Đồ án tốt nghiệp: Bước đầu ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng
dẫn khoa học của ThS. Huỳnh Văn Thành – Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm –
Môi trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ Tp.Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án này hồn tồn khơng sao chép từ đồ án tốt
nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt
nghiệp này là hồn tồn trung thực. Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn về đồ án tốt
nghiệp của mình.
TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Võ Phương Huỳnh


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy
ThS. Huỳnh Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đồ án tốt nghiệp.
Đồng thời, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức trong thời gian dài học tập.
Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp em thực hiện tốt đồ án tốt
nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, Ba Mẹ đã ln động viên, chăm sóc và là
chỗ dựa vững chắc cho em trong suốt những năm qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Lê Trần Ánh Tuyết, cùng các
bạn lớp 10DSH, những người ln động viên và giúp đỡ hết mình để em hoàn thành tốt
đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời
gian đọc và nhận xét đồ án này.
TP.HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Võ Phương Huỳnh


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu............................................................................................... 2
4. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 3
5. Các kết quả đạt được của đề tài................................................................................ 4
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ...................................................................................... 4
1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans........................................ 4
1.1.1. Giới thiệu chung ................................................................................................ 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm sinh lý ................................................................................................ 5
1.1.4. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................................. 5
1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn A. xylosoxidans .......................................................... 6
1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S ............................................... 9
1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn A. xylosoxidans ................................................11
1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy ...................................................................11
1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green .........................................................11
1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans ........................................12
1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate .........................................................................12
1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho q trình phản nitrate của vi khuẩn A.

xylosoxidans ...............................................................................................................15
1.2. Tổng quan về nƣớc thải chế biến thủy sản .......................................................17
1.2.1. Nước thải chế biến thủy sản ..............................................................................17

i


Đồ án tốt nghiệp
1.2.2. Hiện trạng xử lý nước thải chế biến thủy sản ....................................................19
1.3. Phƣơng pháp xử lý sinh học ..............................................................................21
1.4. Tổng quan về mơ hình xử lý nƣớc thải MBBR.................................................22
1.4.1. Nguyên tắc hoạt động .......................................................................................22
1.4.2. Hoạt động của giá thể .......................................................................................23
1.4.3. Ưu điểm của quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp MBBR ....................24
CHƢƠNG II:VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .........................................................25
2.1. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất .............................................................................25
2.1.1. Vật liệu .............................................................................................................25
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ ...............................................................................................25
2.1.2.1. Thiết bị ..........................................................................................................25
2.1.2.2. Dụng cụ .........................................................................................................25
2.1.3. Hóa chất ...........................................................................................................26
2.1.3.1. Thành phần môi trường giữ giống, nhân giống, khảo sát ................................26
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng ...........................................................................................27
2.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................27
2.3. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................29
2.3.1. Nhân giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ..................................29
2.3.2. Giữ giống chủng vi khuẩn phản nitrate A. xylosoxidans ....................................29
2.3.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ KIT API 20 NE ...................29
2.3.4. Khảo sát sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nước
thải và môi trường Giltay cải tiến ...............................................................................29

2.3.5. Khảo sát mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nước thải giàu
nitrate .........................................................................................................................30
2.3.6. Khảo sát thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước thải
giàu nitrate .................................................................................................................31
2.3.7. Tiến hành thực hiện mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm ...................32

ii


Đồ án tốt nghiệp
2.4. Phƣơng pháp phân tích .....................................................................................34
2.4.1. Phương pháp dựng đường chuẩn .......................................................................34
2.4.1.1. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrate .........................................................34
2.4.1.2. Phương pháp dựng đường chuẩn nitrite..........................................................36
2.4.1.3. Phương pháp dựng đường chuẩn amoni .........................................................37
2.4.2. Phương pháp định lượng N-NO3-, N-NO2-, N-NH4+ ..........................................38
2.4.2.1. Phương pháp định lượng N-NO3- ...................................................................38
2.4.2.2. Phương pháp định lượng N-NO2- ...................................................................39
2.4.2.3. Phương pháp định lượng N-NH4+...................................................................39
2.4.3. Phương pháp khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ
KIT API 20 NE ..........................................................................................................40
2.4.3.1. Chuẩn bị ........................................................................................................40
2.4.3.2. Phương pháp ..................................................................................................41
2.4.3.3. Cách đọc kết quả............................................................................................43
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................46
3.1. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans bằng bộ KIT API 20
NE..............................................................................................................................46
3.2. Kết quả dựng đƣờng chuẩn ...............................................................................49
3.2.1. Kết quả dựng đường chuẩn nitrate ....................................................................49
3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn nitrite .....................................................................50

3.2.3. Kết quả dựng đường chuẩn amoni.....................................................................52
3.3. Sự thích ứng của vi khuẩn A. xylosoxidans với tỷ lệ phối trộn giữa nƣớc thải
và môi trƣờng Giltay cải tiến ...................................................................................53
3.4. Mật độ vi khuẩn A. xylosoxidans thích hợp bổ sung vào nƣớc thải giàu nitrate
...................................................................................................................................56
3.5. Thời gian xử lý nitrate của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nƣớc thải giàu
nitrate ......................................................................................................................58

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.6. Khảo sát mơ hình bioreactor quy mơ phịng thí nghiệm .................................62
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................65
4.1. Kết luận ..............................................................................................................65
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................67
PHỤ LỤC

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
A. xylosoxidans

Achromobacter xylosoxidans

C

Cacbon

C/N

Tỷ lệ cacbon trên nitơ

COD

Nhu cầu oxy hóa học

MBBR

Mơ hình xử lý nước thải giá thể lơ lửng

N

Nitơ

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans ......................................... 6
Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hịa và khử nitrate dị hóa trong chu trình nitơ của vi khuẩn
...................................................................................................................................13
Bảng 1.3. Thành phần nước thải chế biến thủy sản .....................................................19

Bảng 2.1. Các thông số mơ hình MBBR xây dựng từ thí nghiệm ................................32
Bảng 2.2. Trình tự tiến hành dựng đưởng chuẩn nitrate ..............................................35
Bảng 2.3. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn nitrite ...............................................37
Bảng 2.4. Trình tự tiến hành dựng đường chuẩn amoni ..............................................38
Bảng 2.5. Các mức Mc Farland ..................................................................................40
Bảng 3.1. Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của vi khuẩn A.xylosoxidans ...................48
Bảng 3.2. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrate ............................................49
Bảng 3.3. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn nitrite ............................................51
Bảng 3.4. Độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn amoni ............................................52

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn A. xylosoxidans ......................................... 5
Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn A. xylosoxidans ..................................... 8
Hình 1.3. Kết quả giải trình tự gene 16S .....................................................................10
Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank ........................................10
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của malachite green .......................................................11
Hình 1.6. Sơ đồ cơng nghệ xử lý nước thải chế biến thủy sản áp dụng công nghệ sinh
học hiếu khí với bùn hoạt tính lơ lửng ........................................................................20
Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm ..............................................................28
Hình 2.2. Mơ hình bioreactor có giá thể bám dính ......................................................34
Hình 2.3. Các mức Mc Farland ...................................................................................41
Hình 2.4. Bộ KIT API 20 NE và thuốc thử .................................................................41
Hình 2.5. So sánh độ đục của vi khuẩn A. xylosoxidans trong nước muối sinh lý với
mức Mc Farland 0,5 ...................................................................................................42
Hình 2.6. API AUX MEDIUM sau khi cho 200 µl huyền phù vào .............................42

Hình 2.7. Bộ KIT API 20 NE sau khi bơm dịch ..........................................................43
Hình 2.8. Mẫu so sánh kết quả của bộ KIT API 20 NE ...............................................45
Hình 3.1. Kết quả bộ KIT sau 24 giờ ..........................................................................46
Hình 3.2. Kết quả bộ KIT sau 48 giờ ..........................................................................47
Hình 3.3. Kết quả so sánh trên API WEB ...................................................................49
Hình 3.4. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrate ....................................50
Hình 3.5. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn nitrite .....................................51
Hình 3.6. Biểu đồ xác định phương trình đường chuẩn amoni ....................................53
Hình 3.7. Mật độ quang của vi khuẩn .........................................................................54
Hình 3.8. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ..............................................................55
Hình 3.9. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A.xylosoxidans theo
mật độ ........................................................................................................................57

vii


Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.10. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................57
Hình 3.11. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo
thời gian .....................................................................................................................59
Hình 3.12. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................60
Hình 3.13. Động học phản nitrate và hiệu quả xử lý của vi khuẩn A. xylosoxidans theo
thời gian .....................................................................................................................62
Hình 3.14. Tốc độ chuyển hóa nitơ trung bình ............................................................63

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngành công nghiệp chế biến thủy sản là một ngành kinh tế mũi nhọn đi đầu
trong hội nhập kinh tế quốc tế. Bên cạnh những thành quả đạt được về kinh tế - xã hội,
ngành công nghiệp này cũng gây ra những vấn đề môi trường đáng lo ngại như gây ô
nhiễm không khí, ơ nhiễm chất thải rắn,… và nghiêm trọng hơn nữa là ô nhiễm nguồn
nước.
Nước thải chế biến thủy sản chứa thành phần ô nhiễm hữu cơ như COD, BOD
và hàm lượng nitrate khá cao. Với các phương pháp xử lý nước thải hiện nay như
phương pháp xử lý hóa lý, phương pháp xử lý hóa học,… có thể xử lý hiệu quả được
COD và BOD nhưng vẫn chưa xử lý triệt để được nguồn nitrate tồn đọng trong nước
thải.
Hiện nay, các phương pháp xử lý nước thải ngày càng đi sâu vào áp dụng các
phương pháp sinh học. Đối với nước thải chế biến thủy sản, việc áp dụng phương pháp
xử lý sinh học rất thích hợp vì có hàm lượng chất hữu cơ cao, dễ phân hủy sinh học bởi
vi khuẩn. So với các phương pháp xử lý hóa lý, hóa học thì phương pháp xử lý sinh
học tiết kiệm hơn về quy mô cũng như giá thành đầu tư. Đặc biệt phương pháp xử lý
sinh học sẽ không gây tái ô nhiễm môi trường – một nhược điểm mà phương pháp xử
lý hóa học hay mắc phải. Do đó, để xử lý được nguồn nitrate tồn đọng cần áp dụng các
phương pháp xử lý sinh học, ứng dụng các chủng vi khuẩn phản nitrate vào quy trình
xử lý để đạt hiệu quả xử lý cao hơn.
Trước tình hình trên, được sự cho phép của khoa Cơng nghệ sinh học – Thực
phẩm – Môi trường, tác giả thực hiện đề tài “Bƣớc đầu ứng dụng chủng vi khuẩn
phản nitrate Achromobacter xylosoxidans trong xử lý nƣớc thải chế biến thủy sản
giàu nitrate”.

1


Đồ án tốt nghiệp

2. Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện thích hợp cho q trình xử lý nitrate của chủng vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans trong nước thải giàu nitrate.
Ứng dụng chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans vào xử lý
nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phịng thí nghiệm.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
Khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter
xylosoxidans.
Khảo sát sự thích ứng của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans theo sự
phối trộn giữa tỷ lệ nước thải chế biến thủy sản : tỷ lệ môi trường Giltay cải tiến.
Khảo sát mật độ thích hợp của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans bổ
sung vào nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate.
Khảo sát thời gian xử lý nitrate của chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter
xylosoxidans trong nước thải chế biến thủy sản giàu nitrate.
Chạy mơ hình MBBR phản nitrate quy mơ phịng thí nghiệm.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp tổng hợp tài liệu:
-

Thu thập, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tài liệu internet có liên quan
đến đề tài.

-

Lựa chọn, tổng hợp các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề tài.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
-

Sử dụng chủng vi khuẩn phản nitrate.

-

Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn phản nitrate bằng bộ KIT
API 20 NE.

-

Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và khả năng phản
nitrate của chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans trong nước thải

2


Đồ án tốt nghiệp
chế biến thủy sản như thời gian, mật độ tế bào vi khuẩn, tỷ lệ mơi trường
thích hợp để đạt hiệu quả xử lý nitrate cao và khơng tích lũy nitrite cũng
như phát sinh amoni.
-

Dựa trên các thơng số thí nghiệm tiến hành chạy mơ hình xử lý nước thải
chế biến thủy sản giàu nitrate quy mô phịng thí nghiệm.

Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
-

Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm.

-

Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel.

-

Xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV. Các số liệu
sau đó được phân tích ANOVA và được trắc nghiệm phân hạng LSD với
mức ý nghĩa 0,05.

5. Các kết quả đạt đƣợc của đề tài
Tìm ra được tỷ lệ phối trộn, mật độ và thời gian xử lý thích hợp của vi khuẩn
phản nitrate Achromobacter xylosoxindans để ứng dụng vào xử lý nước thải chế biến
thủy sản giàu nitrate quy mơ phịng thí nghiệm.

3


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về vi khuẩn phản nitrate Achromobacter Xylosoxidans
1.1.1. Giới thiệu chung
Achromobacter xylosoxidans là vi khuẩn Gram (-), gần giống với chủng
Alcaligenes, có khả năng phản nitrate theo con đường dị hóa trong điều kiện yếm khí
(anaerobic) cho sản phẩm cuối cùng là N2, tương tự như Pseudomonas stutzeri,
Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Thiobacillus denitrificans và
Thiosphera pantotropha.
Phân loại vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria

Lớp: Beta Proteobacteria
Bộ: Burkhol deriales
Họ: Alcaligenaceae
Chi: Achromobacter
Loài: Achromobacter xylosoxidans
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans là:
-

Vi khuẩn Gram âm (-)

-

Hình que.

-

Kích thước 0.4 x 0.7 – 1.0µm.

-

Có tiên mao.

4


Đồ án tốt nghiệp

Gram (-)

Tiên mao

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
1.1.3. Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn Achromobacter xylososidans là:
-

Vi khuẩn kỵ khí tùy nghi.

-

Có khả năng di động.

-

Không sinh nội bào tử.

1.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được thể hiện
trong bảng 1.1.

5


Đồ án tốt nghiệp
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. xylosoxidans
STT

Thử nghiệm

Kết quả

1

Catalase

(+)

2

O/F

O+/F-

3

Oxidase

(+)

4

MR

(-)

5

VP

(-)

6

Indol

(+)

7

Tạo màng biofilm

(+)

1.1.5. Nguồn phân lập vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được phân lập từ:
-

Nguồn nước thải giàu nitơ như nước thải chế biến thủy sản, nước thải
chăn nuôi,…

-

Nguồn nước thải nhiễm 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT).

Quy trình phân lập chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans từ nguồn nước
thải chế biến thủy sản được thể hiện ở hình 1.2 (Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012).

6

Đồ án tốt nghiệp

Nước thải chế biến thủy sản

Tăng sinh trong mơi trường Giltay NO3-

Quan sát MT đục,
sinh khí

Định tính khử
NO3-

Định tính NO2- tạo
thành

Chọn ống tăng sinh đục, sinh khí, khử nitrate

Phân lập trên môi trường thạch Giltay NO3-

Chọn ra chủng vi khuẩn thuần khiết

Tăng sinh trong môi trường Giltay NO2-

Quan sát MT đục,
sinh khí

Định tính khử
NO2-

Chọn chủng khử nitrite, sinh ít NH4+

7

Định tính NH4+
tạo thành


Đồ án tốt nghiệp

Test O/F và các test sinh hóa khác

Chọn chủng không lên men glucose

Khảo sát khả năng khử N-NO2-

Định tính, định lượng
NO3-, NO2-, NH4+

Xác định thể tích
khí sinh ra

Xác định pH mơi
trường

Chọn chủng khử NO3-, sinh ít NH4+, sinh khí,
tăng pH

Khảo sát khả năng khử N-NO3-

Chọn chủng có hiệu suất xử lý N-NO3- cao,
khơng tích lũy N-NO2-, nồng độ NH4+ sinh ra ít

(Nguyễn Thị Hồng Đào, 2012)
Hình 1.2. Quy trình phân lập chủng vi khuẩn phản nitrate Achromobacter xylosoxidans

8


Đồ án tốt nghiệp
Mẫu nước thải được pha loãng bằng nước muối sinh lý (0,85%). Sau đó được
tăng sinh trên mơi trường Giltay có chứa nguồn C là acid citric, N là KNO3 và một số
chất quan trọng khác. Dấu hiệu nhận biết sự phát triển của vi khuẩn khử nitrate là có
sinh khí trong ống durham, đục mơi trường và pH mơi trường giảm.
Từ các ống dương tính khử nitrate, thực hiện cấy ria sang môi trường thạch
Giltay NO3- (agar 2% - 2,5). Các khuẩn lạc riêng rẽ được tiến hành cấy ria nhiều lần
trên môi trường Giltay thạch cho đến khi thu được các chủng vi khuẩn thuần khiết.
Tiến hành các test sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phản nitrate phân lập được và
khảo sát khả năng khử nitrate, nitrite của chủng vi khuẩn phân lập.
1.1.6. Định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S
Kết quả định danh bằng giải mã trình tự gene rRNA 16S (Lê Trần Ánh Tuyết,
2013) và tra cứu trong hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey cho thấy đây là vi
khuẩn phản nitrate tiềm năng và thuộc mức độ an toàn sinh học loại 2 (Busse, HJ và
cộng sự, 2006).
Ngoài ra, vi khuẩn này cũng thể hiện nhiều khả năng sử dụng nhiều nguồn năng
lượng hữu cơ khác nhau. Đây là vi khuẩn được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới để
phân hủy các hợp chất xenobiotic như endosulfan (Li W và cộng sự, 2009), chrysene
(Chirag M và cộng sự, 2011), estradiol (Iasur-Kruh L và cộng sự, 2011), hợp chất
phenol (Ho YN và cộng sự , 2012), thuốc nhuộm (Manikandan N và cộng sự , 2012).

9


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.3. Kết quả giải trình tự chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans

Hình 1.4. Kết quả so sánh trình tự rRNA 16S với Genbank

10


Đồ án tốt nghiệp
1.1.7. Một số ứng dụng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
1.1.7.1. Xử lý các hợp chất khó phân hủy
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng phân hủy một số hợp chất
như PAHs, 2,4,6-tribromophenol, p-nitrophenol… (Niansheng Wan và cộng sự, 2007).
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans sử dụng p-nitrophenol như nguồn
carbon, nitơ và năng lượng duy nhất, phân hủy hoàn toàn sau 7 ngày ở điều kiện hiếu
khí (Niansheng Wan và cộng sự, 2007).
Ngồi ra, vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans cịn có khả năng phân hủy hợp
chất 2,4,6 – trinitrotoluene (TNT) là chất có độc tính cao đối với nhiều sinh vật (Đặng
Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2009). Đối với con người, TNT được biết đến là chất gây ung
thư nhóm C, gây hỏng gan, rồi loạn chức năng cơ thể dẫn đến các bệnh về đường tiêu
hóa và hơ hấp. Chủng vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng sử dụng TNT
như nguồn nitrogen và sử dụng làm năng lượng cho quá trình sinh trưởng (Esteve và
cộng sự, 2001). Các enzyme nội bào và ngoại bào của vi khuẩn Achromobacter
xylosoxidans đóng vai trị quan trọng, tham gia vào q trình phân hủy sinh học TNT.
1.1.7.2. Khả năng khử màu của malachite green
Malachite green có tên hóa học là triphenylmetan.

Danh pháp quốc tế: 4-[(4-dimethylaminophenyl)-phenyl methyl]-N, Ndimethyl-aniline.
Công thức phân tử: C23H25ClN2
Công thức cấu tạo:

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của malachite green

11


Đồ án tốt nghiệp
Malachite green thường được biết đến như một loại phẩm nhuộm màu xanh.
Ngồi ra malachite green cịn được sử dụng như chất sát trùng, diệt nấm, dùng để sát
trùng ao hồ,…
Khi bị hấp thụ vào trong cơ thể dưới cơ chế tác động của cơ thể malachite green
sẽ bị biến đổi thành hai dạng quan trọng. Dạng thứ nhất là Carbinol, dạng này che phủ
tế bào rất nhanh. Khi vào bên trong tế bào Carbinol sẽ kết hợp với quá trình trao đổi
chất và biến thành dạng Leuco malachite green (LMG). Dạng này có độc tính và tồn tại
trong cơ thể lâu hơn so với dạng phẩm nhuộm malachite green.
Một vài nghiên cứu đã cho thấy rằng malachite green có độc tính cao đối với
những lồi cá nước ngọt, ở cả tình trạng cấp tính và mãn tính (Steffens và cộng sự.,
1961). Malachite green cũng là một chất độc đối với đường hô hấp (Werth, 1985).
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng xử lý rất mạnh màu của
malachite green. Tỷ lệ xử lý khoảng 86% trong khoảng một giờ khi nồng độ của
malachite green là 2000 mg/L.
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans có khả năng tẩy màu của malachite
green là nhờ các enzyme nội bào và enzyme ngoại bào. Kết quả kỹ thuật PCR cho thấy
vi khuẩn có khả năng phân hủy malachite có chứa một gene triphenylmethane TMR.
Để kiểm tra khả năng xử lý màu của chủng vi khuẩn, thí nghiệm kiểm tra tiến
hành bổ sung 100 mg/l thuốc nhuộm và tỷ lệ cấy giống là 5%. Điều chỉnh pH về 7, ủ ở
nhiệt độ 370C trong khoảng 48 giờ. Sự khử màu được theo dõi bằng cách đo OD của

sinh khối tế bào ở bước sóng 538 nm.
1.1.8. Khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
1.1.8.1. Cơ chế quá trình phản nitrate
Tìm hiểu sâu về cơ chế khử nitrate, thì vi khuẩn có thể thực hiện hai q trình
khử nitrate theo hai mục đích khác nhau (Bảng 1.2).
-

Tổng hợp năng lượng nhờ q trình hơ hấp kỵ khí mà nitrate là chất nhận
điện tử cuối cùng, gọi là khử nitrate dị hóa.

12


Đồ án tốt nghiệp

-

Chuyển hóa NO3- thành NH4+ để tổng hợp nên cấu trúc tế bào, gọi là khử
nitrate đồng hóa.

Bảng 1.2. Khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa trong chu trình N của vi khuẩn
Khử nitrate đồng hóa

Khử nitrate dị hóa

Đồng hóa

Amoni hóa

Phản nitrate

(sinh tổng hợp các hợp chất

(khử độc tế bào)

chứa nitơ)

Khử nitrate hô hấp

Khử nitrate đồng hóa

NO3- → NO2-

NO3- → NO2-

(giải phóng nitrite hoặc khử tiếp)

(khử tiếp)

Khử nitrite hô hấp thành
nitrite oxide rồi nitrous
oxide
NO2- → NO →N2O

Amoni hóa làm giảm nitrite
NO2- → NH4+
(giải phóng amoni)

Khử nitrite đồng hóa
NO2- → NH4+

(đồng hóa amoni)

(sinh khí)
Hơ hấp khử N2O thành nitơ
N2 O → N 2
(sinh khí)
(Nguồn: Zumft WG., 1997)

13


Đồ án tốt nghiệp

-

Khử nitrate dị hóa
Sau khi khử nitrate dị hóa thành nitrite qua hơ hấp kị khí, có thể xảy ra đồng

thời hai quá trình khử nitrite :
Phản nitrate: nhánh thứ nhất khử tiếp NO2- → NO (k) → N2O (k) và cuối cùng
tạo ra N2.
Khử nitrate dị hóa amoni hóa: q trình này cịn được gọi là q trình khử độc
tế bào.
-

Khử nitrate đồng hóa
Khử nitrate đồng hóa được diễn ra với mục đích tạo ra NH4+ là nguồn N cho quá

trình tổng hợp tế bào của vi khuẩn. Enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa nitrite thành
amoni (NH4+) và amoniac (NH3) là NirA do gen nirA và NasB do gene nasB mã hóa.

Cả hai cơ chế khử nitrate dị hóa và khử nitrate đồng hóa, bước đầu đều khử
nitrate về nitrite nhưng enzyme xúc tác là khác nhau. Ở khử nitrate đồng hóa enzyme
xúc tác do gene nas mã hóa, trong khi khử nitrate dị hóa là do gene nar/nap mã hóa.
Như vậy, trong q trình phản nitrate chỉ có q trình khử nitrate dị hóa – hơ
hấp nitrate kị khí mới có ý nghĩa xử lý N trong nước thải. Đó là cơ sở để tiến hành
phân lập chủng vi khuẩn mong muốn. Nghĩa là chủng vi khuẩn đó có khả năng khử
nitrate và khử nitrite hồn tồn, tạo thành khí N2 và khơng hoặc ít tạo ra amoni
(NH4+).Vì nếu lượng amoni tạo ra nhiều sau quá trình xử lý thì việc ứng dụng vi khuẩn
đó vào xử lý nước thải khơng cịn ý nghĩa, ngược lại cịn làm cho nước ơ nhiễm
nghiêm trọng hơn.

14


Đồ án tốt nghiệp
1.1.8.2. Các điều kiện thích hợp cho quá trình phản nitrate của vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans
 Ảnh hưởng của oxy lên khả năng tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi
khuẩn Achromobacter xylosoxidans
Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans được tăng sinh trong điều kiện hiếu khí
để tăng mật độ vi khuẩn và xử lý nitrate trong điều kiện thiếu khí kết hợp với giá thể
bám dính.
Theo kết quả (Lê Trần Ánh Tuyết, 2013) cho thấy trong điều kiện hiếu khí khả
năng tăng trưởng của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans tốt hơn so với điều kiện
thiếu khí. Do đó, sinh khối nên được tăng sinh riêng và tăng cường cho hệ thống xử lý
để việc ứng dụng vi khuẩn khử nitrate hiệu quả hơn.
 Nguồn cacbon thích hợp cho khả năng phản nitrate của vi khuẩn
Achromobacter xylosixidan
Trong xử lý loại bỏ nitơ trong nước thải, nếu quá trình phản nitrate tiến hành
trước q trình xử lý hiếu khí (tiền phản nitrate - pre-denitrification treatment), thì

nguồn năng lượng và C cho vi khuẩn phản nitrate chính là nguồn carbon hữu cơ trong
nước thải. Tuy nhiên, nếu thực hiện công nghệ hậu phản nitrate (post-denitrification),
COD nước thải đã giảm phần lớn sau quá trình bùn hoạt tính, khơng cịn đủ cung cấp
cho vi khuẩn phản nitrate. Khi ấy một nguồn carbon bên ngoài cần được bổ sung.
Trước đây, methanol thường được bổ sung đóng vai trị này, nhưng sau này các nguồn
hữu cơ khác đã được nghiên cứu, trong đó theo nhiều tài liệu, acetate là nguồn C thích
hợp hơn cả (Huỳnh Văn Thành, 2013).
Khảo sát các mơi trường để tìm ra mơi trường chứa nguồn cacbon thích hợp cho
sự tăng trưởng và khả năng phản nitrate của vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans đã
chọn ra được mơi trường thích hợp là mơi trường Giltay được thay thế asparagines
bằng pepton, citrate được thay thế bằng acetate. Mơi trường này có nguồn C và N thích

15