Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ
NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp.
CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum
PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110383

: NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH
Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân, được xuất phát từ
yêu cầu trong cơng việc để hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc
rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong đồ án được thu hoạch
trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa được từng được ai công bố trước đây.
Tp.HCM, ngày .... tháng ..... năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Trinh

ii


LỜI CẢM ƠN
Mọi sự nỗ lực đều được đền đáp bằng những thành quả tốt đẹp và mọi trái
ngọt đều do bàn tay con người vun xới. Để có thể đạt được những kết quả như ngày
hôm nay, em biết ơn vơ cùng và xin được tỏ lịng biết ơn bằng những lời cầu chúc
tốt đẹp và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến:
Xin được gửi đến BGH Trường Đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh
cùng tồn thể quý thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường đã truyền dạy cho em những kiến thức cùng những bài học kinh nghiệm vô
cùng quý giá.
Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ
Chí Minh nói chung và các anh chị trong Phịng Cơng nghệ vi sinh nói riêng. Đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị vật chất cũng như những sự quan tâm giúp
đỡ, giúp em hồn thành tốt bài luận này.
Khơng thể khơng nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị
Mai Châm và kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, những người đã tận tình hướng dẫn trong
quá trình tiến hành cũng như từng bước giúp em hoàn thiện hơn bản thân và những
bài học kinh nghiệm quan trọng trong bước đường tương lai. Nhờ sự động viên dìu
dắt của thạc sĩ đã tạo động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện.
Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã ln cổ vũ và tạo những
điều kiện tốt nhất. Chính những kết quả này sẽ ln là trang bài học quý giá với em
trong suốt quãng đường phía trước.
Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Trinh

iii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài .....................................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ................................................................2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3
1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu ....................................................................3
1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật ..........................................................4
Phân loại ...............................................................................................................4
Hình thức ký sinh trên thực vật ............................................................................5
1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. ....................................................................5
Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. ....................................................5
Vòng đời của tuyến trùng M. incognita ............................................................6
Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. ............................6
Đặc điểm gây hại...............................................................................................8
Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. ..................................9
1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum .................................................9
1.3.1 Hệ thống phân loại ......................................................................................9
1.3.2 Phân bố ......................................................................................................10
1.3.3 Đặc điểm hình thái ....................................................................................11
Hình thái đại thể ..............................................................................................11
Hình thái vi thể ................................................................................................11
1.3.4 Đặc điểm sinh hóa .....................................................................................12
Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào ....................................................................12

Enzyme protease ..........................................................................................12
Chitinase ......................................................................................................14
1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P. liacinum ........15
Nhiệt độ ...........................................................................................................15
pH ....................................................................................................................16
iv


Nguồn dinh dưỡng ..........................................................................................16
1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng
............................................................................................................................17
Cơ chế của q trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng ...................................18
CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................19
2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ......................................................................19
2.2 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................19
2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm ............................19
Vật liệu ...............................................................................................................19
Dụng cụ ..............................................................................................................19
Thiết bị ...............................................................................................................19
Các môi trường và thuốc thử sử dụng ................................................................20
2.4 Nội dung nghiên cứu........................................................................................23
2.5 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................23
2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch ........................23
2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của
nấm P. lilacinum.................................................................................................24
2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .............................................................25
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................27
3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ......27
3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P.
lilacinum .............................................................................................................27

3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P.
lilacinum .............................................................................................................32
3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng
Meloidogyne spp. ...................................................................................................38
3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái
Meloidogyne spp.................................................................................................38

v


3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến
trùng Meloidogyne spp. ......................................................................................41
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................45
4.1. Kết luận ...........................................................................................................45
4.2. Kiến nghị.........................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46
PHỤ LỤC ...................................................................................................................1

vi


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
BR – VT

: Bà Rịa – Vũng Tàu

BVTV

: Bảo vệ thực vật

IJ2

: Infective Juvenile 2

M

: Meloidogyne

MT

: Môi trường

NN-PTNT

: Nông nghiệp- phát triển nông thôn

PDA

: Potato Dextrose Agar

P

: Purpureocillium

TCA

: Trichloroacetic

WA

: Water Agar

CTV

: cộng tác viên

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu
ở Vũng Tàu................................................................................................................22
Bảng 3.1. Đường kính vịng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .............................................................................27
Bảng 3.2. Đường kính vịng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh ...................................................................................30
Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau ................................31
Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất
vùng rễ tiêu khỏe mạnh .............................................................................................33
Bảng 3.5. Đường kính vịng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân
lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh ...................................................................................35
Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau .................................37
Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo
thời gian .....................................................................................................................38
Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các
chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian ..40
Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp.
theo thời gian .............................................................................................................41

Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các
chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian..........44

viii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH
Biểu đồ 3.1. Đường kính vịng phân giải casein trung bình của các chủng nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. ....................31
Biểu đồ 3.2. Đường kính vịng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum
phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. .........................................36
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ...................40
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm
P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ..................43

Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp.. ...................................8
Hình 1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày ni cấy ở 250C ..11
Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm .........................................................12
Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D). .....................28
Hình 3.2 Đường kính vịng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C). ............30
Hình 3.3 Đường kính vịng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ
đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B). ................................34
Hình 3.4 Đường kính vịng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và
72h (B).......................................................................................................................36
Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính
soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và
ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hồn tồn (C). ..................................39

Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm
tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị
nấm ký sinh sau 14 ngày (C). ....................................................................................42

ix


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Theo báo cáo thống kê 6 tháng đầu năm của Bộ NN- PTNT Việt Nam năm
2014 sản lượng tiêu xuất khẩu đạt 111.000 tấn tăng 36% về lượng và 48% giá trị.
Có thể nói, cây hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực đẩy mạnh
phát triển kinh tế các địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế của đất nước.
Cây hồ tiêu được phát triển với quy mô và tốc độ khá lớn tại các tỉnh miền Trung và
Khu vực Đông Nam Bộ. Đặc biệt là Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê của Sở NNPTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ 4 cả nước về diện tích trồng tiêu với tổng diện
tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng hơn 12000 tấn, đứng thứ 4 cả nước (Hiệp hội
hồ tiêu Việt Nam). Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu trong những năm qua bị tổn thất
đáng kể do cây thường bị bệnh với những dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, lá
vàng, cây khơ chết dần mà một trong những nguyên nhân là do tuyến trùng sần rễ
Meloidogyne spp. (Phạm Văn Biên, 1989 và Nguyễn Ngọc Châu, 1990). Đây được
coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong nơng nghiệp. Nhóm tuyến
trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng
khí hậu khác nhau. Hiện nay, khoảng hơn 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó
có 4 lồi ký sinh gây hại phổ biến là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M.
hapla (Vũ Triệu Mân, 2007).
Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học
nhưng vẫn chưa tiêu diệt triệt để. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng đem lại
những lo ngại: tồn dư thuốc trong nông sản, làm mất cân bằng hệ vi sinh vật, ảnh

hưởng đến môi trường sinh thái, hiện tượng kháng thuốc gây phát sinh những dịch
bệnh khác nghiêm trọng hơn…Còn rất nhiều những mối nguy hại khơng thể kể hết.
Trong khi đó, việc áp dụng các tiến bộ trong công nghệ sinh học cũng như ứng dụng
cơng nghệ vi sinh cịn rất hạn chế, những lo ngại cũng như tâm lý khi sử dụng các
sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn rất lạ và mơ hồ với chính những người nơng dân.
Trong tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc các vi sinh vật bản địa có khả
năng ký sinh tuyến trùng gây hại là vấn đề đáng quan tâm và như mở ra cánh cửa

1


Đồ án tốt nghiệp

mới trong việc chủ động phòng trừ tác nhân gây bệnh, nhằm giảm thiệt hại và nâng
cao chất lượng và sản lượng cây trồng. Một trong những giải pháp hữu hiệu góp
phần đảm bảo an tồn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ
cân bằng hệ vi sinh vật và gìn giữ mơi trường. Nấm Purpureocillium lilacinum đã
được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng (Jatalas
và cs, 1979). Ngồi ra, chúng cịn có thể sống hoại sinh trong đất xung quanh vùng
rễ cây (Tigrano và cs, 1995). Do đó, năm 2014 Trung tâm Cơng nghệ sinh học đã
tiến hành xác định sự phân bố của nấm này ở vùng Đơng Nam Bộ, trong đó có
Vũng Tàu. Việc phân lập, xác định hoạt tính enzyme ngoại bào hay khả năng kí
sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu khác
nhau là rất cần thiết. Đó là lý do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hệ enzyme
ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng
nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu.”
2. Mục tiêu đề tài
 Khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các
chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P. lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị
bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh).

 So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng
Meloidogyne spp. của một số chủng nấm P. liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị
bệnh và khỏe mạnh.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả
năng kí sinh tuyến trùng của nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở vũng Tàu.
Ý nghĩa thực tiễn
Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm
P. lilacinum có hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase cũng như khả
năng kí sinh tuyến trùng mạnh trong đất trồng tiêu góp phần vào việc định hướng sử
dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ tuyến trùng hại tiêu trong tương lai.

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Sơ lƣợc về đặc điểm rễ cây hồ tiêu
Hệ thống rễ hồ tiêu thường gồm 3 -6 rễ cái và một chùm rễ phụ nằm dưới mặt
đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới
có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống đất khoảng 2,5m và giữ nhiệm vụ hút nước. Các rễ
cái cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. Đối với những cây trồng bằng giâm cành,
sau khi trồng ra ngoài nọc được 1 năm các rễ cái này có thể đâm sâu khoảng 2m.
Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc. Phân bố ở độ
sâu 15 – 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây.
Rễ bám mọc ra từ các đốt phần thân dây tiêu, giúp cho dây bám vào choái, vách
tường, …để vươn lên cao. Khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của rễ bám là rất
hạn chế và hầu như là không đáng kể.

Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, khơng chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ
cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng
thì phải thường xuyên có nhiều phương pháp cải tạo làm cho đất được tơi xốp và
tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần ngập úng trong nước từ 12 – 24 giờ thì bộ rễ tiêu sẽ bị
tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới thối rễ và dây tiêu sẽ bị chết.
Một số sâu bệnh phát triển trên cây tiêu
Trên rễ cây hồ tiêu thường xuất hiện một số bệnh:
Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu.
Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận
này tạo điều kiện cho nấm và tuyến trùng có hại xâm nhập và gây bệnh cho tiêu.
Rệp sáp giả (Pseudococidae) : gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu
trên mặt đất hoặc gốc tiêu, rễ tiêu trong lòng đất.
Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora, do tác động của tuyến
trùng, cơn trùng, chăm sóc, xới xáo, ngập úng… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm
nhập và gây hại. Bệnh gây hại trên tất cả bộ phận của cây.
Bệnh chết chậm: do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp.,
Pythium sp., … Các loại nấm này tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước,

3


Đồ án tốt nghiệp

cây giống… Cây bị bệnh sinh trưởng chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng. Hoa
quả rụng dần từ gốc đến ngọn. Các đốt cũng rụng dần, gốc thối, bó mạch thân cây
hóa nâu.
Bên cạnh đó bệnh tiêu cũng bị nhiều loài tuyến trùng gây hại, trong đó có hai
lồi gây hại nặng nề nhất là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục
hang Radopholus (Michel Luc, 2005). Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật
khơng xương sống, thích nghi với đời sống ký sinh trên thực vật. Nhóm tuyến trùng

này có một số đặc trưng quan trọng phân biệt rõ ràng với nhóm ký sinh trên động
vật và các nhóm sinh thái khác: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim
hút chuyển hóa để châm chích mơ thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước
trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực
tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt
quan trọng nhất (Nguyễn Bảo Vệ và ctv 2005).
1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật
Phân loại
Dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập qn sinh sống, đặc tính sinh vật học,
mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được
chia làm 4 bộ :
Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký
sinh ở các phần khác nhau của thực vật.
Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất
của cây như lá, hoa.
Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng
ngoại ký sinh thực vật, một số lồi có khả năng mang truyền virus.
Bộ Triplonchida: gồm các lồi của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là
nhóm ngoại thực vật, nhiều lồi có khả năng mang truyền virus.
Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đơng đảo nhất và có tầm quan
trọng nhất trên phạm vi tồn thế giới.

4


Đồ án tốt nghiệp

Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh trên tất cả các cơ quan của cây đang phát
triển hoa, lá, thân, rễ…trong đó rễ là nơi chịu ảnh hưởng nhiều nhất những tác động
của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000).

Hình thức ký sinh trên thực vật
Có thể chia thành 3 nhóm: Ngoại ký sinh, bán nội ký sinh và nội ký sinh di
chuyển. Ngoại ký sinh là tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong cơ thể thực vật
mà bám vào bên ngoài bề mặt rễ, chúng dùng kim hút để châm chích và hút dinh
dưỡng bên trong cây. Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào
trong rễ, còn phần sau tuyến trùng vẫn ở ngoài đất. Nội ký sinh: toàn bộ phần cơ thể
tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nội ký sinh di chuyển : tuyến trùng có khả năng di
chuyển trong mô thực vật, chúng di chuyển từ mô này đến mô khác để dinh dưỡng.
Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi
cố định (tạo nên các tế bào dinh dưỡng) chúng mất khả năng di chuyển và trở lên
phình to (béo phì).
Các kiểu ký sinh này khơng loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có
thể là nội ký sinh hay ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ. Ở tuyến trùng
sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang (Heterodera/ Globora), ấu trùng
tuổi 2 là giai đoạn xâm nhập vào rễ. Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu
hết tuyến trùng nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai đoạn đều có thể
dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ (Vũ Triệu Mẫn, 2007).
1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp.
Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp.
Tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký
sinh quan trọng nhất. Chúng gây hại hơn 3000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao
gồm hầu hết các cây trồng quan trọng: rau màu, đậu, ngũ cốc, cây ăn quả, thảo mộc
và nhiều cây cảnh thân gỗ khác (Malcolm & Charles, 2000).
Tuyến trùng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng cây trồng.
Theo thống kê có khoảng 80 lồi ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loại ký sinh
gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M.

5

Đồ án tốt nghiệp

halpha (Vũ Triệu Mân, 2007). Một số loài Meloidogyne gây hại khá phổ biến và
quan trọng đối với thực vật hiện nay:
 M. incognita là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác
nhau và phân bố trên vùng địa lý rộng trên phạm vi toàn thế giới. Đây cũng là loài
gây hại phổ biến trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng gây nhiều nhất trên : hồ
tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ cà, cây họ đậu…
 M. javanica là loài phổ biến thứ 2 sau M. incognita và có dải phân bố rộng
tương tự. Đây là lồi có khả năng chịu đựng qua mùa khơ hạn trong thời gian 3 – 6
tháng. Ở Việt Nam, loài này cũng ký sinh khá phổ biến trên các cây họ đậu, chuối…
 M. arenaria là loài phổ biến thứ 3 sau 2 loài trên, phân bố khắp thế giới. Đây
là loài gây hại phổ biến trên các cây họ đậu ở Việt Nam.
 M. graminicola ký sinh gây hại trên cây lúa ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt
đới là chủ yếu (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ…) Ở nước ta, loài này ký sinh trên
tương đối nhiều trên cây lúa ( giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước ) ở vùng đồng
bằng sông Cửu Long.
Tuyến trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là
tuyến trùng nội ký sinh rễ: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynedae, Bộ Tylenchida.
Vòng đời của tuyến trùng M. incognita
Vòng đời tuyến trùng M. incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính : trứng (ấu
trùng tuổi 1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm), ấu trùng tuổi 3, ấu trùng tuổi 4
và tuyến trùng trưởng thành. Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, các giai
đoạn khác hình thành và phát triển trong rễ cây. Trong chu kỳ vòng đời này ở tuyến
trùng Meloidogyne spp. thì giai đoạn ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng trưởng thành
giúp xác định loài (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993)
Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp.
Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, giữa và đi. Phần đầu cịn được gọi là
vùng mơi. Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhơ lên, hai
đầu hơi nhọn hoặc hình trịn dẹt. Phần thân ở giữa chứa ruột giữa và cơ quan sinh

6


Đồ án tốt nghiệp

dục. Phần đi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu
gai hoặc khơng.
Con cái trưởng thành hình cầu, nằm sâu trong mơ rễ. Đường kính cơ thể 0,5–
0,7 mm với cổ cân đối. Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Lớp vỏ cutin
tương đối bền và có thể co giãn được. Vỏ cutin về cơ bản được chia thành 3 lớp :
epidocutin, exocutin và endocutin (Bird, 1984). Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các
cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa. Ngồi ra năm 1986, Reddigari cũng đã tách được
thành phần protein collagen từ 3 lớp của vỏ cutin của M. incognita với một lượng
khác nhau ở mỗi lớp. Trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, hệ sinh dục, hệ bài
tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Phía trong
gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma. Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà
thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mơ. Nó được tạo áp
lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên. Áp
lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng
vận động được. Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ
sinh sản. Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là
cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học
(Nguyễn Ngọc Châu, 2003).
Trứng được con cái đẻ ra bên ngoài cơ thể vào khối gelatin nằm trên bề mặt
của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng nằm bên trong nốt sần. Có hình bầu
dục dài hay hình quả thận, cũng có loại trứng hình trịn và tương đối lớn. Vỏ trứng
là phần cứng bên ngoài của trứng tuyến trùng, giúp bảo vệ khỏi các tác nhân hóa
học và vi sinh vật tấn cơng. Lớp vỏ trứng có thể có từ 1 – 5 lớp tùy thuộc vào từng
loài tuyến trùng. Các cấu trúc phổ biến nhất có lớp nội lipid, một lớp chitin ở giữa

(thành phần chính) và một lớp vitelline ngồi (Bird và McClure, 1976).. Lớp bên
ngoài bao gồm các vitellin protein. Lớp rào cản đầu tiên bên ngoài giúp ngăn cản sự
xâm nhập của nấm lên trứng. Trong Bộ Tylenchida, tuyến trùng M. javanica, lớp
vitelline là rất mỏng (10-40 nm) và chứa lipoprotein. Vỏ trứng của tuyến trùng sần
rễ M. hapla có hơn 40% protein (Wharton, 1980). Dày 400 nm là lớp chitin lớn

7


Đồ án tốt nghiệp

được kết hợp với protein để tạo thành một phức tạp chitin-protein. Vỏ trứng M.
javanica chứa 50% protein và 30% chitin (Bird và Bird, 1991). Vai trò chính của
lớp chitin có thể đảm bảo độ bền cấu trúc vỏ trứng và để bảo vệ lớp lipid. Các lớp
lipid bao gồm một loạt các màng lipoprotein (Wharton, 1980) và dày nhất ở các
đầu (0.02- 0.04 µm). Các lớp lipid chịu trách nhiệm chống thấm của một số vỏ
trứng, và nó bảo vệ trứng hạn chế chất độc hại (Wharton, 1980). Nếu các lớp chitin
được loại bỏ, lớp lipid là dễ dàng bị hư hỏng …(Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ
Thanh, 2000)

Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp..
Đặc điểm gây hại
Quan sát mô học chỉ ra rằng sự xâm nhập của ấu trùng tuổi 2 xuất hiện nhiều
nhất tại vùng mô phân sinh rễ. Tuyến trùng ở đất xâm nhập vào rễ tiêu ở giai đoạn
ấu trùng cảm nhiễm IJ2. Sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng khu trú tại một chỗ
và dùng kim hút chọc thủng tế bào mô trụ của rễ, tiết men tiêu hóa vào mơ để thực
hiện dinh dưỡng. Tại đây, tuyến trùng nhanh chóng phát triển qua các giai đoạn để
phát triển thành tuyến trùng trưởng thành (tuyến trùng đực dạng chỉ dài, tuyến trùng
cái hình quả lê). Dưới tác dụng của men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra, các tế bào
xung quanh tuyến trùng phát triển bất thường, tạo thành các tế bào khổng lồ có

nhiều nhân. Rễ phình to ra tạo thành u hay nốt sần, hệ rễ bị biến dạng. Những nốt

8


Đồ án tốt nghiệp

sần này có thể nhỏ, riêng biệt hay to và xếp thành chuỗi, phụ thuộc vào mức độ
nhiễm của cây ký chủ ( Nguyễn Ngọc Châu và ctv.,1990).
Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp.
Trên thực tế, chỉ có thể phát hiện tình trạng của bệnh khi cây bắt đầu xuất hiện
các triệu chứng bộ lá bắt đầu suy giảm nên việc khống chế và phòng trừ sẽ rơi vào
tình trạng bị động và gặp rất nhiều khó khăn, kém hiệu quả dẫn đến cây chết, dịch
bệnh lây lan trên diện rộng. Vì vậy, để phịng trừ có hiệu quả cần có các biện pháp
phịng trừ tích cực, hiệu quả, chủ động. Một số biện pháp phòng trừ: biện pháp chọn
giống, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học, biện pháp sinh học.
Có 2 dạng phịng trừ sinh học:
 Phòng trừ sinh học nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để
đưa ra đồng ruộng.
 Phòng trừ sinh học tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong
tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng.
Hiện tại biện pháp phòng trừ sinh học vẫn chưa thể thay thế biện pháp hóa học
do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học cịn cao và khơng đáp ứng đầy
đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, phòng trừ sinh học rất phù hợp trong hệ thống quản
lý tuyến trùng. Trong đó, việc nghiên cứu, tìm tịi về khả năng đối kháng, ký sinh là
những bước tiến quan trọng đang được quan tâm và phát triển.
1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum
1.3.1 Hệ thống phân loại
Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi này chỉ
có một đại diện duy nhất là Purpureocillium lilacinum (hay còn được biết đến với

tên phổ biến Peacilomyces lilacinus). Nấm sợi Purpureocillium lilacinum là loài
hoại sinh khá phổ biến và đang được chú trọng vì có tiềm năng trong việc kiểm soát
mật độ của tuyến trùng gây hại trên cây trồng. Phân loại theo Jennifer và cs năm
2011 như sau:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota

9


Đồ án tốt nghiệp

Lớp: Sordariomycetes
Bộ: Hypocreales
Họ: Ophiocordycipitaceae
Chi: Purpureocillium
Loài: Pupureocillium lilacinum
Loài Purpureocillium lilacinum được miêu tả đầu tiên bởi nghiên cứu của
Charles Thomas vào năm 1910, dưới tên Penicillium lilacinum. Một số tên gọi khác
của nó Penicillium amethystinum (Wehmer,1923), Spicaria rubidopurpurea (Aoki,
1941). Năm 1974, Samon đổi tên thành Paecilomyces. Những công bố trong thập
niên 20 chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là đơn ngành (Inglis và Tigano,
2006). Nấm này đã từng được phân loại thuộc nhóm nấm bất tồn (Deuteromycetes).
Người ta đã phân lập được nhiều chủng nấm này từ khắp nơi trên thế giới và nó
được chấp nhận như biến thể của chi Paecilomyces. Paecilomyces có mối quan hệ
gần với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola
(Sung và ctv, 2007).
Loài nấm Paecilimyces lilacinus được nghiên cứu nhiều nhất trong việc phòng
trừ tuyến trùng. Năm 2011, Jennifer và cs đã đổi tên Paecilomyces lilacinus thành
Purpureocillium lilacinum và sử dụng cho tới hiện tại. Những kết quả khi phân tích

quan hệ phát sinh loài của các chủng Purpureocillium lilacinum chỉ ra rằng nó có
liên quan chặt chẽ với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài ký sinh
thuộc chi Paecilomyces, họ Hypocreales (Inglis và Tigano, 2006).
1.3.2 Phân bố
P. lilacinum đã được phân lập từ các môi trường sống bao gồm đất (canh tác
và không canh tác, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sơng), nước thải và cơn
trùng, tuyến trùng. P. lilacinum cũng đã được tìm thấy trong trứng và con cái của
tuyến trùng sần rễ và tuyến trùng bào nang. Ngồi ra, P. lilacinum cũng được tìm
thấy trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995).

10


Đồ án tốt nghiệp

1.3.3 Đặc điểm hình thái
Hình thái đại thể
Bào tử nấm P. lilacinum nảy mầm khi độ ẩm và chất dinh dưỡng đầy đủ.
Khuẩn lạc trên môi trường thạch PDA tăng trưởng khá nhanh, đường kính đạt 5-7
cm trong vịng 14 ngày ở 280C ± 20C, có bề mặt dạng len hoặc xốp bơng, ban đầu
có màu trắng nhưng khi bắt đầu phát sinh bào tử chuyển thành màu tím, hoặc màu
nâu khi đưa lên ánh sáng. Một số trường hợp, bào tử không màu nhưng đa số là màu
tím (Samson, 1975).

Hình1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên mơi trường PDA
sau 15 ngày ni cấy ở 250C (bau.
ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm).
Hình thái vi thể
Các sợi nấm sinh dưỡng có thành trơn láng trong suốt và rộng khoảng 2,5 - 4,0
µm (Samson, 1974). Cuống bào tử đính phát sinh từ các sợi nấm cơ chất và sợi nấm

dinh dưỡng, dài khoảng 400 - 600 µm. Cuống bào tử phình ra ở phía gốc và thon
gọn ở phía ngọn gọi là thể bình. Bào tử đính phát sinh từ thể bình có dạng hình trịn
hay bầu dục, ban đầu có vách trơn láng, sau đó trở nên hơi gồ ghề (Samson, 1974).

11


Đồ án tốt nghiệp

Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm
P. lilacinum khi chụp từ kính hiển vi huỳnh quang
độ phóng đại 460X ( />1.3.4 Đặc điểm sinh hóa
Có rất nhiều nghiên cứu về enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum, đặc biệt
là enzyme protease. Enzyme này có khả năng phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng
Meloidogyne hapla (Bonants và cs, 1995). Ngoài ra enzyme ngoại bào chitinase
được tiết ra từ P. lilacinum cũng góp phần vào việc thủy phân thành phần của vỏ
trứng tuyến trùng (Khan và cs, 2004).
Các độc tố của nấm cũng được nghiên cứu, đáng chú ý là Peacilotoxin. Tuy
nhiên việc tiết độc tố cũng tùy thuộc vào nguồn gốc phân lập của chủng nấm (Khan
và cs, 2003; Park và cs, 2004). Năm 2003, Khan và cs đã thử nghiệm một chủng P.
lilacinum để sản xuất Paecilotoxin và chủng này không hề sinh độc tố.
Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào
Enzyme protease
Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit
ngắn và cuối cùng tạo các acid amin và NH3. Protease cần thiết cho các sinh vật
sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus)
đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật
và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ
protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

12


Đồ án tốt nghiệp

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể
đồng nhất (Võ Thị Bích Vân, 2010)
Phân loại protease: Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3
(E.C.3.4). Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của
chúng cũng như cấu tạo của tâm hoạt động của enzyme. Protease được phân chia
thành hai loại: endopeptidase (E.C.3.4.11-17) và exopeptidase(E.C.3.4.21-99). Dựa
vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin
protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt
động và có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các
serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu
cơ chất tương đối rộng. Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong
trung tâm hoạt động. Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính,
có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc
nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo protease: Metallo
protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi cũng như các vi sinh
vật bậc cao hơn. Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính.
Cơ chế hoạt động của protease: Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn
nhất. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân
thơng qua hai bước chính (Barrett, 1994): Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết
cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử C trong nhóm cacboxyl của
phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Bước 2, khử acyl
hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O theo chiều ngược lại của
bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho
nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Võ Thị Bích Vân, 2010).

P. lilacinum có khả năng tiết ra serine protease. Năm 2004, Khan đã chứng
minh rằng serine protease được tiết ra bởi chủng nấm P. lilacinum 251 làm ngừng
sự phát triển của trứng M. javanica và làm giảm sự nở của ấu trùng hay có thể giết
chết một lượng lớn ấu trùng tuổi 2 đã nở. Đồng thời nghiên cứu này còn chỉ ra rằng

13


Đồ án tốt nghiệp

enzyme này kết hợp với enzyme chitinase có thể gây tổn thương đến phơi trứng
tuyến trùng và làm thay đổi cấu trúc vỏ trứng do lớp vitelline bị tan ra và thay đổi
tính thấm ảnh hưởng đến lớp lipid trong cùng gây ra những thay đổi như trứng bị
phồng lên.
Chitinase
Chitinase [Poly-Beta-1-4- (2-acetalmido-2-deoxy) -D-glucoside glucanohydrolase]
thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose
hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai
phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin.
Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14.
3 → Hydrolase
2 → Glycosylase
1

→ Glycosidase

14 → Chitinase
Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ. Họ
Glycohydrolase 18 là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, họ này bao gồm chủ yếu là
enzyme chitinase, ngoài ra cịn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase

và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có
cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thơng qua một cơ chế
kiểm sốt mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer.
Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như
Aeromonas

hydrophila,

Bacillus

circularis,

Trichoderma

harzianum,

Aphanocladium album, Serratia marcescens…Họ Glycohydrolase 19 gồm hơn 130
chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngồi ra cịn có ở xạ khuẩn Streptomyces
griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae…Chúng có cấu trúc hình cầu với một
vịng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 19
bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV. Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-Nacetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người.

14


Đồ án tốt nghiệp

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-f-chitobiosidase,
N-acetyl-f-D-glucosaminidase

(exochitinase)

và

chitobiase.

Endochitinase,

chitobiosidase và β–N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch
huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin
thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp
cho

endochitinase

hơn

là

chitobiosidase

và

f-N-acetylhexosaminidase.

Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại
enzyme trên nhưng f-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc
làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của f-Nacetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase.
Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase,
chitobiosidase và f-N- acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là

N-acetyl glucosamine (Đinh Minh Hiệp, 2007).
Theo đó, P. lilacinum làm thay đổi phần nhiều cấu trúc của vỏ trứng dưới sự
tác động của chitinase tạo không gian cho nấm trong suốt quá trình xâm nhập
(Morgan-Jones và ctv, 1984). Đồng thời tiết ra enzyme chitinase làm mỏng đi lớp
chitin của vỏ tuyến trùng và gây chia tách với lớp lipd trong cùng.
Như vậy, việc sản sinh enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum cũng có ý
nghĩa và vai trị quan trọng trong việc phá hủy vỏ trứng tuyến trùng với 3 lớp bảo
vệ cơ bản: protein, chitin và lipid và lớp biểu bì cutin bên ngồi của con cái cùng
các lỗ mở tự tiên trên cơ thể chúng là những nơi dễ bị xâm nhiễm. Nơi đầu tiên để
nấm xâm nhập và là cơ sở để kiểm soát sinh học. Protease, chitinase, và lysozyme là
các enzyme thường được tổng hợp và tiết ra bởi nấm làm bào mòn vỏ trứng và lớp
biểu bì con cái tuyến trùng (Bonants và ctv, 1995; Dackman và ctv, 1989; Gupta và
ctv, 1993).
1.3.5 Các yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của P. liacinum
Nhiệt độ
Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển của nấm sợi là từ 20C đến 50C, tối ưu
từ 220C đến 270C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến

15


Đồ án tốt nghiệp

40oC, cá biệt có một số lồi có thể sống sót ở 00C và ở 600C (Trần Thị Nhã Uyên,
2010). Nấm P. lilacinum có thể tăng trưởng được trong một khoảng nhiệt độ khá
rộng, từ 8- 38°C (46 đến 100°F), nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển khoảng 26-30°C
(79-86°F) .
pH
Nói chung, nấm sợi có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH=6) nhưng pH
tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9

(Ingold, 1967). Theo đó, lồi P .lilacinus này cũng thích nghi với khoảng pH khá
rộng 4 – 8 (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) và có thể tăng trưởng được trên mơi trường
có sự thay đổi nhiều cơ chất (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995).
Nguồn dinh dưỡng
Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho
nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và
Ca. Nếu các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vơ cơ đơn giản thì sẽ
được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh
và tiết ra bên ngồi các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này
thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Trần Thị Nhã Uyên, 2010).
Ảnh hưởng của nguồn C: Nguồn C có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật và
là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp. Nấm sợi có khả
năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ,
lipit…Nhiều loại nấm sợi cịn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc
chất độc đối với nhiều sinh vật khác. Các loài nấm sợi thường khơng có những địi
hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon. Tuy nhiên, có thể là loại hợp chất này
đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác.
Ảnh hưởng của nguồn N: Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến q trình sinh
trưởng. Có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ. Các nguồn N hữu cơ thường
dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men… Dễ tiêu nhất là nguồn N từ
casein.(Trần Thị Nhã Uyên, 2010). P. lilacinum rất dễ thích nghi với điều kiện sống,
tùy thuộc vào sự sẵn có của các chất dinh dưỡng trong môi trường xung quanh.

16