Đồ án tốt nghiệp: Thu nhận Sophorolipid tổng hợp từ chủng Candida bombicola với nguồn đường glucose và dầu hạt cải

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

THU NHẬN SOPHOROLIPIDS
TỔNG HỢP TỪ CHỦNG Candida bombicola
VỚI NGUỒN ĐƯỜNG GLUCOSE VÀ DẦU HẠT CẢI

Ngành

: Công nghệ sinh học

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoàng Dũng
ThS. Lê Quỳnh Loan
Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Yến Nhi

MSSV: 1311100539 - Lớp: 13DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài:

Nguyễn Thị Yến Nhi

Sinh viên trường:

Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh

Khoa:

Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Lớp:

13DSH02

MSSV:

1311100539

Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của bản thân tơi dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Hồng Dũng và ThS. Lê Quỳnh Loan, thực hiện tại Viện Sinh
học Nhiệt đới. Những số liệu và kết quả phân tính trong đề tài này hồn tồn trung
thực, khơng sao chép từ bất kỳ nguồn tài liệu tham khảo nào khác dưới bất kỳ hình
thức nào. Một số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu

trích dẫn được cơng bố cơng khai trên các website, tác phẩm theo danh mục tài liệu
tham khảo của đồ án.
Nếu có bất cứ sự sao chép và khơng trung thực trong bài báo này, người thực
hiện đề tài xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Cơng nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường và trươc ban giám hiệu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ
Chí Minh.
Ngày … tháng … năm 2017
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Yến Nhi

i


Đồ án tốt nghiệp
LỜI CÁM ƠN
Trong thời gian vừa qua, được sự giới thiệu của trường Đại Học Công Nghệ
TP. HCM, em đã có dịp thực tập và tìm hiểu về Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Tại trung
tâm, em được ôn lại, kiểm chứng những kiến thức đã được tích lũy trên ghế nhà
trường vào trong thực tiễn và học được nhiều bài học kinh nghiệm thực tế hơn, được
tiếp xúc, tìm hiểu các lồi vi sinh vật và các trang thiết bị trong phịng vi sinh.
Để hồn thành đợt thực tập này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và
giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cơ, các anh chị và các bạn.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hoàng Dũng
và Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan đã mở lòng nhận em vào thực tập tại trung tâm. Trong
suốt thời gian thực tập, thầy và chị cũng đã hết lòng hướng dẫn em, để em có thể đạt
được kết quả nghiên cứu tốt nhất, cũng như am hiểu toàn bộ về các phương pháp
nghiên cứu.
Bên cạnh đó em xin cám ơn Tiến sĩ Hồng Quốc Khánh và thầy Ngơ Đức Duy.
Dù không trực tiếp hướng dẫn nghiên cứu, nhưng vẫn cho em những lời khuyên vô

cùng quý báu, sâu sắc và những nụ cười rạng rỡ mỗi ngày.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến đến quý Thầy/Cô Khoa Công
nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Cơng Nghệ TP. Hồ Chí
Minh đẫ tận tình truyền đạt những kiến thức hết sức bổ ích cho em khi còn ngồi trên
giảng đường trường đại học.
Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô đang giảng
dạy, nghiên cứu tại Viện Sinh học Nhiệt Đới cũng như tại Đại học thành phố Hồ Chí
Minh, thật dồi dào sức khỏe, để tiếp tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền
đạt kiến thức cho thế hệ mai sau.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Yến Nhi
ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................ ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .............................................................................. vii
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN ........................................................................................4
1.1.

CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant) ...............................................4

1.1.1.

Định nghĩa...............................................................................................4

1.1.2.

Cấu trúc phân tử ......................................................................................4

1.1.3.

Đặc điểm .................................................................................................5

1.1.4.

Phân loại .................................................................................................6

1.1.5.

Ứng dụng ................................................................................................7

1.2.

SOPHOROLIPIDS ........................................................................................8

1.2.1.

Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants) .................8

1.2.2.

Sophorolipid..........................................................................................10

1.2.3.

Cấu trúc .................................................................................................11

1.2.4.

Đặc tính .................................................................................................13

1.2.5.

Hạn chế .................................................................................................15

1.3.

Candida bombicola ATCC 22214 ...............................................................15

1.4.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU.......................................................................18

1.4.1.

Ngồi nước ............................................................................................18

1.4.2.

Trong nước ............................................................................................19

CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................20

2.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...............................................................20

2.2.

Vật liệu nghiên cứu......................................................................................20

2.2.1.

Chủng vi sinh ........................................................................................20

2.2.2.

Dụng cụ và thiết bị ................................................................................20

2.2.3.

Hóa chất ................................................................................................21

2.3.

Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22
iii


Đồ án tốt nghiệp
2.3.1.

Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................22

2.3.2.

Tăng sinh và bảo quản chủng Candida bombicola ATCC 22214 ........23

2.3.3. Xây dựng đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC
22214 23
2.3.4.

Lên men ................................................................................................23

2.3.5.

Thu nhận sophorolipids thô ..................................................................24

2.3.6.

Chạy sắc ký bảng mỏng (TLC) .............................................................25

2.3.7.
thạch

Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa
26

2.3.8.

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục (MIC)
27

2.3.9.

Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH.................28

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................31
3.1.

Đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola .................................31

3.2.

Lên men sophorolipids từ C. bombicola .....................................................32

3.3.

Thu nhận sophorolipids từ C. bombicola ....................................................32

3.4.

Sắc ký bảng mỏng (TLC) ............................................................................34

3.5.

Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch .35

3.6.

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu bằng phương pháp đo độ đục ...............37

3.7.

Xác định hoạt tính bắt gốc tự do bằng phương pháp DPPH .......................38

CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................40
4.1.

Kết luận........................................................................................................40

4.2.

Kiến nghị .....................................................................................................40

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................42
PHỤ LỤC A: SỐ LIỆU KHẢO SÁT CÁC HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPID ..1
1. Số liệu khảo sát đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC
22214 .......................................................................................................................1
2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch
tán giếng thạch (mm) ...............................................................................................2
3. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs (OD517) ............................2
4. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp MIC
(OD600) .....................................................................................................................3
iv


Đồ án tốt nghiệp
PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM ...............................................4
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CHDBM

Chất hoạt động bề mặt

CHDBMSH

Chất hoạt động bề mặt sinh học

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

IC50

Inhibitory concentration 50%

LB

Luria Bertani

LM

Mơi trường lên men chính

MIC

Minimum inhibitory concentration

OD

Optical density

SLs

Sophorolipids

TLC

Thin-layer chromatography

YM

Mơi trường tăng sinh/giữ giống

v


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs
cs, 1997) ......................................................................................................................9
Bảng 1.2. Hoạt tính nhũ hóa của SLs đối với một số loại dầu (Daverey và
Pakshirajan, 2009) .....................................................................................................14
Bảng 1.3. Phân loài nấm Candida bombicola (Kurtzman và Fell, 2001) ................15
Bảng 1.4. Khả năng sinh hóa nguồn carbon của C.bombicola (Spencer vs cs, 1970).
...................................................................................................................................17
Bảng 3.1. Đường kính vịng kháng khuẩn của hợp chất SLs ...................................36
Bảng 3.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs lên một số chủng vi khuẩn .................38

vi


Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phịng ..........4
Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước ..................................................................5
Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt .......................................5
Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử ....................................6
Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự,
2012)..........................................................................................................................10
Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải) ............................................11
Hình 1.7. Quy trình sinh tổng hợp nên SLs trong tế bào (Van Bogaert và cộng sự,
2007)..........................................................................................................................12
Hình 1.8. Tế bào C.bombicola..................................................................................16
Hình 1.9. Khuẩn lạc nấm C.bombicola 2 ngày tuổi trên mơi trường YM. ..............16
Hình 2.1. Quy trình thu nhận SLs thơ từ q trình lên men chủng C. bombicola ...25
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu của SLs trên đĩa 96
giếng. .........................................................................................................................28
Hình 2.3. Cơ chế chuyển màu của DPPH khi nhận một phân tử hydro từ chất
chống oxy hóa. ..........................................................................................................29
Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs trên đĩa 96
giếng. .........................................................................................................................30
Hình 3.1. Biểu đồ đường cong tăng trưởng của nấm men C. bombicola ATCC
22214. ........................................................................................................................31
Hình 3.2. Mơi trường lên men chính trước (trái) và sau (phải) sau 7 ngày..............32
Hình 3.3. Dịch lên men sau 7 ngày vẫn còn một lượng dầu. ...................................32
Hình 3.4. Màng liên pha giữa Hexane và dịch lên men xuất hiện bọt. ....................33
Hình 3.5. Sophorolipids thơ thu nhận được..............................................................34
Hình 3.6. Kết quả chạy sắc ký TLC .........................................................................35

Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương
pháp khuếch tán giếng thạch. ....................................................................................37
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện khả năng kháng oxy hóa của hỗn hợp SLs thô. ............39
vii


Đồ án tốt nghiệp
Hình 1. Dịch lên men trước (trái) và sau (phải) khi chiết với hexane ........................4
Hình 2. Quá trình chiết dịch lên men với ethyl acetate ..............................................4
Hình 3. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Bacillus subtilis của SLs ...................5
Hình 4. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Escherichia coli của SLs ...................5
Hình 5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Pseudonomas aeruginosa của SLs.....6
Hình 6. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Salmonella typhimurium của SLs. ....6
Hình 7. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Staphylococus aureus của SLs. .........7
Hình 8. Thí nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu ..............................................7
Hình 9. Thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa ..............................................8

viii


Đồ án tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Mỗi năm trên toàn thế giới người ta sản xuất ra khoảng 10 triệu tấn chất hoạt
động bề mặt (CHDBM), mức tiêu thụ được chia đều cho ứng dụng trong các hợp chất
tẩy rửa và ứng dụng trong công nghiệp (Van Bogaert và cộng sự, 2007). CHDBM
được biết đến bởi phạm trù ứng dụng rộng rãi như: chất tẩy rửa, thực/dược/mỹ phẩm,
chế phẩm nơng nghiệp. Nhưng vì chủ yếu CHDBM được tổng hợp theo con đường
hóa học và nguồn gốc là từ dầu mỏ, khó phân hủy và có khả năng gây độc cho mơi
trường. Vì thế trọng tâm nghiên cứu CHDBM trong thời gian gần đây là tìm ra

CHDBM có nguồn gốc từ sinh học, chủ yếu là do vi sinh vật tổng hợp. Ưu điểm của
chất hoạt động bề mặt sinh học (CHDBMSH) là độc tính thấp, khả năng phân hủy
sinh học cao và khả năng ứng dụng rộng hơn. CHDBMSH chủ yếu là glycolipid,
phospholipids, hợp chất polyme và lipopeptides.
Sophorolipid (SLs) là một trong những CHDBMSH, được cấu thành từ đường
sophorose liên kết với một chuỗi acid béo, chiều dài chuỗi phụ thuộc vào nguồn
carbon được sử dụng. SLs là một trong những CHDBMSH có thể tổng hợp từ các
nguồn nguyên liệu tái sử dụng. Không chỉ dừng lại ở đó, SLs cịn có khả năng ức chế
một số loại nấm men (Van Bogaert và cộng sự, 2007), nấm bệnh thực vật (Yoo và
cộng sự, 2005) và vi khuẩn (Mager và cộng sự, 1987; Lang và cộng sự, 1989). Ngồi
ra SLs cịn có khả năng chống bám, ức chế sự hình thành của màng sinh học (Zezzi
do và cộng sự, 2012).
Năm 2016, tại Việt Nam cơng trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hoàn
thành - Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ quá trình lên men chủng
Candida bombicola từ dầu dừa (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Tuy vậy, nhưng kết
quả khảo sát hoạt tính SLs của nghiên cứu này thu được chỉ từ một nguồn dầu dừa.
Do đó nghiên cứu này sẽ tiếp tục mở rộng sang nguồn nguyên liệu lên men khác, sử
dụng nguồn dầu hạt cải – chứa 61% acid oleic và đường glucose – đơn tử cấu thành
sophorose, kế đó khảo sát một số hoạt tính sinh học của sophorolipid thu được.

1


Đồ án tốt nghiệp
2. Tình hình nghiên cứu
Van Bogaert và cộng sự đã công khai bài báo cáo khoa học nghiên cứu tồn
diện về mọi khía cạnh trong quy trình sản xuất thu nhận SLs (tăng sinh nấm men,
con đường tổng hợp sinh học, ảnh hưởng của thành phần môi trường, điều kiện lên
men). Chủ yếu nhóm nghiên cứu tập trung vào mục tiêu tối ưu hóa điều kiện lên
men cho vi sinh vật để tổng hợp nên SLs trong quá trình lên men chìm.

Đáng chú ý nhất là năm 2005, Vishal Shah và cộng sự đã đưa ra những kết quả
đầu tiên chứng tỏ khả năng ức chế virus HIV của SLs. Tại nồng độ 3mg/ml tất cả các
dẫn xuất SLs đều có hoạt tính kháng virus HIV, khử hoạt tính của virus trong vịng
chưa đầy 2 phút. Riêng dẫn xuất diacetate ethyl ester SLs là dẫn xuất hoạt động mạnh
nhất. Ngoài ra năm 2012, Shao và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư
thực quản của SLs trên người. Kết quả chứng minh rằng có sự ức chế của SLs lactonic
lên tế bào thực quản (ở nồng độ 30 µg/ml). Sự khác biệt về độ bão hịa acid béo trong
phân tử SLs có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng gây độc cho tế bào ung thư.
Năm 2016, tại Việt Nam cơng trình nghiên cứu về SLs đầu tiên được hoàn thành
“Thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của SLs từ q trình lên men chủng Candida
bombicola từ dầu dừa” (L.Q. Loan và cộng sự, 2016). Hứa hẹn cho công cuộc sản
xuất một hợp chất CHDBMSH mới, có ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống và cơng
nghiệp.
3. Mục đích nghiên cứu
Khảo sát hoạt tính của Sophorolipids thu nhận qua q trình lên men chủng
Candida bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Lên men chủng nấm Candida bombicola ATCC 22214

-

Thu nhận SLs từ dịch lên men

-

Định tính SLs.

-

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu nhận được

-

Khảo sát khả năng chống oxy của SLs thu nhận được.

5. Phương pháp nghiên cứu
2


Đồ án tốt nghiệp
Thu nhận SLs thông qua nuôi cấy chủng C. bombicola ATCC 22214 ở điều
kiện 25oC, tốc độ lắc 180 vịng/phút.
Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography
– TLC)
Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên
đĩa thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
Xác định khả năng chống oxy hóa của SLs thông qua khả năng bắt gốc tự do
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH).
6. Kết quả đạt được
Sản lượng SLs thô thu được từ dịch nuôi cấy nấm C. bombicola ATCC 22214
từ nguồn dầu hạt cải và đường glucose là 20.76 g/l.
Trong hỗn hợp SLs thơ thu được có sự hiện diện của 1,4” – Sophorolactone 6’,6”
– diacetate. Ngoài ra trong hỗn hợp thu được cịn có các SLs cấu trúc khác và một số
chất khác.
Khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus là đáng chú ý, cao gấp 3 lần các
chủng vi khuẩn khảo sát còn lại. Khả năng kháng của SLs đối với các chủng
Escherichia

coli,

Bacillus

subtilis,

Pseudonomas

aeruginosa,

Salmonella

typhimurium khơng có sự khác biệt đáng kể.
Nồng độ ức chế tối thiểu của SLs đối với 3 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Staphylococus aureus là cao nhất (12.5 mg/ml). Nồng độ ức chế tối
thiểu của SLs đối với chủng Salmonella typhimurium là khá thấp so với các chủng
khác (0.7812 mg/ml).
Khả năng kháng oxy hóa đạt 77.64% ở nồng độ 20 mg/ml. Nồng độ bắt gốc tự
do của sophorolipids thu nhận là 4.51 mg/ml.
7. Kết cấu của đồ án
-

Chương 1: Tổng quan

-

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

-

Chương 3: Kết quả và thảo luận

-

Chương 4: Kết luận và kiến nghị
3


Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (Surfactant)

1.1.1. Định nghĩa
Chất có hoạt tính bề mặt là những hợp chất làm giảm sức căng bề mặt liên pha
giữa hai chất lỏng hoặc giữa chất rắn và chất lỏng. Từ “Surfactant” được viết tắt từ
cụm từ surface active agent, tức là tác nhân hoạt động bề mặt. Chúng được ứng dụng
làm chất tẩy rửa, chất thấm ướt, chất nhũ hóa, chất tạo bọt, chất phân tán.
Chất hoạt động bề mặt (CHDBM) là một thành phần không thể thiếu trong
cuộc sống chúng ta, và ứng dụng của chúng hứa hẹn còn vươn xa hơn so với nhu cầu
của nhân loại. Do đó, sản lượng CHDBM thu được mỗi năm vượt qua con số 18 triệu
tấn trên toàn thế giới, trong đó có 3 triệu tấn được sản xuất ở Tây Âu. Một nửa sản
lượng này là thành phần trong chất tẩy rửa, phần cịn lại ứng dụng trong cơng nghệ
thực phẩm, mỹ phẩm, hóa chất, sản xuất giấy, nơng nghiệp,…
CHDBM được sản xuất từ 2 nguồn nguyên liệu chính: dầu mỏ hoặc chất thải
có nguồn gốc sinh học. Việc tái sử dụng nguồn chất thải sinh học để sản xuất ra một
nguyên liệu mới đã cải thiện đáng kể hiện tượng nhà kính, tuy vậy hoạt động sản
CHDBM từ nguồn chất thải sinh học chỉ mới chiếm 25% trong tổng hoạt động sản
xuất CHDBM.

1.1.2. Cấu trúc phân tử
Chất hoạt động bề mặt thường là các hợp chất hữu cơ có đồng thời một phần
ưa nước (tan trong nước) và một phần kỵ nước (tan trong dầu). Khi hòa vào một hệ
nhũ tương, surfactant sẽ tập trung ở các màng liên pha khơng khí – nước, dầu – nước,
gắn kết hai pha lại với nhau, làm cho hệ trở nên ổn định hơn.
Lượng chất hoạt động bề mặt sản xuất ra trên tồn thế giới ước tính khoảng 15
triệu tấn/năm, chiếm gần một nữa lượng xà phịng.

Hình 1.1. Natri stearate (C17H35COONa) – thành phần chính trong xà phịng

4


Đồ án tốt nghiệp

1.1.3. Đặc điểm
Chất hoạt động bề mặt được dùng giảm sức căng bề mặt của một chất lỏng
bằng cách làm giảm sức căng bề mặt tại màng liên pha (interface) của hai chất lỏng.
Nếu có nhiều hơn hai chất lỏng khơng hịa tan thì chất hoạt hóa bề mặt làm tăng diện
tích tiếp xúc giữa hai chất lỏng đó.

Hình 1.2. Màng liên pha giữ dầu và nước
Khi hịa chất hoạt hóa bề mặt vào trong một chất lỏng thì các phân tử của chất
hoạt hóa bề mặt có xu hướng tạo đám (micelle), nồng độ mà tại đó các phân tử bắt
đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn. Nếu chất lỏng là nước thì các phân
tử sẽ chụm đi kị nước lại với nhau và quay đầu ưa nước ra tạo nên những hình dạng
khác nhau như hình cầu (0 chiều), hình que (1 chiều), màng (2 chiều).

Hình 1.3. Các dạng phân bố của phân tử hoạt động bề mặt

Tính ưa, kị nước của một chất hoạt hóa bề mặt được đặc trưng bởi một thông
số là độ cân bằng ưa kị nước (tiếng Anh: Hydrophilic Lipophilic Balance-HLB), giá
trị này có thể từ 0 đến 40. HLB càng cao thì hóa chất càng dễ hịa tan trong nước,
HLB càng thấp thì hóa chất càng dễ hịa tan trong các dung mơi khơng phân cực như
dầu.

5


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4. Sự khác nhau về hoạt độ nước và cấu trúc phân tử

1.1.4. Phân loại
Tùy theo tính chất mà chất hoạt hóa bề mặt được phân theo các loại khác nhau.
Nếu xem theo tính chất điện của đầu phân cực của phân tử chất hoạt hóa bề mặt thì
có thể phân chúng thành các loại sau:
1.1.4.1. Chất hoạt hóa ion
Chất hoạt hóa dương: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện dương, ví dụ:
Cetyl trimêtylamôni brômua (CTAB).
-

Cetyl trimetylammonium bromua (CTAB)

-

Cetyl pyridinium clorua (CPC)

-

Polyethoxylated tallow amin (POEA)

-

Benzalkonium clorua (BAC)

-

Benzethonium clorua (BZT)

Chất hoạt hóa âm: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện âm
-

Natri dodecyl sulfat (SDS), amoni lauryl sulfat, và các muối ankyl sulfat khác

-

Natri laureth sulfat, hay natri lauryl ete sulfat (SLSES)

-

Ankyl benzen sulfonat

-

Xà phòng và các muối của axit béo
1.1.4.2. Chất hoạt hóa phi ion

-

Ankyl poly (etylen oxit)
6


Đồ án tốt nghiệp
-

Copolymers của poly (etylen oxit) và poly (propylen oxit)

-

Ankyl polyglucozit, bao gồm:

-

Octyl glucozit

-

Decyl maltosit

-

Các rượu béo

-

Rượu cetyl

-

Rượu oleyl

-

Cocamit MEA, cocamit DEA
1.1.4.3. Chất hoạt hóa lưỡng cực
Khi bị phân cực thì đầu phân cực có thể mang điện âm hoặc mang điện dương

tùy vào pH của dung môi, ví dụ: Dodecyl đimêtylamin ơxít.
-

Dodecyl betain

-

Dodecyl dimetylamin ơxít

-

Cocamidopropyl betain

-

Coco ampho glycinat

1.1.5. Ứng dụng
Chất hoạt hóa bề mặt ứng dụng rất nhiều trong đời sống hàng ngày. Ứng dụng
phổ biến nhất là bột giặt, sơn, nhuộm... Ngoài ra những ứng dụng trong các lĩnh vực
khác như:

-

Trong công nghiệp dệt nhuộm: Chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm

-

Trong công nghiệp thực phẩm: Chất nhũ hóa cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp

-

Trong công nghiệp mỹ phẩm: Chất tẩy rửa, nhũ hóa, chất tạo bọt

-

Trong ngành in: Chất trợ ngấm và phân tán mực in

-

Trong nông nghiệp: Chất để gia công thuốc bảo vệ thực vật,

-

Trong xây dựng: Dùng để nhũ hóa nhựa đường, tăng cường độ đóng rắn của bê
tơng

-

Trong dầu khí: Chất nhũ hóa dung dịch khoan

-

Trong cơng nghiệp khống sản: Làm thuốc tuyển nổi, chất nhũ hóa, chất tạo bọt
để làm giàu khoáng sản
7


Đồ án tốt nghiệp
1.2.

SOPHOROLIPIDS

1.2.1. Định nghĩa chât hoạt động bề mặt sinh học (Biosurfactants)
Biosurfactants là các hợp chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học
(CHDBMSH), được sản xuất bới vi sinh vật. Trong những năm gần đây các nhà khoa
học đang chú trọng đến lĩnh vực này, bởi chúng có độc tính thấp và phương thức sản
xuất đơn giản. Bởi thế ứng dụng của CHDBMSH rất rộng: hóa chất hữu cơ, phân bón,
thức ăn, đồ uống, mỹ phẩm, dược phẩm và bao gồm cả các ứng dụng của chất hoạt
động bề mặt hóa học.
Tuy rằng CHDBMSH có mặt khá rộng rãi trong tự nhiên, nhưng chi phí cho các
quy trình tách chiết ở quy mơ cơng nghiệp, quy trình tinh sạch đã tạo ra một rào cản
khá lớn đối với các nhà sản xuất. Chi phí thu hồi, tinh sạch CHDBMSH luôn lớn hơn
rất nhiều lần so với chi phí tổng hợp nên chúng.
Trong nhóm các CHDBMSH ngồi Sophorolipid ra thì cịn có: Rhamnolipids
được tổng hợp từ một số chủng trong chi Pseudomonas, và Lecithin được thu hồi từ
đậu nành và lòng đỏ chứng.
CHDBMSH phổ biến là các chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc từ vi sinh vật.
Vì thời gian thế hệ và tốc độ phát triển của vi sinh vật cao hơn gấp nhiều lần so với
các loài động/thực vật, nên dễ dàng đưa vào sản xuất quy mô công nghiệp.

8

Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.1. Một số vi khuẩn tổng hợp nên các loại CHDBMSH quan trọng (Desai vs
cs, 1997)
Chất hoạt động bề mặt sinh học

Vi khuẩn tổng hợp

Glycolipids
Rhamnolipids

Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas sp.

Trehalolipids

Rhodococus Erythropolis, Nocardia
erythropolis Mycobacterium sp.

Sophorolipids

Candida. bombicola, Camdida. apicola,
and Rhodotorula bogoriensis

Mannosylerythritol lipids

Pseudozyma antarctica

Cellobiolipids

Ustilago zeae, U. maydis

Lipopeptides và lipoproteins
Peptide-lipid

Bacillus licheniformis

Serrawettin

Serratia marcescens

Viscosin

Ps. fluorescens

Surfactin

Bacillus. subtilis

Gramicidins

Bacillus. brevis

Polymyxins

Bacillus. polymyxa

Acid béo, lipid trung tính và phospholipids
Fatty acids

C. lepus

Neutral lipids

R. erythropolis

Phospholipids

Thiobacillus thiooxidans

Polymer
Emulsan

Acinetobacter calcoaceticus

Biodispersan

Acinetobacter. calcoaceticus

Mannan-lipid-protein

Candida. tropicalis

Carbohydrate-proteinlipid

Pseudomonas.fluorescens,
Debaryomyces polymorphis

Protein PA

Pseudomonas. aeruginosa

9


Đồ án tốt nghiệp

1.2.2. Sophorolipid
Sophorolipid (SLs) là một hợp
chất glycolipid hoạt động bề mặt,
được tổng hợp bởi một số loài nấm
men vô hại. Nghiên cứu đầu tiên về
sophorolipid được công bố vào năm
1961 – một glycolipid ngoại bào
được tổng hợp bởi nấm men
Torulopsis magnolia.
Sau đó vào năm 1968, Tulloch
và Spencer đã cơng bố rằng chủng
sinh SLs thực tế là Torulopsis
Hình 1.5. Sophorolipids tổng hợp bởi
Starmerella bombicola (Parekh và cộng sự,
apicola. Tới năm 1970, Spencer
2012)
tiếp tục phát hiện ra rằng chủng nấm men Candida bombicola cũng có thể sản xuất
apicola, hiện nay gọi là Candida

ra SLs. Trong đó chủng Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và nghiên cứu
nhiều nhất do cho năng suất cao (400g/l) và đặc biệt chủng này khơng gây bệnh.
Năm 2006, Chen và đồng nghiệp đã tìm ra được một chủng Wickerhamiella

domericqiae mới có khả năng tổng hợp SLs. Chủng này tổng hợp ra hơn 6 glycolipids
khác nhau. Một trong số đó có 17-L-(-oxy)-octadecanoic acid 1,4”-lactone 6’,6”diacetate, đây là thành phần chính có trong SLs tổng hợp từ 2 loài C. apicola và C.
bombicola.
Nhưng mãi đến đầu thế kỷ 20 người ta mới chú trọng đến việc nghiên cứu kỹ
lưỡng và tìm kiếm ứng dụng của sophorolipid, vì lúc này nhân loại mới nhận thức ra
tầm quan trọng của việc bảo vệ môi trường. Ngày nay sophorolipid được xem là chất
hoạt động bề mặt sinh học (bio-surfactants) có triển vọng cao.

10


Đồ án tốt nghiệp

1.2.3. Cấu trúc
Sophorolipid thuộc nhóm glycolipid biosurfactans, kết hợp từ 1 đuôi acid kị
nước (16 hoặc 18 phân tử carbon) và đầu carbohydrate ưa nước (sophorose – đường
đơi glucose) thơng qua liên kết β-glucosidic ở vị trí C1’.
Phân tử carbon cuối cùng trong chuỗi đuôi của SLs vừa có thể este hóa với nhóm
hydroxyl ở vị trí C 4” của sophorose tạo SLs dạng lactonic (dạng vòng); vừa có thể ở
dạng tự do tạo SLs dạng acidic (dạng mở).

Hình 1.6. Hai dạng SLs: lactonic (trái) – acidic (phải)
Đi acid thường có 16 hoặc 18 phân tử carbon và có nhiều hơn một liên kết
đơi. Tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của SLs thu được phụ thuộc vào tỷ lệ thành
phần giữa 2 dạng lactonic và acidic trong canh trường, vì cả 2 dạng này đều được vi
sinh vật tổng hợp song song trong quá trình lên men sản xuất.
Cơ chất thích hợp cho q trình sinh tổng hợp SLs là glucose và acid béo. Ngoài
ra các dạng methyl, ethyl esters của acid béo hay triglycerides cũng có thể dùng làm
cơ chất (được esterases sẽ thủy phân dần thành acid béo). Do các chủng như
C.bombicola, C.apicola có thể tăng trưởng trong mơi trường alkan nên chúng có hệ

enzyme cần thiết cho q trình oxy hóa các alkan này để tạo nên acid béo.

11


Đồ án tốt nghiệp

1. cytochrome P450 monooxygenase
2. alcohol-dehydrogenase
3. aldehyde-dehydrogenase
4. lipase
5. cytochrome P450 monooxygenase
6. glucosyltransferase I
7. glucosyltransferase II
8. lactonesterase
9. acetyltransferase

Hình 1.7. Quy trình sinh tổng hợp nên SLs trong tế bào (Van Bogaert và cộng sự,
2007)
Đầu tiên, các acid béo được hydroxyl hóa ở vị trí cuối (ω) hay kế cuối (ω-1) bởi
cytochrome P450 monooxygenase. Ở các chủng C.bombicola, người ta tìm thấy có
tận 5 đoạn gen khác nhau thuộc nhóm CYP52 mã hóa tổng hợp nên cytochrome P450
monooxygenase. Kế đó, glucose thứ nhất gắn vào vị trí C1’ của nhóm hydroxyl bởi

12


Đồ án tốt nghiệp
glucosyltransferase I, glucose thứ 2 gắn vào vị trí C2’ của glucose thứ nhất bởi
glucosyltransferase II. Lúc này sản phẩm mới chỉ là SLs dạng acidic.

Quá trình tổng hợp cịn có thể tiếp tục diễn ra bởi sự có mặt của 2 enzyme
lactonesterase và acetyltransferase để tạo ra SLs dạng lactonic và các dạng acetyl của
SLs.
Nhìn chung thì SLs lactonic có chức năng làm giảm sức căng bề mặt và khả
năng kháng khuẩn cao, trong khi SLs acidic thì mang chức năng tạo bọt.
Ngồi ra cấu trúc của SLs cịn có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’
và 6”) trên sophorose và thành phần acid béo (chiều dài chuỗi carbon, mức độ bão
hịa, vị trí của nhóm hydroxyl). Chúng bị chi phối bởi chủng vi sinh, điều kiện sinh
trưởng và nguồn dầu.

1.2.4. Đặc tính
Hai đặc tính nổi trội nhất của SLs đó chính là khả năng phân hủy sinh học và
độc tính thấp, không như Rhamnolipids được tổng hợp từ chi Pseudomonads (bao
gồm chủng gây bệnh Pseudomonas aeruginosa).
1.2.4.1. Giảm sức căng bề mặt
Bên cạnh đó SLs mang hoạt tính bề mặt cao hơn so với nhiều chất hoạt động bề
mặt hóa học khác. Một chất hoạt động bề mặt tốt phải có khả năng giảm sức căng bề
mặt (surface tension - ST) của nước từ 72,8 mN/m xuống còn 30 – 35 mN/m; sức
căng bề mặt phân cách (interfacial tension - IT) giữa nước/hexadecane từ 40 xuống
còn 1 mN/m. Với nồng độ micelle tới hạn (CMC) cực ít (so sánh với chất hoạt động
bề mặt tổng hợp khác), SLs có thể giảm ST xuống còn 29 mN/m và IT xuống 5 mN/m.
Cụ thể là SLs sản xuất từ nấm men Candida bombicola (trong mơi trường chứa:
mật rỉ mía, cao nấm men, ure, dầu đậu nành) giảm ST của nước xuống còn 34,15 N/m
và tại CMC là 59.43 mg/l. Năm 2005, người ta cũng xác định được chỉ số ST và CMC
của SLs khi lên men trong các nguồn dầu khác nhau: dầu đậu nành đen (phụ phẩm
trong ngành chế biến dầu đậu nành) - 150 mg/l và 48 mN/m; dầu đậu nành – 88 mg/l
và 40,5 mN/m ; dầu bắp - 82 mg/l và 41 mN/m.

13

Đồ án tốt nghiệp
1.2.4.2. Khả năng nhũ hóa
Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì SLs cịn nắm giữ khả năng
nhũ hóa. Năm 2009, Daverey và Pakshirajan đã chứng minh được rằng SLs tổng hợp
bởi C. bombicola ATCC 22214 từ nguồn mật rỉ đường cho hoạt tính nhũ hóa tốt và
ổn định.
Bảng 1.2. Hoạt tính nhũ hóa của SLs đối với một số loại dầu (Daverey và Pakshirajan,
2009)
Hoạt tính nhũ hóa (OD600)

Pha dầu
Kerosene

1,584

Xylene

2,016

Benzene

26,784

Hexadecane

2,880

Năm 2012, trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự về hoạt tính sinh học và
hoạt tính bề mặt của phân tử SLs tổng hợp từ Wickerhamiella domericqiae, cho thấy

SLs có khả năng nhũ hóa mạnh đối với các cơ chất kị nước (cụ thể là paraffin lỏng,
dầu hạt cải), nhưng lại yếu hơn đối với dầu thô. Một điểm đáng chú ý là các hệ nhũ
tương ổn định được trong suốt một tuần lễ.
1.2.4.3. Khả năng kháng khuẩn
SLs có phổ hoạt động rộng dưới nhiều mức nhiệt độ, áp suất và cường độ ion
khác nhau. Ngồi ra SLs cịn có khả năng kháng, kháng ung thư, điều hòa hệ miễn
dịch (Van Bogaert và cộng sự, 2011), kháng virus (Shah và cộng sự, 2005).
Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của SLs như sau: nồng độ ức chế tối
thiểu đối với vi khuẩn Bacillus subtilis là 4 mg/l và đối với Propionibaterium acne là
0.5 mg/l (Kim và cộng sự, 2005). Kết quả này đã đưa SLs vào lĩnh vực ứng dụng sản
xuất sản phẩm chăm sóc sức khỏe, như là một tác nhân diệt khuẩn.
1.2.4.4. Khả năng kháng oxy hóa
SLs thơ và SLs dạng acidic cịn có khả năng bắt gốc tự do hydroxyl (OH).
Theo một nghiên cứu, SLs thô ở nồng độ 0,028% và 0,083% (w/v) sẽ có khả năng
14


Đồ án tốt nghiệp
bắt gốc tự tương ứng 97% và 100%. Kết quả tương tự ở SLs acidic sẽ là 98% và
100% (Hillion G, 1998).

1.2.5. Hạn chế
Khơng cịn nghi ngờ gì khi nói SLs là một chất hoạt động bề mặt sinh học có
nguồn gốc từ vi sinh vật đầy triển vọng. Tuy thế khuyết điểm là điều không thể tránh
khỏi.
SLs khơng thể hịa tan vào mơi trường lỏng ở pH thấp. Tính tan của SLs sẽ bắt
đầu tăng từ pH 5.0 và tan tốt khi pH trên 6.0. Nhưng không ổn định khi bảo quản ở
ngưỡng pH 7,0 – 7,5. Và nếu pH mơi trường cao hơn nữa thì nhóm acetyl và liên kết
este sẽ bị thủy phân hồn tồn khơng nghịch đảo. Một điểm nữa đó là dù cho nồng
độ cao nhưng khả năng tạo bọt của SLs vẫn kém.

Những khuyết điểm trên đã giảm đi phần nào ứng dụng của SLs (sản xuất xà
phòng) nhưng lại khiến cho SLs thích hợp hơn ở những lĩnh vực khác khơng cần đến
bọt (nước lau kính, lau kim loại; phụ gia thực phẩm).
Tuy rằng SLs có khả năng kháng khuẩn, kháng virus cũng như ung thư, nhưng
việc dung nạp SLs thơng qua đường tiêu hóa là điều khơng thể. Vì SLs dễ dàng bị
thủy phân trong bao tử cũng như trong đường ruột (Hirata và cộng sự, 2009).
1.3.

Candida bombicola ATCC 22214

Bảng 1.3. Phân loài nấm Candida bombicola (Kurtzman và Fell, 2001)
Nấm

Giới
Ngành

Ascomycota

Ngành phụ

Saccharomycotina

Lớp

Saccharomycetes

Bộ

Saccharomycetales

Họ

Incertae sedis

Chi

Candida

Loài

Candida bombicola
15


Đồ án tốt nghiệp

Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola,
được phân lập từ mật của loài ong nghệ (Spencer và cộng sự, 1970). Candida
bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida apicola,
Candida bororiensis, Wickerhamiella domericqiae và Rhodotorula bogoriensis được
biết đến với khả năng tổng hợp nên Sophorolipids.
Tế bào nấm men Candida bombicola có
dạng hình oval đến hình thon dài, thường phân
bố riêng lẻ hoặc thành cặp. Kích thước tế bào
khoảng 1.5–2.5x3-5 µm (Kurtzman và Fell,
2001).
Sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch
bột bắp ở 25oC, tế bào nấm men C. bombicola
Hình 1.8. Tế bào C. bombicola
dưới kính hiển vi.

khơng xuất hiện ty giả, tế bào bao gồm rất
nhiều các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc.

Phát triển trong điều kiện hiếu khí, khuẩn lạc sẽ có màu trắng sữa đến màu xám tro.
Khuẩn lạc trơn, bóng, lồi và rìa răng cưa (Kurtzman và Fell, 2001).

Hình 1.9. Khuẩn lạc nấm C. bombicola 2 ngày tuổi trên môi trường YM.
16