Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và xác định hoạt tính kháng oxy hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ANTHOCYANIN TỪ PHẾ
LIỆU GẠO ĐEN VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH
KHÁNG OXY HĨA

Ngành:

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN LỆ HÀ
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110478

:

LÊ TRÍ KIỂNG
Lớp: 11DSH05

TP. Hồ Chí Minh, 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Là sinh viên năm năm cuối của Trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh,

nay được vinh dự làm đồ án tốt nghiệp để hồn tất chương trình học của mình. Tơi
cam đoan đây là nghiên cứu do tơi tiến hành tại phịng thí nghiệm Khoa Công nghê
Sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh.
Những số liệu trong bài hồn tồn trung thực chưa từng có ai cơng bố.

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Lê Trí Kiểng


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi
dạy con thành người và là người thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững
chắc nhất của con, là người giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động
viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ
Khoa Cơng nghệ sinh học-Thực phẩm-Mơi trường, cùng tồn thể Thầy Cơ Trường
Đại học Cơng nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em
những kiến thức quý báo về cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ ngày em bước
chân vào giảng đường đại học.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS.Nguyễn Lệ Hà, người thầy đáng kính,
đã ln tận tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực
nghiệm của đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung
Dũng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phịng thí nghiệm Khoa
Công nghệ sinh học-Thực phẩm-Môi trường, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí
Minh.

Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH05 đã ln khích lệ, động viên và giúp đỡ
mình trong suốt quá trình học tập tại trường và trong quá trình làm đồ án tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
SVTH: Lê Trí Kiểng


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ______________________________________ v
DANH MỤC CÁC BẢNG _____________________________________________vi
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH _______________ vii
MỞ ĐẦU __________________________________________________________ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ____________________________________________ 7
1.1 Gạo đen._________________________________________________________ 7
1.1.1 Khái niệm ______________________________________________________ 7
1.1.2 Thành phần hóa học ______________________________________________ 7
1.2 Anthocyanin. _____________________________________________________ 8
1.2.1 Giới thiệu chung _________________________________________________ 8
1.2.2 Cấu trúc phân tử _________________________________________________ 8
1.2.3 Tính chất, đặc điểm. _____________________________________________ 12
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin. ____________ 13
1.2.4.1 Cấu trúc _____________________________________________________ 13
a) Cấu trúc chuyển hóa trong mơi trường lỏng. _____________________________ 13
b) Cấu trúc hóa học __________________________________________________ 15
1.2.4.2 pH _________________________________________________________ 17
1.2.4.3 Nhiệt độ. ____________________________________________________ 18
1.2.4.4 Oxy. ________________________________________________________ 19

1.2.4.5 Enzyme _____________________________________________________ 20
1.2.4.6 Ánh sáng. ____________________________________________________ 21
1.2.4.7 Đường và các sản phẩm biến tính của chúng _________________________ 21
1.2.4.8 Các ion kim loại. ______________________________________________ 22

i


Đồ án tốt nghiệp

1.2.4.9 Sulfurdioxide (SO2) ____________________________________________ 23
1.2.4.10 Acid ascorbic ________________________________________________ 24
1.2.5 Sự phân bố của anthocyanin. ______________________________________ 25
1.2.6 Các anthocyanin đã được thương mại hóa ____________________________ 27
1.2.7 Ứng dụng của anthocyanin. _______________________________________ 27
1.3 Các thành tựu đạt được. ____________________________________________ 28
1.3.1 Phương pháp tách chiết anthocyanin_________________________________ 28
1.3.2 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ quả dâu Hội An _________________ 28
1.3.3 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. _____________________ 29
1.3.4 Phương pháp tách chiết anthocyanin từ gạo đen. _______________________ 30
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. ____________________________ 31
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.____________________________________ 31
2.1.1 Thời gian. _____________________________________________________ 31
2.1.2 Địa điểm. _____________________________________________________ 31
2.2 Nguyên liệu– thiết bị - hoá chất. _____________________________________ 31
2.2.1 Nguồn gạo đen. _________________________________________________ 31
2.2.2 Một số hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ___________________________ 31
2.2.3 Một số dụng cụ và thiết bị chủ yếu dùng trong nghiên cứu________________ 32
2.2.3.1 Dụng cụ._____________________________________________________ 32
2.2.3.2 Thiết bị. _____________________________________________________ 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu. __________________________________________ 33
2.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. _________________ 34
2.3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo
đen _______________________________________________________________ 34

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly
anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 35
2.3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến q
trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. ____________________________________ 37
2.3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung mơi để trích ly
anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 39
2.3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. 41
2.3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 43
2.3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ____________ 45
2.3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thơng số cho q trình cô quay thu nhận dịch chiết
anthocyanin cô đặc. __________________________________________________ 46
2.4 Các phương pháp phân tích sử dụng trong nghiên cứu ____________________ 47
2.5 Các phương pháp thống kê và xử lý số liệu _____________________________ 47
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN _______________________________ 48
3.1 Thí nghiệm 1: Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu. __________________ 48
3.2 Thí nghiệm 2: Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ mẫu gạo đen
__________________________________________________________________ 48
3.3 Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của kích thước hạt đến hiệu quả trích ly
anthocyanin từ gạo đen. _______________________________________________ 49
3.4 Thí nghiệm 4: Xác định ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho ngun liệu đến

q trình trích ly anthocyanin từ gạo đen. _________________________________ 50
3.5 Thí nghiệm 5: Xác định của tỷ lệ HCl trong pha chế dung mơi để trích ly anthocyanin
từ gạo đen. _________________________________________________________ 52
3.6 Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ gạo đen. _ 53
3.7 Thí nghiệm 7: Xác định thời gian thích hợp trích ly anthocyanin từ gạo đen. ___ 55

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.8 Thí nghiệm 8: Xác định hoạt tính kháng oxy của anthocyanin. ______________ 56
3.9 Thí nghiệm 9: Xác định thơng số cho q trình cơ quay thu nhận dịch chiết
anthocyanin cô đặc. __________________________________________________ 58
KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ ___________________________________________ 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ____________________________________________ 69
PHỤ LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CƯU
___________________________________________________________________ 1
PHỤ LỤC B SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM. _________________________________ 11

iv


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl).
EtOH (Ethanol)
IC50 (Effective concentration of 50%).

MeOH (Methanol)

v


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen. ............................................................... 7
Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên. ........................................ 10
Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến. ................................................................... 11
Bảng 1.4. Bảng các anthocyanin có nguồn gốc thực vật .......................................... 26
Bảng 3.1. Xác định độ ẩm nguyên liệu. .................................................................... 48
Bảng 3.2. So sánh giá trị IC50 của Ascorbic acid và anthocyanin. .......................... 57
Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng DPPH của anthocyanin theo thời gian cô quay.
..................................................................................................................................... 61
Bảng 3.4. Đánh giá sơ bộ cảm quan của dịch chiết anthocynin ............................... 67

vi


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Gạo đen ........................................................................................................7
Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl hoặc H,
R4 là OH hoặc glucosyl) ............................................................................................... 9
Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau. ...................................12
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước. ................................ 14
Hình 1.5. Sơ đồ sự biến tính của anthocyanin 3,5-diglucoside tại pH 3,7 ...............18

Hình 1.6. Sự biến tính anthocyanin với phản ứng oxy hóa catechol. .......................20
Hình 1.7. Phản ứng ngưng tụ của A: Cyanidin và furural; B: Cyanidin ketobase và
furural .........................................................................................................................22
Hình 1.8. Sơ đồ Jurd đối với phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin. .....23
Hình 1.9. Sự chuyển hóa malvin thành malvone bởi H2O2 tạo thành từ sự oxy hóa
Ascorbic acid ..............................................................................................................24
Hình 1.10. Fla-2-ene được tạo thành từ phản ứng giữa Ascorbic acid và anthocyanin.
.....................................................................................................................................25
Hình 1.11. Quy trình tách chiết anthocyanin từ bắp cải tím. ....................................30
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tóm tắt nội dung thí nghiệm ............................................33
Hình 2.2. Quy trình trích ly anthocyanin dự kiến ....................................................34
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm xác định kích thước ngun liệu cho q trình trích ly
anthocyanin từ gạo đen............................................................................................... 36
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu ......38
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ HCl trong pha chế dung mơi để trích ly
anthocyanin từ gạo đen............................................................................................... 40
Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thích hợp để trích ly anthocyanin từ
gạo đen ........................................................................................................................42
Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian trích ly anthocyanin từ gạo đen ......44
Hình 3.1. Quét quang phổ mẫu anthocyanin từ bước sóng 400-700nm trong dung mơi
EtOH:0,1N HCl (85:15, v:v). .....................................................................................48

vii


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.2. Ảnh hưởng của kích thước hạt nguyên liệu đến hàm lưởng anthocyanin từ
dịch chiết.....................................................................................................................49
Hình 3.3. Ảnh hưởng của chế độ xử lý nhiệt cho nguyên liệu đến hàm lượng

anthocyanin từ dịch chiết. ..........................................................................................50
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi EtOH:HCl 1% đến hàm lượng anthocyanin
từ dịch chiết. ...............................................................................................................52
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng anthocyanin
từ dịch chiết. ...............................................................................................................53
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến nồng độ anhthocynin trong dịch chiết.
.....................................................................................................................................55
Hình 3.7. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với Log[nồng
độ anthocyanin mg/ml]. .............................................................................................. 56
Hình 3.8. Mối tương quan tuyến tính giữa % gốc tự do DPPH bị ức chế với
Log[Ascorbic acid, µg/ml]. ........................................................................................57
Hình 3.9. Sự thay đổi nồng độ của anthocyanin trong dịch chiết bán thành phẩm theo
thời gian cơ quay. .......................................................................................................58
Hình 3.10. Hiệu suất thu hồi anthocyanin trong q trình cơ quay dịch trích ly theo
thời gian. .....................................................................................................................59
Hình 3.11. Sự thay đổi về khối lượng của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian
cơ quay. .......................................................................................................................59
Hình 3.12. Sự thay đổi về thể tích của dịch chiết bán thành phẩm theo thời gian cô
quay. ............................................................................................................................ 60
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian cơ quay đến khả năng bắt gốc tự do DPPH của
dịch trích ly anthocyanin từ gạo đen. .........................................................................61
Hình 3.16. Sơ đồ quy trình trích ly anthocyanin từ gạo đen .....................................64
Hình 3.14. Dịch chiết anthocyanin trước cơ quay. ...................................................67
Hình 3.15. Dịch chiết sau cô đặc ...............................................................................67

viii


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài.
1.1 Đặt vấn đề.
Chất màu thực phẩm là một trong những phụ gia quan trọng, được sử dụng
không chỉ trong chế biến thực phẩm, mà cả trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm
và nhiều ngành công nghiệp khác… Nhu cầu về chất màu thực phẩm rất lớn và không
ngừng tăng lên trong những năm gần đây.
Do nước ta chưa sản xuất được, nên hầu hết các chất màu đều phải nhập từ
nước ngồi. Một số trường hợp, chất màu khơng rõ nguồn gốc hoặc không đạt tiêu
chuẩn gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng.
Trong đó, chất màu quan trọng và hiện diện ở hầu hết các loài thực vật là
anthocyanin. Mà gạo đen được xem là chứa anthocyanin với nồng độ tương đối cao.
Đây là nguồn cung cấp màu triển vọng, an toàn và sự tương tác với thực phẩm tạo ra
nhiều màu sắc đẹp mắt.
1.2 Lý do chọn đề tài.
Sử dụng tấm gạo đen làm nguồn trích ly anthocyanin bởi vì đây là phế liệu giá
thành rẻ, dễ bị hư hỏng do phần phôi gạo gãy chứa nhiều chất béo dễ bị oxy hóa.
Đây cũng là xu hướng đã và đang được Trung Quốc sử dụng anthocyanin như
một chất màu thực phẩm.
Hiện nay trong lĩnh vực thực phẩm, người ta sử dụng dịch uống Chlorophyll
như một thực phẩm chức năng có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏe. Nếu như đề tài
chứn mình được hoạt tính chống oxy hóa, để tạo dịch uống anthocyanin. Đây sẽ là
tiền đề cho dịch màu các thực phẩm khác nhau.
Những đặc tính quý báu của anthocyanin mà các chất màu hóa học, các chất
màu khác hình thành trong q trình gia cơng kỹ thuật khơng có được, đã mở ra một
hướng nghiên cứu ứng dụng hợp chất màu anthocyanin lấy từ thiên nhiên vào trong
1


Đồ án tốt nghiệp

đời sống hằng ngày, đặc biệt trong cơng nghệ chế biên thực phẩm. Điều đó hồn tồn
phù hợp với xu hướng hiện nay của các nước trên thế giới là nghiên cứu khai thác
chất màu từ thiên nhiên sử dụng trong thực phẩm, bởi vì chúng có tính an tồn cao
cho người sử dụng.
Vì thế đề tài nghiên cứu thu nhận anthocyanin từ phế liệu gạo đen và hoạt tính
chống oxy hóa có ý nghĩa quan trọng đối với việc phát triển kinh tế và xã hội nước
ta. Và đó cũng là lý do nhóm nghiên cứu chọn đề tài này để nghiên cứu.
2. Tình hình nghiên cứu.
Trong nước.
Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, Chiết tách anthocyanin từ quả dâu bằng nước
sunfured và một số đặc tính của chúng, tiến hành chiết anthocyanin thơ với các dung
mơi có nồng độ SO2 là 500ppm, 700ppm, 900ppm, 1100ppm và 1500ppm, bổ sung
1% HCl, nhiệt độ 30°C, thời gian chiết 30 phút. Kết quả thu được hàm lượng
anthocyanin khi nồng độ SO2 đạt 1100ppm là cao nhất.
Nguyễn Thị Lan, Lê Thị Lạc Quyên, nghiên cứu ảnh hưởng của hệ dung mơi
đến khả năng chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ dâu tây Hội An,
trường Đại Học Bách Khoa, Đại Học Đà Nẳng. Kết quả chọn được hệ dung mơi tốt
cho q trình chiết tách chất màu anthocyanin có độ màu cao từ quả dâu là ethanol nước - HC1, với tỷ lệ dung môi ethanol - nước là 1:1 (với 1 % HC1) để hàm lượng
anthocyanin thu được nhiều nhất.
Nguyễn Thị Phương Anh, Nguyễn Thị Lan, nghiên cứu ảnh hưởng của pH
đến màu anthocyanin từ bắp cải tím ứng dụng làm chất chỉ thị an tồn trong phân
tích hóa học và thực phẩm, tạp chí Khoa Học Đà Nẳng. Kết quả khẳng định màu
anthocyanin thay đổi từ đỏ đến xanh khi môi trường thay đổi từ acid sang kiềm.
Huỳnh Thị Kim Cúc và các cộng sự, xác định hàm lượng anthocyanin trong
một sổ nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, tiến hành nghiên cứu xác
định được hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả thuộc khu vực
2

Đồ án tốt nghiệp

miền trung Việt Nam bằng phương pháp pH vi sai. Kết quả cho thấy một số nguyên
liệu có hàm lượng anthocyanin tương đối cao như: quả dâu ta 1,188 %; bắp cải tím
0,909%; lá tía tơ 0,397%; trà đỏ 0,335%, vỏ nho 0,564%, vỏ cà tím 0,441%.
Trên thế giới.
Hàng năm theo ước tính tại các nước châu Âu khoảng 10000 tấn vỏ quả nho
được trích để thu được khoảng 50 tấn anthocyanin. Các phẩm màu gốc anthocyanin
có thể là dung dịch cơ đặc hoặc dạng bột có chứa các phụ gia khác.
Chất nhuộm màu nói chung và chất nhuộm màu thực phẩm nói riêng đã được
người dân các nước trên thế giới sử dụng vào cuộc sống từ thời xa xưa. Một chất màu
được dùng cho thực phẩm nhất thiết phải hội đủ ba tiêu chuẩn về mặt y tế của chất
phụ gia thực phẩm:
+ Nhuộm thực phẩm thành màu theo mục đích, phù hợp với cơng nghệ chế
biến thực phẩm.
+ Khơng có độc tính (gồm cả độc tính cấp, bán cấp và trường diễn)
+ Khơng là nguyên nhân hoặc tác nhân gây bệnh.
Ngoài ra, do yêu cầu riêng của thực phẩm, các chất nhuộm màu dùng trong
lĩnh vực này không gây mùi lạ và làm thay đổi chất lượng thực phẩm.
Sử dụng các chất màu thực phẩm do có quan hệ trực tiếp đến sức khoẻ và tính
mạng con người. Vì vậy ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ đã ban hành luật về sử
dụng chất màu trong thực phẩm. Trong các Bộ luật về chất màu thực phẩm, các chất
màu có nguồn gốc là sắc tố thực vật (chất màu tự nhiên) được quy định ưu tiên.
Tóm lại, hiện nay nghiên cứu chất màu thực phẩm trên thế giới được quan tâm
rất lớn ở nhiều quốc gia với nhiều hướng nghiên cứu mới. Trong các hướng nghiên
cứu đó, tìm kiếm và chiết tách chất màu từ thực vật vẫn được ưu tiên hàng đầu trong
các nghiên cứu. Trong đó bao gồm chất màu anthocyanin (E163) với những đặc tính
sinh học quý báu và an toàn cao. (Lưu Đàm Cư, 2005)
3

Đồ án tốt nghiệp

3. Mục đích nghiên cứu.
Xác định các thơng số thích hợp cho q trình trích ly chất màu anthocyanin
nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích ứng dụng
vào thực phẩm.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu.
Để thực hiện mục đích nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện các thí nghiệm
như sau:
- Xác định độ ẩm ban đầu của nguyên liệu.
- Xác định bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen.
- Xác định ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến q trình trích ly
anthocyanin.
- Xác định ảnh hưởng của xử lý nhiệt sơ bộ cho nguyên liệu đến quá trình trích
ly anthocyanin.
- Xác định tỷ lệ dung mơi thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin.
- Xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin.
- Xác định thời gian thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin.
- Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin.
- Xác định thơng số cho q trình cơ quay thu nhận dịch chiết anthocyanin cô
đặc.
5. Phương pháp nghiên cứu.
- Phương pháp thu thập thông tin: Phương pháp nghiên cứu tài liệu làm cơ sở
bố trí thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Endnote để tìm tài liệu.
- Thực hành trong phịng thí nghiệm.

4

Đồ án tốt nghiệp

- Kết quả được xử lý bằng phần mềm thống kê Stagraphics Plus 4.0
- Vẽ đồ thị bằng phần mềm excel 2013, GraphPad Prism.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
Đã xác định được các thông số thích hợp cho q trình trích ly chất màu
anthocyanin nhằm tách chiết tối đa anthocyanin từ nguyên liệu phù hợp cho mục đích
ứng dụng vào thực phẩm:
- Xác định được độ ẩm ban đầu của nguyên liệu là 11,26% ± 0,04.
- Xác định được bước sóng hấp thu cực đại của anthocyanin từ gạo đen là
λmax=535nm trong dung môi EtOH:HCl 1N.
- Kích thước nguyên liệu là 0,0098 inches cho hiệu quả trích ly anthocyanin
với hàm lượng cao nhất.
- Nguyên liệu ở điều kiện nhiệt độ phòng cho hiệu quả trích ly anthocyanin
với hàm lượng cao nhất.
- Xác định được tỷ lệ dung mơi thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin là
EtOH:HCl 1% 95:5 (v:v).
- Xác định được nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin là 55oC.
- Xác định thời gian thích hợp cho q trình trích ly anthocyanin là 60 phút.
- Xác định được hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanin với giá trị IC50 =
636 (µg/ml).
- Xác định được các thơng số cho q trình cơ quay thu nhận dịch chiết
anthocyanin cơ đặc. Thời gian cơ quay thích hợp là 15 phút. Nhiệt độ cô quay ở 4045oC. Nồng độ anthocyanin trong dịch chiết sau cơ quay đạt 19,086 mg/ml. Thể tích
dịch sau cơ quay cịn lại 21,288 % so với thể tích ban đầu (100ml).

5


Đồ án tốt nghiệp

7. Kết cấu của đồ án.
Nội dung của báo cáo đồ án tốt nghiệp được sắp xếp theo thứ tự như sau:
Nội dung báo cáo gồm có 3 chương :
- Chương 1 : Tổng quan
- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp
- Chương 3 : Kết quả, thảo luận

6


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 Gạo đen.
1.1.1 Khái niệm
Gạo sẫm màu có 2 loại là gạo nếp (nếp cẩm) và gạo lứt huyết rồng. Gạo đen
khác với gạo lứt (brown rice) và chứa lượng dưỡng chất lớn hơn. Lớp cám bên ngoài
chứa một lượng đáng kể vitamin E, có tác dụng tốt cho hệ thống miễn dịch và bảo vệ
các tế bào thoát khỏi sự hủy hoại của gốc tự do. Hơn nữa, theo nghiên cứu của Trung
tâm Nông nghiệp Đại học bang Louisiana tại Baton Rouge, gạo đen chứa nhiều chất
chống oxy hóa anthocyanin hơn các loại gạo khác.

Hình 1.1. Gạo đen
1.1.2 Thành phần hóa học
Bảng 1.1. Thành phần hóa học của gạo đen.
Thành phần

Tỷ lệ %

Nước

14

Protein

8,2

Lipid

1,5

Glucid

74,9

Acid hữu cơ

0,6

Tro

0,8

7


Đồ án tốt nghiệp

1.2 Anthocyanin.
1.2.1 Giới thiệu chung

Các Anthocyanỉn hiện thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn
nhất trong thế giới thực vật. Hiện diện hầu hết ở các thực vật bậc cao, chủ yếu ở lá,
hoa, rễ thân. Thường được tìm thấy ở các tế bào bên ngoài. Thuật ngữ anthocyanin
bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos - nghĩa
là hoa và Kysanesos - nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, khơng chỉ có màu xanh,
anthocyanin cịn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam
và các gam màu trung gian. Các anthocyanìn khi mất hết nhóm đường được gọi là
anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các
loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế lượng anthocyanin lớn
hơn anthocyanidin từ 15-20 lần. Chúng được sử dụng làm phụ gia thực phẩm với ký
hiệu là E613.
Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân
cực nên tan tốt trong dung mơi phân cực.
Anthocyanin hịa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa. Khi kết hợp với
đường

là

cho

phân

tử

anthocyanin

hòa

tan

hơn.

(d-

info.net/uk/colour/anthocyanin.htm).

1.2.2 Cấu trúc phân tử
Anthocyanin là những glucoside do gốc đường glucose, glactose… kết hợp
với gốc aglucon có màu (anthocyanidin). Aglucon của chúng có cấu trúc cơ bản được
mơ tả trong hình 1. Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3, 5, 7; thường được
gắn vào vị trí 3 và 5 cịn vị trí 7 rất ít. Phân tử anthocyanin gắn vào vị trí 3 gọi là
monoglycoside, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycoside.
Anthocyanin là những hợp chất glycoside của anthocyanidin hiện có trong
thiên nhiên bao gồm các dẫn xuất polyhydro và polymethoxy của 2 phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium.

8


Đồ án tốt nghiệp

Sự khác nhau giữa các anthocyanin được xác định bởi sự khác nhau giữa số
lượng và vị trí của nhóm hydroxyl trong phân tử; mức độ methyl hóa của nhóm
hydroxyl; bản chất, vị trí của các nhóm đường gắn vào phân tử; bản chất số nhóm
acid mạch thắng hay mạch vịng gắn vào phân tử.

Hình 1.2. Cation Flavylium (R1 và R2 là OH, H hoặc OCH3, R3 là glucosyl
hoặc H, R4 là OH hoặc glucosyl)
Các aglucon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí
R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3.
Các anthocyanin khi bị mất hết các nhóm đường được gọi là anthocyanidin

hay aglycone, mỗi anthocyanindin có thể bị glycosyl hóa và acyl hóa bởi các loại
đường và các acid khác nhau tại những vị trí khác nhau nên số lượng anthocyanin lớn
hơn 10-20 lần so với số lượng anthocyaninidin
Sự glycosyl hóa các anthocyanin có thể xảy ra ở vị trí 7, 3’, 4’, 5’ đối với nhóm
hydroxyl. Tuy nhiên, do án ngữ khơng gian nên sự glycosyl hóa khơng thể xảy ra ở
vị trí 3’ và 4’.
Căn cứ vào vị trí và số nhóm đường gắn vào anthocyanidin mà người ta phân
loại anthocyanin thành 18 nhóm trong đó có dạng thông dụng nhất là 3-monoside, 3bioside, 3,5-diglycoside và 3,7-diglycoside.
Các loại đường thông thường nhất liên kết với anthocyanidin là glucose, các
mono saccharide (rhamnose, galactose, xylose, arabinose), các disaccharide
9


Đồ án tốt nghiệp

(rutinose, sabubiose, sophorose, ít thơng dụng hơn là lathyrose, gentiobiose hoặc
laminariobiose). Ngồi ra, các trisacchride cũng có thể liên kết với anthocyaninidin.
Bảng 1.2. Các nhóm anthocyanin hiện có trong tự nhiên.
Anthocyanidin R1

R2

R3

R4

R5

R6

R7

Apigeninidin

-H

-H

-H

-OH

-H

-OH

Aurantinidin

-H

-H

-OH
OH
-H -OH

Cyanidin

OCH3
-OH

Delphinidin

-OH

Europinidin

Luteolinidin

OCH3
OCH3
-OH

OH
OH
OH
OH
OH
OH
-H

-OH

Capensinidin

-OH

-H

OCH3

-OH

Pelargonidin

-H

-H

-OH

-OH

-H

-OH

Petunidin

OCH3
OCH3
-OH

-OH

Pulchellidin

-OH

Rosinidin

OCH3
-OH

OH
OH
OH
OH
OH
OH
-H

-OH

Malvidin

OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH

Hirsutidin

Peonidin

Triacetidin

OCH3
-H
-OH
-OH
OCH3
-H
-H
OCH3
-H
OCH3
-OH
-H
-OH

OCH3
-OH
-H

-OH

-OH

-H

-OH

-H
OCH3
-OH
-H

-OH

main
colour
orange

Enumber

orange
bluishred
magenta E163a
purple,
blue
bluish
red
bluishred
orange

E163b

E163d

-OH

orange,
salmon
purple

-H

-OH

magenta E163e

-H

-OH

purple

-H
OCH3
-OH
-H

-OH

bluishred
red

-OH

10

-H

OCH3
-OH
red

E163c

E163f


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2 cho thấy sự methyl hóa các anthocyanin và những hợp chất glycoside
của chúng thường xảy ra ở vị trí C-3’ và C-5’, đơi khi cũng xảy ra ở vị trí C-5 và C7. Tuy nhiên thực tế cho thấy khơng có anthocyanin mà sự glycosyl hóa hoặc
methoxyl hoa xảy ra đồng thời ở các vị trí C-3, -5,-7 và -4’. Nhóm hydroxyl ở một
trong các vị trí C-5, C-7 hoặc C-4’ thì thích hợp cho việc hình thành cấu trúc
quinonoidal (anhydro) base.
Các anthocyanin thường bị acyl hóa bởi acid p-coumaric, cafeic, ferulic, hoặc
những acid sinapic, đơi khi anthocyanin cũng bị acyl hóa bới các acid như : phydroxybenoic, malonic, hoặc acetic. Sự thay thế nhóm acyl thường xảy ra ở vị trí C3 của nhóm hydroxyl đối với đường.
Bảng 1.3. Một số anthocyanin phổ biến.
Anthocyanin

Anthocyanidin

Đường

Có ở cây

Pelargonin

Pelargonidin

2 glucose

Cúc tây

Cianin

Cynanindin

2 glucose

Hoa hồng

Ceraxinanin

Cynanindin

Glucose, galactose Quả mận

Prunixianin

Cynanindin

Ramnoza, glucose

Việt quất

Idain

Cyrinhindin

2 glucose

Cẩm quỳ

Delfin

Peonidin

2 glucose

Mẫu đơn

Malvin

Enidin

glucose

Nho

Peonin

Hirsutidin

2 glucose

Anh thảo

Anthocyanin tính khiết ở dạng tinh thể hoặc vơ định hình là hợp chất khá phân
cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ
thuộc vào pH (hình 2), các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác. Tuy nhiên màu sắc
của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH của môi trường. Thông thường
khi pH < 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH > 7 thì có màu xanh. Ở pH = 1 các
anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ, ở pH 4 ± 5 chúng có thể
chuyển về dạng base cacbinol hay base chalcon không màu, ở pH = 7 ± 8 lại về dạng
base quinoidal anhydro màu xanh.
11


Đồ án tốt nghiệp

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ
cực đại tại bước sóng 510 ± 540 nm. Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu
sắc của các anthocyanin. Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch và nồng độ
anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ
anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh.

Hình 1.3. Sự đổi màu của anthocyanin ở các pH khác nhau.
Trong các chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên thì anthocyanin là họ
phổ biến nhất tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và tìm thấy được trong một
số loại rau, hoa, quả, hạt có màu từ đỏ đến tìm như: gạo đen, quả nho, quả dâu, bắp
cải tím, lá tía tơ, hoa hibiscus, đậu đen, quả cà tím…
1.2.3 Tính chất, đặc điểm.
Màu của anthocyanin hồn tồn thay đổi khi pH mơi trường chuyển từ acid
sang base và giống như các chất chỉ thị acid-base (phenolphtalein, methyl đỏ, methyl

da cam).

12


Đồ án tốt nghiệp

Trong dung dịch acid, anthocyanin tồn tại dạng ở cation flavylium có màu đỏ.
Khi pH tăng dần, có sự tấn cơng của nước vào vịng pyran C, anthocyanin chuyển
dần sang dạng base carbinol và chalcone không màu. Đây chính là q trình hydrat
hóa, yếu tố chính tạo nên sự bạc màu của dung dịch màu-nước. trong dung dịch base,
có sự dịch chuyển của H+ từ -OH trên vịng B, anthocyanin chuyển sang dạng anion
có màu xanh. Khi pH mơi trường càng cao, ion H+ trogn nhóm –OH cịn lại bị phân
hủy và khi ấy điện tử khơng cịn, màu xanh trở nên xanh hơn bởi vì ánh sáng hấp phụ
trở thành đỏ hơn. Trong môi trường trung tính, cả hai dạng cùng tồn tại nên dung dịch
có màu tím.
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến màu sắc và độ bền của anthocyanin.
So với đa số các chất màu thiên nhiên, anthocyanin là chất màu có độ bền kém
hơn, nó chỉ thể hiện tính bền trong mơi trường acid. Ngồi ra, nó có thể phân hủy tạo
thành dạng không màu và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy có dạng màu nâu cộng
với những sản phấm khơng tan.
Sự phân hủy anthocyanin có thể xảy ra trong quá trình trích ly và tinh chế
chúng, đồng thời sự phân hủy này cịn xảy ra trong q trình xử lý và bảo quản các
sản phấm thực phẩm.
Độ bền của các anthocyanin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: cấu trúc hóa học
của anthocyanin, pH, nhiệt độ, sự có mặt của copigment, ion kim loại, oxy, acid
ascorbic, SO2, ánh sáng, enzyme, đường và các sản phấm biến tính của chúng. Vì
vậy, nghiên cứu các yếu tổ ảnh hưởng đến độ bền của anthocyanin là điều cần thiết
trước khi ứng dụng nó như một chất màu thực phẩm.
1.2.4.1 Cấu trúc

a) Cấu trúc chuyển hóa trong mơi trường lỏng.
Trong mơi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH.
Đỏ ở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung tính, và khơng màu ở pH cao.

13


Đồ án tốt nghiệp

Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của anthocyanin và
aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu
đỏ, carbinol pseudobase (B), và chalcone (C) khơng màu.

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc anthocyanin chuyển hóa trong nước.
Khi pH < 2.0, các anthocyanin tồn tại chủ yếu dạng cation flavylium màu đỏ
(R3=0-đường) hoặc màu vàng (R3 = H).Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh
thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinonoidal thường
tồn tại như một hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 (nếu có) là tương tự.
Khi để yên, sự chuyển hóa hơn nữa sẽ xảy ra đó là sự tách nước của cation flavylium
cho dạng carbinol không màu hay pseudobase (hemiacetal), Dạng này cân bằng với
dạng chalcone vòng mở không màu.
Cis (CE) và trans-chalcone (Cz) được tạo thành từ carbinol pseudobase bởi
phản ứng mở vịng nhanh và isomer hóa chậm. Cả 2 chalcone bình thường bởi chung
có nhóm chức carbonyl ở cạnh vịng B, trong đó chalcone bình thường có nhóm
carbonyl ớ kế cận vịng A.
Dạng quinonoidal base được tạo thành thông thường ở pH > 3. Cation
flavylium tương đối bền ở môi trường acid (như pH < 3). Trong môi trường trung

14