu
miễn dịch học động vật thuỷ sinh để tìm ra các biện pháp phòng và trị bệnh cá
đang phát triển mạnh, là một cuộc cách mạng trong nghề nuôi thuỷ sản.
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu và ứng dụng miễn dịch
học cá, song ở nước ta việc nghiên cứu về miễn dịch học cá cũng như nghiên
cứu ứng dụng vacxin chưa được chú ý một cách thích đáng. Điều này được thể
hiện qua các cơng trình khoa học về nuôi trồng thuỷ sản và sinh học liên quan
đến nuôi trổng thuỷ sản được công bố trong 20 năm gần đây: trong số 453
cơng trình đã được cơng bố chỉ có 10 cơng trình ít nhiều có liên quan đến
miễn dịch cá hoặc phương pháp miễn dịch học, trong đó có 5 cơng trình mà
Tác giả Luận án là đồng tác giả.
Cá trắm cỏ là một trong những đối tượng nuôi nước ngọt chủ yếu ở
nước ta [5], đã và đang được nuôi ở miền Bắc và Tây nguyên Trung bộ. Tuy


-2-

nhiên, trắm cỏ là một trong những loài cá dễ bị bệnh viêm ruột, thường gọi là
bệnh đốm đỏ. Trong những năm 1986-1995 bệnh đốm đỏ xuất hiện chủ yếu ở

cá trắm cỏ ni lồng, trong đó riêng năm 1993-1994 có trên 5.000 lồng ni
cá bị bệnh đốm đỏ. Từ 1994-1998 bệnh này xuất hiện ở hầu hết các ao nuôi cá
trắm cỏ bố mẹ và cá nuôi thịt. Trong những nãm 1999-2001 các hệ thống nuôi
cá trắm cỏ liên tiếp xuất hiện bệnh này, gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá
nước ngọt [15], [16], [173].
Được sự đồng ý của Trường Đại học Thuỷ sản và được Bộ Giáo dục và
Đào tạo chấp thuận, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch
của cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon ỉdellus

c. & V.) nuôi tại khu vực Hà Nội

đối với vi khuẩn Aeromonas hydrophila”.
- Mục tiêu của Luận án:

+ Xác định sự đáp ứng miễn dịch của cá đối với kháng nguyên được
biểu hiện qua hệ thống izozym, kháng thể, protein miễn dịch của cá trắm cỏ;
+ Xác định biện pháp miễn dịch góp phần nâng cao sức đề kháng của
cá trắm cỏ đối với vi khuẩn gây bệnh đốm đỏ.
.■Đối tượng nghiên cứu: cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idellus
- Nội dung Luận án:

c. & V.
*

+ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá trắm cỏ biểu hiện qua hệ thống
izozym, kháng thể và các protein miễn dịch ở cá trắm cỏ;
+ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch biểu hiện qua khả năng sống sót của
cá trắm cỏ đối với vacxin điều chế thử nghiệm có nguồn gốc là phức hệ kháng
nguyên vi khuẩn Ả. hydrophila.
- Tính mới và ý nghĩa khoa học của Luận án:

+ Luận án là một trong vài cơng trình đầu tiên nghiên cứu cơ bản về
miễn dịch học cá tại Việt Nam.
»


-3-

+ Luận án là cơng trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu về đáp ứng
miễn dịch ở cá trắm cỏ (và ở cá nói chung) biểu hiện qua sự thay đổi về chất
lượng protein huyết thanh của chúng.
+ Là công trinh đầu tiên ở Việt Nam thử nghiệm vacxin tự điều chế từ
các kháng nguyên protein ngoại bào và nội bào của vi khuẩn gây bệnh để dự
phòng bệnh cá.
+ Là cơng trình đầu tiên trong khoa học phát hiện có sự liên quan giữa
số vạch izozym esteraza và izozym photphataza trên điện di đồ protein huyết
thanh cá với một bệnh ở cá.
- Ý nghĩa thực tiễn của Luận án:

+ Cùng với cơng trình nghiên cứu về sử dụng vacxin để phòng bệnh cho
cá của các tác giả khác [17], Luận án góp phần khai phá cho những bước đi
đầu tiên theo hướng áp dụng các biện pháp phòng bệnh tiên tiến trong đó có
phương pháp chủng ngừa nhằm nâng cao hiệu quả của nghề nuôi cá ở nước ta.
+ Kết quả của đề tài Luận án giúp Ngành Thủy sản có cơ sở khoa học
và một số thơng tin cần thiết để xem xét, mở hướng nghiên cứu miễn dịch học
cá, một hướng nghiên cứu đã góp phần đạt hiệu quả cao trong nuôi trồng thủy
sản ở những nước tiên tiến nhưng chưa được phát triển ở Việt Nam.
Ghi chú: Các thuật ngữ và cách phiên âm tiếng nước ngồi đơi khi cịn được dùng
một cách chưa thống nhất, vì thế, trong Luận án này tác giả dùng thuậtmgữ và phiên
âm chủ yếu dựa vào Từ điển Sinh học Anh Việt & Việt Anh (1997) [2], Từ điển miễn
dịch học Anh-Việt và Việt-Anh (1989) [9] và cuốn sách Miễn dịch học cơ sở (in lần

thứ hai, có sửa chữa, bổ sung, của GS-TS Đỗ Ngọc Liên (2004) [11].


-4CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Miễn dịch ở cá xương

Hệ thống miễn dịch của cá xương (dưới đây xin gọi tắt là cá) gồm miễn
dịch tự nhiên và miễn dịch tiếp thu. Hệ thống này phát triển hơn hệ thống
miễn dịch ở động vật không xương sống nhưng chưa phát triển bằng hệ thống
miễn dịch ở các lớp động vật có xương sống bậc cao khác (Phụ lục 1).
1.1.1. Miễn dịch tự nhiên ở cá xương
ỉ .1.1.1. Hệ thống miễn dịch tự nhiên ở cá xương
Hệ thống miễn dịch tự nhiên ở cá bao gồm các hàng rào của cơ thê
chống lại sự nhiễm trùng, như hệ thống thực bào và hệ thống bảo vệ bằng thể
dịch trong đó có lớp nhớt (dịch nhầy) bao bọc cơ thể. Lớp nhớt này có chứa bổ
thể, lysozym, proteaza ‘giống-trypsin’ - những chất có thể làm tan vi khuẩn
gram âm [1271, [185]. Tuy nhiên, kháng nguyên có thể xâm nhập vào cơ thể
qua vùng bề mặt biểu bì bị tổn thương, qua mang, cơ quan đường bên và ống
tiểu hoá [165]. Kháng nguyên lọt vào cơ thể sẽ bị chặn bởi nhiều yếu tố
plasma bảo vệ, trong đó có lysozym, bổ thể, transíerrin, lectin, trypsin [46], a2 macroglobulin, a-preciptin, huyết thanh dạng sợi A, huyết thanh dạng sợi p
[112], [241]. Protein phản ứng c tuy chưa được phân lập ở cá nhưng trong
thành phần protein huyết thanh cá hổi có tới 40% tương ứng với protein phản
ứng c và huyết thanh dạng sợi p của người [112].
Bổ thể là phần cốt yếu của hệ thống miễn dịch tự nhiên. Có khoảng 35
[58] hay trên 40 [11] loại protein tham gia vào hoạt động bổ thể, trong đó có
các protein hồ tan và protein gắn kết với màng tế bào. Bổ thể có nhiều chức
năng, song chức năng chủ yếu là giết mầm bệnh bằng cách tạo nên những lỗ
thủng ở màng tế bào của chúng nhờ .cơ chế hoạt hoá bằng 3 con đường khác
nhau: con đường cổ điển, con đường bên cạnh và con đường lectin MB [11],
[106] (Phụ lục 2). Cả ba con đường hoạt Ịhoá bổ thể này đều có ở cá, ngoại trừ

nhóm cá khơng hàm, một nhóm cá khơng có con đường hoạt hoá cổ điển và
con đường tiêu bào, tức là không tạo nên phức hợp tấn công màng [84], [106],
[163] . Ngồi ra, bổ thể cịn có vai trị quan trọng trong việc tiêu huỷ các phức
hợp miễn dịch sau đáp ứng miễn dịch và tham gia vào phản ứng viêm bằng
cách hấp dẫn các thực bào đến vị trí bị tổn thương. Bằng cách opsonin hố
mầm bệnh [87], [171], [193], protein bổ thể có thể kích thích thực bào - một
quá trình được xúc tác bởi các thụ quan dành cho bổ thể trên bề mặt thực bào
và tiêu diệt mầm bệnh [104], [110], [124], [149], [193]. Một khía cạnh đặc
sắc của bổ thể là khả năng điều chỉnh các đáp ứng miễn dịch bằng cách tự gắn
kết vào các thụ quan trên bề mặt bạch cầu [55], [78], [192]. Vì thế, bổ thể cịn
là cầu nối giữa đáp ứng miễn dịch tiếp thu và đáp ứng miễn dịch tự nhiên. Sự
khác nhau lớn nhất giữa bổ thể ở động vật có vú và ở cá xương là ở chỗ, ở cá
xương, thành phần bổ thể rất đa dạng, đặc biệt là trong trường hợp C3: có 4
dạng C3 đã được phát hiện ở cá hồi [205], [212], 5 dạng C3 ở cá chèm, 8 dạng
ở cá chép và 3 dạng ở cá cá sóc (Oryiias latipes) [212]. ở một số loài cá,
thành phần C3 của bổ thể có ít nhất là 5 isotyp [161], [211], [213]. Protein bổ
thể cá có nhiều isotyp và các gen C3 ở cá có nhiều hình thái và điều đó có thể
phát sinh một cơ chế khác làm cho các phân tử C3 càng trở nên đa dạng [111],
[164] . Có thể sự đa dạng về protein bổ thể giúp cho cá tăng cường khả năng
nhận biết của miễn dịch tự nhiên [58], [210].
Bổ thể có thể cũng có vai trị trong đáp ứng miễn dịch chống lại việc
nhiễm ký sinh trùng [50], [240].
Các thực bào chủ yếu là tế bào mono, đại thực bào, bạch cầu hạt và tế
bào giết tự nhiên. Việc tiếp cận đến bề mặt tế bào là có chọn lọc và các tế bào
vật chủ khỏe mạnh khơng bị thực bào do có cơ chế bảo vệ của phức hệ phù
hợp tổ chức chủ yếu (MHC) lớp I [143]. Các đại thực bào có khả năng thực
bào lớn hơn nhiều so với các thực bào hạt, mặc dù số lượng thực bào hạt có
nhiều hơn số lượng đại thực bào [214]. Cũng như ở động vật có vú, sau khi

-6-

thực bào, thực bào hạt ở cá bị mất dạng hạt, giải phóng các yếu tố hướng hố
và các phân tử histamin để gây viêm và thâm nhiễm [127]. Quá trình thực bào
các vi khuẩn sống ở cá bị kìm hãm ở nhiệt độ thấp (theo tổng quan của
Secombes [196]).
Lysozym có trong huyết thanh và trong chất dịch nhầy của cá, đặc biệt
là chúng gắn kết với bạch cầu hoặc các mô giàu bạch cầu, như thận, lách và
ruột. Các bạch cầu mono, đại thực bào và bạch cầu trung tính được xem như
những nguồn cung cấp lysozym [158]. Ngồi ra, các peptit kháng khuẩn đã
được phát hiện ở cá và dịch nhầy cũng là một nguồn cung cấp lysozym kháng
khuẩn [141], [241]. Lysozym có một số dạng, có những dạng có hoạt tính
kháng khuẩn, nhất là đối với vi khuẩn gram dương. Chúng có thể có hoạt động
tiêu bào hoặc có tác động như là opsonin. Cá hồi có 2 dạng lysozym, trong đó
ít nhất có một dạng có khả năng diệt một số mầm bệnh, kể cả vi khuẩn
Aeromonas hydrophila [88]. Có sự khác nhau đáng kể về hoạt tính của
lysozym ở thận giữa các lồi cá và giữa các dịng khác nhau trong cùng một
lồi: cá hổi cầu vồng thu được từ các địa điểm khác nhau có hoạt tính lysozym
thận chênh nhau 5-10 lần [90]. Hoạt tính của lysozym huyết thanh ở các dịng
cá rơ phi vằn (Oreochromis niỉoticus) cũng khác nhau đáng kể và có liên quan
khá chặt chẽ với tỷ lệ đại thực bào có chứa vi khuẩn bị thực bào và với tổng
khối lượng tính theo gam của các đại thực bào có trong mô thượng thận. Do
đại thực bào tổng hợp lysozym nên sự liên quan trên có thể cho thấy khi đại
thực bào có mặt nhiều hơn thì lysozym cũng được tổng hợp nhiều hơn [191].
Lysozym cũng đã được tinh sạch từ cá bơn [80].
Tế bào giết tự nhiên có khả năng nhận biết và phá huỷ các dòng tế bào
khối u và các tế bào biến dạng bất thường cũng như một số vi sinh vật gây
bệnh khác, đồng thời có hoạt động điều khiển miễn dịch [11].

Hệ thống miễn dịch trung gian tế bào ở cá hồi và cá chép được thành
thục vào tuần thứ 2-4 sau khi nở [42].


-7-

/.7.7.2. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên ở cá xương
Hệ thống miễn dịch tự nhiên hoạt động dựa vào các thụ quan đã được
mã hố bởi dịng mầm bệnh (germline-encoded receptors). Các thụ quan này
nhận biết cấu trúc phân tử của mầm bệnh và không cần mồi để tương tác với
các thành phần chủ yếu của mầm bệnh. Tính khơng đặc hiệu là một thuộc tính
rất mạnh tạo nên tính đa năng rất lớn và, ở cá, có thể có vai trị quan trọng hơn
so với ở động vật có vú, đặc biệt là do đáp ứng miễn dịch tiếp thu ở cá diễn ra
chậm hơn, nhất là. trong điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu đối với
sinh lý cá [38]. Tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên có tác nhân vật lý và
hố học chủ yếụ, thường xuyên có mặt trong cơ thể và các tác nhân có thể
xuất hiện trong q trình đáp ứng miễn dịch như các chất trung gian gây viêm
và các protein ở pha cấp tính. Những tác nhân này phải được điều khiển trong
một đáp ứng miễn dịch chủ động [196]. Lysozym cũng có ở trứng cá với chức
năng bảo vệ phôi trước khi các cơ chế bảo vệ đặc hiệu được hồn thiện.
Lysozym cá có những dạng khác nhau với mức độ hoạt tính khác nhau [88],
có phổ hoạt động rộng hơn so với lysozym động vật có vú và hoạt động rất
mạnh chống lại vi khuẩn gram âm (là mầm bệnh chủ yếu đối với cá) cũng như
vi khuẩn gram dương [89], [241]. Hiện tượng này có thể là do có các phân tử
izozym, như hai dạng đã xác định được ở cá hồi và một trong hai dạng đó đã
tăng hoạt tính đối với vi khuẩn gram âm [89]. Các lồi cá khác nhau có hàm
lượng lysozym khác nhau, như hàm lượng lysozym ở cá hồi cầu vồng cao gấp
15 lần ở cá hồi Đại Tây Dương [132]; nhóm cá tuyết có hàm lượng lysozym
thấp nhất [90], [132]. Trong một số trường hợp, hàm lượng lysozym tỷ lệ
thuận với sức kháng bệnh [79], vì vậy, ỉysozym thường được sử dụng như là

một chất chỉ thị về chức năng miễn dịch tự nhiên [241], và hoạt tính của
lysozym sau stress (poststress lysozyme activity) có triển vọng được sử dụng
trong việc chọn giống có khả năng kháng stress và cũng do đó là khả năng
kháng bệnh [79].