Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với Protein tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****








KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




N
N
G
G
H
H
I
I
Ê
Ê
N
N

C
C
Ứ
Ứ
U
U


Đ
Đ
Á
Á
P
P


Ứ
Ứ
N
N
G
G


M
M
I
I
Ễ
Ễ

N
N


D
D
Ị
Ị
C
C
H
H


Đ
Đ
Ố
Ố
I
I


V
V
Ớ
Ớ
I
I

P
P
R
R
O
O
T
T
E
E
I
I
N
N


T
T
Á
Á
I
I


T
T
Ổ
Ổ

H
H
Ợ
Ợ
P
P


M
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2
e
e
B
B


T
T

R
R
Ê
Ê
N
N


T
T
H
H
Ỏ
Ỏ








Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa : 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



N
N
G
G
H
H

I
I
Ê
Ê
N
N


C
C
Ứ
Ứ
U
U


Đ
Đ
Á
Á
P
P


Ứ
Ứ
N
N
G
G

M
M
I
I
Ễ
Ễ
N
N


D
D
Ị
Ị
C
C
H
H


Đ
Đ
Ố
Ố
I
I

V
V
Ớ
Ớ
I
I


P
P
R
R
O
O
T
T
E
E
I
I
N
N


T
T
Á
Á
I
I

T
T
Ổ
Ổ


H
H
Ợ
Ợ
P
P


M
M
B
B
P
P
-
-
V
V
T
T
2
2

e
e
B
B


T
T
R
R
Ê
Ê
N
N


T
T
H
H
Ỏ
Ỏ

Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện:
TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI
PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG












Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8-2005

iii
LỜI CẢM ƠN

Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự
hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ
Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã
truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người
Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá
luận.
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang,

người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp
con hoàn thành khoá luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy
đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị
Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim,
Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong
suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp.
Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui
buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.











iv
TÓM TẮT
PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005.
“NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-
VT2eB TRÊN THỎ”.
Hội đồng hướng dẫn:
TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải
PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang
Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu

và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta.
Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận
được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được
chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được
protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng
dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo .
Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố
VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố
verotoxin.
Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu:
- Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể
kháng MBP-VT2eB có hiệu quả.
- Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ
tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.
- Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà
độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo).



v
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT ....................................................................................................................iv
MỤC LỤC .....................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ xii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...................................................................................... xiii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ..................................................................................xiv
PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................................1
1.1. Mở đầu ..............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu .........................................................................................1
1.2.1. Mục tiêu.....................................................................................................1
1.2.2. Yêu cầu......................................................................................................2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................3
2.1. Kháng nguyên...................................................................................................3
2.2. Kháng thể..........................................................................................................3
2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) ............................................................................................4
2.2.2. Chuỗi nặng (H)..........................................................................................4
2.3. Đáp ứng miễn dịch ...........................................................................................5
2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu............................6
2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo....6
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ..........................................7
2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể .............................................................................10
2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ....................................................................15
2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two
dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)...................................................................15
2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể ............................................15
2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double
diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) ......................................17

vi
2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.................18
2.7.1. Sơ lược về tế bào vero.............................................................................18
2.7.2. Độc tố VT2e ............................................................................................19
2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố

trên môi trường tế bào vero....................................................................20
PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...............................21
3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21
3.3. Vật liệu và hoá chất........................................................................................21
3.3.1. Thú thí nghiệm .......................................................................................21
3.3.2. Vật liệu và hoá chất ................................................................................21
3.3.3. Môi trường ..............................................................................................22
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................22
3.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22
3.4.1. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................22
3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .................................................................................24
3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh ..................................................................24
3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh ........................................................................24
3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ........ 24
3.4.4.2. Hòa tan kháng thể ...................................................................25
3.5. Đánh giá .........................................................................................................27
3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật
Ouchterlony) .....................................................................................................27
3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường
tế bào vero ........................................................................................................ 28
3.5.2.1. Xác định liều TCID
50
(Tissue Culture Infectious Dose 50) .....28
3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ................................................ 31

vii
3.6. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 33
3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu .................................................................33
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34

4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ
thuật Ouchterlony.................................................................................................. 34
4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng ..................................................34
4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình
ngắn ngày và dài ngày ......................................................................................35
4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày ......................................................................35
4.1.2.2. Quy trình dài ngày .........................................................................36
4.1.3. Nhận xét...................................................................................................38
4.2. Xác định liều TCID
50
....................................................................................41
4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ................42
4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero ..............42
4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN
3
và tế bào vero .......................43
4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN
3
và có bất hoạt .......................43
4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN
3 ..............................................................
44
4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN
3
và có bất hoạt .................44
4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ..................46
4.3.2.1. Quy trình dài ngày ...........................................................................47
4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày ........................................................................50
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................53
PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................54

PHỤ LỤC ................................................................................................................56




viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ag
ATCC

DAG
DMEM

TCID
50


EDTA

FBS
Gb4
Ig
IL2
IL4
IL5
IL6
IP
3

LB
MAF

MBP
MHC class II antigens

MIF

MWCBs

PCR
Antigen
American Type Culture
Collection
Diacylglycerol
Dulbeccos Minimal
Essential Medium
Tissue culture infectious
dose 50
Ethyllene diamine tetra
acetic acid
Fetal Bovine Serum
Globotetraosyl ceramide
Immunoglobulin
Interleukin 2
Interleukin 4
Interleukin 5
Interleukin 6
Inositol triphosphate
Lubria – Bertani

Macrophage activating
factor
Maltose binding protein
Major histocompatibility
complex class II antigens
Macrophage inhibitation
factor
Manufacturer's working
cells bank
Polymerase chain reaction
Kháng nguyên
Tổ chức sưu tầm nhân
giống Mỹ







Huyết thanh bào thai bê

Globulin miễn dịch






Yếu tố có tác dụng hoạt

hoá đại thực bào

Các kháng nguyên phù hợp
tổ chức chính lớp II


Ngân hàng tế bào đang làm
việc


ix
PBS
SLT
T
C

T
DTH


T
I

T
H

Vero
VT
VT2e (SLT-IIv)
VT2eB

Phosphate buffer stalin
Shiga-like toxin
Cytotoxic T cell
Delayed type
hypersensitivity T cell
Inducer T cell
Helper T cell
Vervet Monkey Origin
Verotoxin
SLT-II variant
VT2e subunit B



Tế bào lympho T gây độc
Tế bào lympho T gây quá
mẫn muộn
Tế bào lympho T cảm ứng
Tế bào lympho T giúp


Độc tố Shiga-like toxin IIv
Tiểu đơn vị B của VT2e

x
DANH MỤC CÁC HÌNH

TRANG
Hình 2.1:
Hình 2.2:

Hình 2.3:
Hình 2.4:

Hình 2.5:
Hình 2.6:

Hình 2.7:

Hình 2.8:


Hình 3.1:
Hình 3.2:
Hình 4.1:

Hình 4.2:

Hình 4.3:

Hình 4.4:

Hình 4.5:


Hình 4.6:
Cấu trúc kháng thể ................................................................................5
Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được
phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh ...................7
Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B ........................11
Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề
mặt tế bào lympho B............................................................................12
Sự kết hợp giữa tế bào lympho T
H
và tế bào lympho B......................13
Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho
T
H
........................................................................................................13

Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình
đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên .........14
Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B),
đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch
tán kép trên thạch ................................................................................18
Bao thẩm tích ......................................................................................26
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) ..27
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................34
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................35
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc
lại 2) ....................................................................................................36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................36
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................36

Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc

xi

Hình 4.7:

Hình 4.8:

Hình 4.9:

Hình 4.10:

Hình 4.11:

Hình 4.12:

PHỤ LỤC
Hình 1:
Hình 2:
Hình 3:
Hình 4:
Hình 5:
Hình 6:
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc
lại 1) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc
lại 2) ....................................................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................37
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng
+ kháng huyết thanh) ..........................................................................38
Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn
dịch ......................................................................................................40

Tế bào vero .........................................................................................60
Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e .......................................60
Thú thí nghiệm ....................................................................................61
Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ ....................................................61
Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ ..................................................................62

Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ....................................62













xii
DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 4.1:

Bảng 4.2:
Bảng 4.3:
Bảng 4.4:

Bảng 4.5:
Bảng 4.6:
Bảng 4.7:
Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây
miễn dịch ................................................................................................39
Kết quả đo OD
620

mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e ................41
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) .........45
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại
4) .............................................................................................................47
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ..................................48
Kết quả đo OD
620
của mẫu thỏ 2 ............................................................50
Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch .....52

xiii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

TRANG
Sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.2:
Sơ đồ 3.3:
Sơ đồ 3.4:
Quy trình tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ........................25
Quy trình xác định liều TCID
50
..............................................................29
Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm ........30
Quy trình trung hòa độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero............... 32

xiv

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1:
Biểu đồ 4.2:

Biểu đồ 4.3:

Biểu đồ 4.4:

Biểu đồ 4.5:
Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e ............................................................42
Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi
nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero .............................................46

Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi
nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero .............................................49
Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi
trường tế bào vero .............................................................................49
Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero .51


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. MỞ ĐẦU

Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và
tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Vì
vậy, các nghiên cứu giúp phòng bệnh, phát hiện, giám sát các tác nhân gây bệnh là vấn
đề đang nhận được sự quan tâm hàng đầu.
Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh tiêu chảy và phù đầu ở heo con tuy có
hiệu quả nhưng gây nhiều triệu chứng phụ, như rối loạn tiêu hoá, không có chức nă
ng
phòng bệnh và tạo ra những chủng vi sinh vật kháng kháng sinh (gây khó khăn cho
việc trị bệnh lâu dài). Để khắc phục những khó khăn trên, phương pháp dùng vaccin để
phòng ngừa bệnh cho heo hứa hẹn mang lại hiệu quả hơn. Tuy nhiên, hầu hết các loại
vaccin hiện nay được sản xuất theo phương pháp cổ điển bằng cách sử dụng vi khuẩn
chết hay vi khuẩn nhược độc nên tính đặc hiệu không cao và gây một số phả
n ứng phụ
có hại. Phương pháp này gặp một số bất lợi như hiện tượng phục hồi một số tính độc
ban đầu hay sự phân huỷ không hoàn toàn các độc tố, dễ dẫn đến các hiệu ứng không
mong muốn ở các con thú được tiêm chủng. Hơn nữa, việc sử dụng vi khuẩn chết lại

đòi hỏi phải tiêm lập lại nhiều lần, vì tính gây đáp ứng miễ
n dịch không cao.
Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra
được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch
được protein này. Từ thực tế đó, được sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học,
với sự hướng dẫn của TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, PGS-TS khoa học Nguyễn Lê
Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch
đối với protein
tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ”.
1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục tiêu
Đánh giá hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp MBP-VT2eB
trên thỏ nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù
do E. coli gây ra trên heo.
2

1.2.2. Yêu cầu
 Thu nhận kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
 Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB.
 Thử khả năng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero.

3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. KHÁNG NGUYÊN
[2]
Kháng nguyên (Antigen, Ag) là một chất có khả năng gây đáp ứng miễn dịch khi
được đưa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặc một chất có khả năng phản ứng
với một kháng thể hoặc một tế bào của hệ thống miễn dịch.
Tính phản ứng của kháng nguyên hoặc khả năng nhận biết, khả năng liên kết đặc
hiệu củ
a kháng nguyên với kháng thể hoặc với thụ thể của tế bào phụ thuộc vào một
phần cấu trúc giới hạn của kháng nguyên được gọi là quyết định kháng nguyên
(antigenic determinant) hay epitop. Các epitop có hai đặc tính: tính kháng nguyên
(antigenicity) và tính sinh miễn dịch (immunogenicity).
Tính kháng nguyên là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung
với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể. Phần cấu trúc này của phân tử kháng
thể hoặc của thụ thể được g
ọi là paratop.
Tính miễn dịch của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một
cơ thể.
Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể của nó hoặc giữa kháng nguyên với
các thụ thể của tế bào có thẩm quyền miễn dịch mang tính đặc hiệu rất cao. Điều đó có
nghĩa là một kháng nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một kháng thể anti-A hoặc
chỉ có thể được nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặc hiệu với
kháng nguyên A.
2.2. KHÁNG THỂ
[1]

Kháng thể được gọi là globulin miễn dịch (Immunoglobulin, Ig), ở động vật hữu
nhũ có 5 lớp Ig: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, các Ig đều là protein hình cầu. Mỗi phân tử
Ig đều có hai cặp chuỗi polypeptide nặng ký hiệu là chuỗi H (heavy chain) và hai
chuỗi nhẹ ký hiệu là L (light chain). Sự khác biệt chủ yếu giữa hai lớp Ig với nhau là ở
chuỗi nặng. Các chuỗi H hoặc L trên cùng một phân tử kháng thể bao giờ cũng giống
nhau hoàn toàn từng đôi một.
4

2.2.1. Chuỗi nhẹ (L)
Chuỗi nhẹ có trọng lượng khoảng 22.000, có thể phân biệt hai type chuỗi nhẹ khác
nhau, đó là type kappa (κ) và type lambda (λ). Hai chuỗi này có tính kháng nguyên
khác nhau hoàn toàn.
Mỗi chuỗi nhẹ có 214 acid amin. Thứ tự các acid amin từ 108 – 214 là hoàn toàn
không thay đổi. Còn các acid amin từ số 1 – 107 có thể thay đổi về thứ tự. Đoạn này
được gọi là vùng thay đổi VL (variable light), trong vùng thay đổi có đoạn thay đổi
mạnh nhất gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions). Những đoạn siêu biến trong
chuỗ
i lambda là các đoạn từ vị trí acid amin 24 – 34, 50 – 56 và 89 – 97.
2.2.2. Chuỗi nặng (H)
Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, gồm 446 acid amin được chia
làm hai phần: vùng thay đổi VH (variable heavy) và vùng hằng định CH (constant
heavy).
Người ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch
polypeptide trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi:
- Gamma (γ) thì Ig đó được gọi là IgG.
- Muy (µ) thì Ig đó được gọi là IgM.
- Alpha (α) thì Ig đó được gọ
i là IgA.
- Delta (δ) thì Ig đó được gọi là IgD.
- Epsilon (ε) thì Ig đó được gọi là IgE.

Vùng thay đổi (VH): cũng giống như vùng thay đổi của chuỗi nhẹ, vùng này có
116 acid amin. Những vùng thay đổi mạnh nhất được gọi là vùng siêu biến chuỗi nặng.
Vùng hằng định (CH): ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn có một
nhóm glucide gọi là oligosaccharide được ký hiệu là CHO. CHO được gắn vào phần
CH
2
của phân tử kháng thể, đây là phần glucide của phân tử kháng thể có nhiệm vụ cố
định bổ thể, giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết
định tính kháng nguyên của phân tử kháng thể.
Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến chuỗi nặng và siêu biến chuỗi nhẹ
tham gia vào sự hình thành tính đặc hiệu trong sự kết hợp của kháng nguyên với kháng
thể.

5




2.3. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
[1]

Khi vào cơ thể, kháng nguyên được đại thực bào bắt giữ, xử lý và phân cắt để đưa
lên bề mặt tế bào các nhóm quyết định kháng nguyên, sau đó trình diện những thông
tin của các nhóm quyết định kháng nguyên này cho các loại tế bào lympho T để khởi
động đáp ứng miễn dịch, phát triển tạo tính miễn dịch cho cơ thể.
Trong số các tế bào lympho T đến nhận diện các quyết định kháng nguyên thì tế
bào lympho T cảm ứng (inducer T cell, T
I
) đóng vai trò quan trọng đặc biệt. Khi nhận
diện được các quyết định kháng nguyên đặc hiệu, tế bào lympho T

I
bị kích thích và tiết
ra các yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào MAF (macrophage activating factor),
đến lượt đại thực bào được hoạt hoá và tiết ra interleukin 1. Interleukin 1 sẽ tác động
trở lại lympho T
I
. Lúc này, lympho T
I
có đủ hai tín hiệu kích thích: một là quyết định
kháng nguyên đặc hiệu, hai là interleukin 1, đó là hai tín hiệu cần và đủ để hoạt hoá
lympho T
I
. Lympho T
I
sau khi được hoạt hoá sẽ tăng sinh và tiết ra interleukin 2,
interleukin 2 sẽ tác động lên một loạt các tế bào khác, trước hết là một loạt các tế bào
cùng đến nhận diện các quyết định kháng nguyên được trình diện trên bề mặt đại thực
bào như tế bào lympho T giúp (helper T cell, T
H
), lympho T gây quá mẫn muộn
(delayed type hypersensitivity T cell, T
DTH
). Các tế bào này sau khi nhận được các
quyết định kháng nguyên thì sẽ xuất hiện các thụ thể để tiếp nhận kích thích của
interleukin 2. Hai tín hiệu cần và đủ giúp chúng hoạt hoá và phát huy tác dụng.
Hình 2.1: Cấu trúc kháng thể
6

Các lympho T
DTH

sẽ tăng sinh và tiết ra các lymphokin có ảnh hưởng đến hoạt
động của các tế bào khác để chiêu mộ, hoạt hoá và kìm chân chúng tại nơi có mặt
kháng nguyên, dẫn đến hình thành phản ứng viêm kiểu quá mẫn muộn.
Các lympho T
H
sẽ tăng sinh và tiết ra các yếu tố hoà tan, yếu tố này cùng với kháng
nguyên là hai tín hiệu để kích thích lympho B biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất
kháng thể.
Các tiền tế bào lympho T gây độc sau khi nhận diện được phức hợp kháng nguyên
– kháng nguyên phù hợp tổ chứa chính trên bề mặt tế bào đích thì xuất hiện các thụ thể
để tiếp nhận tín hiệu từ interleukin 2. Khi đã có đủ hai tín hiệu, tiền tế bào lympho T
gây độc biệt hoá thành lympho T gây độc (cytotoxic T cell, T
C
), có khả năng gây độc
trực tiếp lên tế bào đích.
2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu
Khi kháng nguyên vào cơ thể lần đầu, chúng được đại thực bào xử lý và làm
nhiệm vụ trình diện cho lympho T
I
. Khi đó, đại thực bào đã được kích thích bởi kháng
nguyên và tiết ra interleukin 1; interleukin 1 lại kích thích tế bào lympho T
I
, làm chúng
tiết ra lymphokin gọi là interleukin 2, mở màn cho một loạt hoạt động của các tế bào
lympho khác. Tế bào lympho T tiết ra các lymphokin MIF (macrophage inhibition
factor), MAF tác động trở lại đại thực bào làm chúng hoạt động mạnh mẽ hơn. Trong
đáp ứng lần thứ nhất, hoạt động của các tế bào đã tạo nên một vòng kín khuếch đại tín
hiệu ban đầu nhưng còn yếu vì số tế bào đã được mẫn cảm lúc đầu còn ít, phải mấ
t
thời gian cho sự mẫn cảm cũng như cho sự sinh sôi nảy nở của dòng tế bào đã được

mẫn cảm.
2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo
Khi kháng nguyên vào cơ thể lần hai, kháng nguyên gặp ngay tế bào lympho T
đã mẫn cảm, tức là đã có những thụ thể (receptor) kiểu kháng thể ở trên bề mặt và sự
kết hợp như kháng nguyên – kháng thể tạ
o nên kích thích để chúng tiết ra các
lymphokin trong đó có MIF, MAF làm tế bào đại thực bào đứng tại chỗ, tăng cường
hoạt động nuốt và tiêu hoá kháng nguyên. Mặt khác, các đại thực bào lại tiết ra
interleukin 1 để kích thích lympho T
I
tăng tiết interleukin 2, cơ chế hoạt động cũng
tương tự lần 1, nhưng có hai điểm khác biệt:
- Mức độ phản ứng do có nhiều tế bào đã mẫn cảm nên mạnh mẽ hơn nhiều.
- Phản ứng khởi phát là sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
7






2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch
- Tính lạ của kháng nguyên
Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự
khác biệt chủng loài giữa thú được gây miễn dịch và kháng nguyên. Trong miễn
dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với cơ thể thú bao nhiêu thì khả năng sinh
miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Ví dụ: Albumin gà sẽ tạo kháng thể cao hơn
albumin bò khi cùng tiêm cho dê. Trong miễn d
ịch qua trung gian tế bào chỉ
cần sự khác biệt giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao, ví dụ như

phản ứng thải bỏ mảnh ghép của chuột A khi ghép một bộ phận nào đó của
chuột B.
- Cấu tạo hoá học của kháng nguyên
Các kháng nguyên là protein hay polysaccharide đều có tính miễn dịch cao
khi chúng ở dạng hoà tan hay trong cấu trúc phức tạp, ví dụ: vỏ vi khuẩn, các
loại protein trong máu.
Các chất khác gồ
m lipide, steroid, acid nucleic có tính sinh miễn dịch yếu
hoặc không có tính sinh miễn dịch, trừ khi chúng được gắn với một protein tải
để trở thành một phức hợp có tính sinh miễn dịch.
Hình 2.2: Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản
ánh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)
8

Các kháng nguyên được tổng hợp từ một loại acid amin thì có tính sinh
miễn dịch yếu. Các kháng nguyên được tổng hợp từ hai loại acid amin trở lên sẽ
có tính sinh miễn dịch cao. Nếu trong mạch polypeptide có thêm acid amin
mạch vòng (đặc biệt là tyrosine) sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của phân tử
polypeptide đó.
Các polypeptide được tổng hợp từ các acid amin dạng D có tính sinh miễn
dịch thấp vì nó ít bị chuyển hoá. Sự chuyển hoá kháng nguyên trong cơ thể vật
chủ là yế
u tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi bị chuyển hoá các
kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định kháng nguyên ra ngoài.
- Kích thước của phân tử kháng nguyên
Kháng nguyên càng có kích thước phân tử lớn và cấu trúc càng phức tạp thì
tính sinh miễn dịch càng cao. Một phân tử kháng nguyên càng lớn thì nó càng
có cấu trúc phức tạp và có nhiều quyết định kháng nguyên, đó là một trong
những yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch cao.

- Cách gây miễn dịch và liều lượng của kháng nguyên
Ngoài các y
ếu tố trên, còn có những các yếu tố khác ảnh hưởng đến tính
sinh miễn dịch:
• Đường đưa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: với những kháng nguyên
mạnh, đưa kháng nguyên vào đường mạch máu có thể dễ dàng gây đáp
ứng miễn dịch, ví dụ: virus, vi khuẩn, tế bào. Nhưng với những kháng
nguyên hoà tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp, tốt nhất là
đường tiêm trong da, dưới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần.
• Liề
u lượng kháng nguyên: Nếu lượng kháng nguyên quá ít thì không đủ
gây đáp ứng miễn dịch. Ngược lại, nếu lượng kháng nguyên nhiều quá sẽ
gây ức chế miễn dịch.
• Quy trình gây miễn dịch cũng ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của
phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên
hai lô thú thí nghiệm thuần chủng nhưng ở hai quy trình gây miễn dịch
khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loạ
i kháng
nguyên thích hợp với một loại quy trình gây miễn dịch riêng. Với những
kháng nguyên yếu thường phải được gây miễn dịch bằng quy trình hết
sức nghiêm ngặt và gây miễn dịch nhiều lần thì mới có đáp ứng miễn
9

dịch mạnh. Trong khi đó, với những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần
gây miễn dịch một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch mạnh.
- Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây miễn dịch nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì
kháng thể đặc hiệu được sinh ra tương ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất
ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện
tượ

ng này được gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng
nguyên.
Nếu cùng một lúc cho con thú mẫn cảm với hai loại kháng nguyên: một
kháng nguyên liều mạnh và một kháng nguyên liều nhẹ thì con thú có thể chỉ
phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tượng này gọi là sự cạnh tranh
kháng nguyên. Hiện tượng cạnh tranh kháng nguyên chỉ xảy ra ở hai kháng
nguyên có cấu trúc hoá học gần giống nhau.
- Phản ứng thứ phát (phản ứng nhớ)
Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã được mẫn cảm với
kháng nguyên đó một lần rồi, thì hàm lượng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều
hơn lần đầu. Phản ứng nhớ này tồn tại trong một thời gian khá dài sau mũi tiêm
thứ nhất, đó là nhờ các tế bào lympho B sau khi tiếp xúc với kháng nguyên đã
phân chia và biệt hoá trở thành tế bào ghi nhớ (memory cell), để khi kháng
nguyên vào những lần sau sẽ
lập tức tăng sinh thành dòng tế bào đã có hoạt tính
miễn dịch.
- Chất bổ trợ
Ngày nay, tá chất được sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại
vaccin, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài
ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn
dịch.
Qua các nghiên cứu gần đây, tá chất còn có tác dụng làm tăng t
ế bào T
H
.
Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn
trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên được giải phóng dần dần, có tác dụng giống
như kích thích miễn dịch nhiều lần.

10

- Khả năng đáp ứng của thú
Ngày nay, người ta biết rằng với cùng một loại kháng nguyên, nếu đưa vào
các cơ thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau.
Tính sinh miễn dịch = tính kháng nguyên + khả năng đáp ứng miễn dịch của vật
chủ
Khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ phụ thuộc vào tính di truyền.

2.4. CƠ CHẾ MIỄN D
ỊCH DỊCH THỂ
[13]

Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể là do tế bào lympho B đảm nhận. Đầu tiên,
các tế bào nguồn (trong tủy xương) biệt hoá thành tế bào lympho B khởi thuỷ (pro-B).
Sau đó chúng tiếp tục biệt hoá thành tiền tế bào lympho B (pre-B), các tế bào này có
đặc điểm là chưa có Immunoglobulin (Ig) bề mặt mà chỉ có IgM trong bào tương
CIgM (cytoplasma IgM). Các phân tử Ig bề mặt hoạt động như các thụ thể tiếp nhận
kháng nguyên, là những protein tham gia cấu tạo màng tế bào. Các tiề
n tế bào lympho
B được biệt hoá thành các tế bào lympho chưa chín, các tế bào này đã có IgM bề mặt.
Sau đó, chúng tiếp tục biệt hoá thành các tế bào lympho B chín với sự xuất hiện của
IgM, IgD bề mặt (và một số nhỏ IgA và IgG bề mặt). Tuy nhiên, các tế bào lympho B
chín chưa phải là các tế bào sản xuất kháng thể. Nếu các tế bào lympho B chín không
gặp đuợc kháng nguyên thì chúng sẽ bị phân huỷ. Nếu tế bào lympho B chín gặp được
kháng nguyên cộng thêm sự h
ợp tác hỗ trợ của các tế bào lympho T
H
, chúng sẽ tiếp tục
biệt hoá thành các tế bào plasma (plasma cell) và tế bào ghi nhớ (memory cell).

11





Khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể Ig bề mặt của tế bào lympho B, chúng sẽ
hoạt hoá phospholipase C ở màng tế bào thuỷ phân phosphotidyl inositol biphosphate
thành diacylglycerol (DAG) và inositol triphosphate (IP
3
). DAG và IP
3
có tác dụng
hoạt hoá protein kinase C và gia tăng hàm lượng Ca
2+
ngoại bào. Protein kinase C
được hoạt hoá sẽ thúc đẩy quá trình sao chép các gen mã hoá cho các kháng nguyên
phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens –
MHC class II antigens) và thụ thể transferrin CD71.
Hình 2.3: Quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào lympho B
(Nguồn: Ian R. Tizard, Immunology, Saunders College Publishing, 1988)