báo cáo thực tậpbáo cáo thực tập công nghệ sinh học dược

BÀI 1. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có
đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và ni cấy
bảo quản chúng trong mơi trường thích hợp.
Cơng việc này bao gồm các bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dịng vi
sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống.
– Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, có thể dựa vào:
 Chất chuyển hoá tạo ra: tạo kháng sinh, tiết sắc tố, …
 Enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase – tinh bột,
protease – gelatin, …
 Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật.


Sự thay đổi hình thái của vi sinh vật.

– Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống trên thạch, giữ giống dưới lớp dầu khống, giữ
giống trong cát, đơng lạnh, đông khô. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh
vật thường dựa vào kinh nghiệm.
– Trong bài thực hành này, ta tiến hành:


Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại
bào.
Môi trường phân lập: thạch tinh bột.
Thuốc thử: Lugol (dung dịch iod).
Vi sinh vật có sinh amylase sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (tinh bột bị phân giải
thành glucose, nên không tạo màu với iod thuốc thử).



Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại
bào.
Môi trường phân lập: thạch gelatin
Thuốc thử: TCA (acid trichloroacetic).
Vi sinh vật có sinh protease sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (gelatin bị phân giải
nên không tạo tủa với TCA).



Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của
nó với vi sinh vật khác.
Có 2 phương pháp: vạch thẳng vng góc và khuếch tán.
Chủng thử nghiệm sử dụng: S. aureus, E. coli.

1


II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào
Bảng 1. Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase
Đường kính
khóm (mm)

Đường kính
vịng phân giải
(mm)

Tỷ lệ

Chủng 1
Khóm trắng đục, bìa gợn

13

14

1,07

Chủng 2
Khóm trắng, nhỏ, có tâm

8

10

1,25

Nhận xét
Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở
o
37 C trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào.
2. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào
Bảng 2. Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease
Đường kính
khóm (mm)

Đường kính
vịng phân giải
(mm)

Tỷ lệ

Chủng 1
Khóm trắng đục, bìa gợn

8

11

1,38

Chủng 2
Khóm trắng, có tâm

6

9

1,5

Nhận xét
o

Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37 C
trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào.

2

3. Phân lập và phát hiện vi sinh vật chủng có khả năng tiết kháng sinh
a. Phương pháp vạch thẳng vng góc
Bảng 3. Kết quả của phương pháp vạch thẳng vng góc
Đĩa

Khoảng cách từ chủng kiểm tra
đến chủng thử nghiệm

Kết quả
S. aureus

+

E. coli

–

S. aureus

+

E. coli

–

B3

B4

11 mm

7 mm

Nhận xét
Chủng cần kiểm tra có khả năng ức chế sự phát triển của S. aureus, không ức chế sự phát
triển của E. coli.
b. Phương pháp khuếch tán
Bảng 3. Kết quả của phương pháp khuếch tán
Đĩa

B1

B2

B3

B4

S. aureus

–

–

16 mm

–

E. coli

–

–

–

–

Nhận xét
Chủng vi khuẩn thử nghiệm ở lỗ B3 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của
S. aureus.

3


BÀI 3. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI
CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC

I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Probiotic là vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức
khoẻ vật chủ.
– Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật làm probiotic bao gồm:
 Tính an tồn: khơng gây bệnh, gây độc, …
 Tính đề kháng kháng sinh: có mang gene đề kháng hay khơng, nếu có thì có khả
năng lây nhiễm sang vi sinh vật khác khơng.
 Chức năng: có chức năng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, chống tiêu chảy, …
 Các yêu cầu công nghệ: sản xuất qui mơ lớn, tính ổn định trong bảo quản, …
 Khả năng sống sót khi đến đường tiêu hố: chịu được dịch vị, muối mật.
– Ở bài thực hành này, ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào sinh
dưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị nhân tạo (ở các pH

1, 3) và dịch mật nhân tạo (ở nồng độ muối mật 0,3%, 0,5%).

II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo
Tế bào sinh dưỡng
pH
Thời gian (phút)

Đối chứng

pH 1

pH 3

0

120.104

60

300.104

0

100.104

90

20.104

0

0

4


Bào tử
pH
Thời gian (phút)

Đối chứng

pH 1

pH 3

0

100.104

60

99.104

40.104

85.104

90

75.104

20.104

60.104

Nhận xét
– Tại cùng giá trị pH và thời gian, số lượng bào tử sống sót nhiều hơn số lượng tế bào sinh
dưỡng tương ứng.
– Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và bào tử
càng giảm đi.
Trong đó, số lượng tế bào sinh dưỡng giảm rất nhanh, cịn bào tử giảm ít hơn.
– Tế bào sinh dưỡng không mọc được ở pH 1 và mọc ít ở pH 3.
Bào tử ở pH 1 vẫn mọc được nhưng nhỏ hơn pH 3.
Giải thích
– Bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những điều kiện khắc nghiệt của mơi
trường. Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, và giảm ít hơn so với tế bào sinh dưỡng.
2. Đánh giá khả năng chịu muối mật
Tế bào sinh dưỡng
Nồng độ muối mật (%)
Thời gian (giờ)

Đối chứng

0,3

0,5

0

124.104

1

60.104

0

0

2

51.104

0

0

5


Bào tử
Nồng độ muối mật (%)
Thời gian (giờ)

Đối chứng

0,3

0,5

0

126.104

1

114,5.104

57,5.104

47,5.104

2

95.104

68.104

61,5.104

Nhận xét
– Thời gian tiếp xúc với dịch mật càng lâu, số lượng số bào tử càng tăng, tế bào sinh
dưỡng không cịn.
– Theo thời gian, số bào tử giảm khơng đáng kể.
– Số bào tử ở nồng độ muối mật 0,3% mọc nhiều hơn so với nồng độ muối mật 0,5%.
Giải thích
– Bào tử vi khuẩn có thể chịu được dịch mật. Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, giảm khơng
đáng kể khi tăng thời gian tiếp xúc và nồng độ muối mật.

– Tế bào sinh dưỡng không mọc được trong dịch mật, đây có thể là sai sót trong quá trình
pha lỗng hoặc cấy lên đĩa thạch.

6


BÀI 4. TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINATE

I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Amylase là enzyme thuỷ phân tinh bột, có ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật.
– Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, y dược
…
Trong ngành dược, amylase được sử dụng để sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền,
chuyển hoá tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược của một số thuốc.
– Tinh chế amylase là một khâu quan trọng trong sản xuất. Có nhiều phương pháp tinh
chế. Trong bài này, việc tinh chế amylase được thực hiện bằng gel alginate.
– Phương pháp tinh chế này thực chất là phương pháp cố định enzyme, theo cơ chế hấp
phụ. Amylase “nhầm tưởng” alginate là cơ chất nên bám lên bề mặt các hạt gel, từ đây
có thể lọc lấy amylase dễ dàng.
– Xác định hoạt độ của amylase được thực hiện theo phương pháp Heinkel.
Hoạt độ của amylase được tính bằng lượng tinh bột bị phân giải dựa trên mức giảm
cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod.
o

Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 15 phút ở 30 C

II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Xác định hàm lượng protein
Cơng thức tính tốn
A280 = V x n x OD280

Trong đó,

A280: tổng lượng protein (mg)
V: thể tích thu được (ml)
n: độ pha loãng (lần)
OD280: mật độ quang của mẫu đo tại bước sóng 280 nm
Bảng 1. Hàm lượng protein
Thể tích thu được

Độ pha lỗng

OD280

A280

Dịch thơ

10

20

0,837

167,4

Enzyme sau tinh chế

25

1

0,664

16,6

7


2. Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
Cơng thức tính tốn
U/ml là số mg tinh bột do 1 ml amylase phân giải trong 15 phút.
Trong bài này, ta sử dụng 0,1 ml amylase, nên:
U/ml = Lượng tinh bột (mg) x 10
Bảng 2. Tương quan giữa lượng tinh bột và giá trị ΔOD560
Ống

0

1

2

3

4

5

Tinh bột (mg)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

ΔOD560

0

0,145

0,369

0,549

0,756

0,943

U/ml

0

2

4

6

8

10

Vẽ đường chuẩn
∆OD560

y = 0.9611x - 0.0202
R² = 0.998

0.900
0.750
0.600
0.450
0.300
0.150
0.000
0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Lượng tinh bột phân giải (mg)

Đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
3. Thơng số qui trình tinh chế
Cơng thức tính tốn


OD = OD chuẩn – OD thử



Lượng tinh bột (mg) phân giải tính theo đường chuẩn y = 0,9611x – 0,0202

8


Bảng 3. Kết quả đo của enzyme thô và sau tinh chế
Enzyme thô

Enzyme sau tinh chế

OD chuẩn

0,973

0,926

OD thử

0,651

0,338

OD

0,322

0,588

Lượng tinh bột
phân giải (mg)

0,356

0,633

U/ml

3,561

6,328

Cơng thức tính tốn


Tổng hoạt tính = A x V x n
Trong đó,

A: hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch (U/ml)
V: thể tích thu được (ml)
n: độ pha lỗng (lần)



Hoạt tính chun biệt =



Hiệu suất =



Tổng hoạt tính
Tổng protein A280

Tổng hoạt tính U của enzyme thơ
Tổng hoạt tính U của enzyme sau tinh chế

Mức tinh chế =

Hoạt tính chun biệt của enzyme thơ
Hoạt tính chun biệt của enzyme sau tinh chế

Bảng 4. Các thơng số của qui trình tinh chế enzyme
Thơng số

Dịch thơ

Enzyme sau tinh chế

Thể tích

10

25

Độ pha lỗng

400

20

Tổng protein A280

167,4

16,6

Tổng hoạt tính U

14242

3164

Hoạt tính chun biệt

85,08

190,60

Hiệu suất

22,22%

Mức tinh chế

2,24 lần

9


Nhận xét
– Sau q trình tinh chế, hoạt tính chun biệt của amylase tăng lên.
– Hiệu suất tinh chế còn thấp, lượng amylase bị thất thốt trong q trình tinh chế.
Có thể là do thao tác chưa chính xác, cẩn thận trong bước thôi enzyme (amylase thôi
chưa hết), lọc lấy dịch (amylase cịn sót trong tủa gel), … cũng như trong q trình đo
quang. Ngồi ra cần khảo sát thời gian tối ưu của quá trình ủ.
– Để đánh giá hiệu quả của q trình tinh chế, có thể dựa vào mức tinh chế amylase. Theo
lý thuyết, mức tinh chế trên 1 là đạt yêu cầu (tốt nhất là trên 4).
Mức tinh chế trong bài là 2,24 lần, đạt yêu cầu nhưng cịn thấp. Có thể là do trong q
trình tinh chế chưa cẩn thận đã làm giảm hoạt tính của amylase.
4. Câu hỏi
Sơ đồ tinh chế amylase bằng alginate:
Nghiền khoai lang với
đệm phosphate 1 : 1

Lọc
10 ml Dịch thô
Na-alginate 2%
(đệm CH3COONa 2M pH 4,8)
tỉ lệ 1:3 ủ 1h
Phức Enzyme–Alginate–Na
20 ml CaCl2 0,7M
Tủa Enzyme–Alginate–Ca
Glucose 2% để lạnh 12h
Lọc lấy dịch

Tủa Enzyme–Alginate–Ca

Dịch enzyme tinh

10


BÀI 5. CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINATE

I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzyme duy nhất chuyển hoá
tinh bột và các chất tương tự thành các cyclodextrin có mức polymer hố 6, 7 và 8 đơn
vị glucose (tương ứng α–CD, β–CD và γ–CD).
– Việc cố định sẽ giúp tái sử dụng CGTase đắt tiền, đồng thời tăng cường tính ổn định và
hoạt tính enzyme.
– Dựa vào bản chất liên kết giữa chất mang và enzyme, cố định enzyme bao gồm các
phương pháp:


Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, …



Liên kết cộng hoá trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo phức hợp
enzyme – chất mang có liên kết cộng hoá trị.



Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ chất
và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường.



Tạo vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200 A (như
cellulose, polysaccharid).

o

– Trong bài thực hành này, enzyme được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ.
Nguyên tắc là cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám trên
bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel.
Đệm Tris–HCl pH = 8 để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu. Tránh
dùng đệm phosphate vì gel alginate khơng bền.
Bảng 1. Các điểm khác biệt giữa phương pháp hấp phụ và bắt giữ enzyme
Hấp phụ

Bắt giữ

Tạo gel Ca–alginate trước, sau đó Gel Ca–alginate được tạo cùng lúc

mới cho enzyme vào hấp phụ
bắt giữ enzyme
Thời gian ủ lâu (45 phút)

Thời gian ủ nhanh (10 phút)

11


II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định
a. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein
Bảng 2. Tương quan giữa nồng độ BSA và ΔOD595
Ống nghiệm

0

1

2

3

4

5

Nồng độ BSA
(μg/ml)

0

10

20

30

40

50

ΔOD595

0

0,190

0,312

0,455

0,568

0,681

Vẽ đường chuẩn
∆OD595
0.750

y = 0.0134x + 0.0332
R² = 0.9917

0.600

0.450

0.300

0.150

0.000
0

10

20

30

40

50

60

Nồng độ BSA (μg/ml)

Đường chuẩn xác định nồng độ protein
b. Tính hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase

Cơng thức tính tốn


Nồng độ protein mẫu đo tính theo đường chuẩn y = 0,0134x – 0,0332



Hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase tính theo công thức:
mban đầu =

Cxnx2
1000

12


Trong đó,

mban đầu: hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase (mg)
C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml)
n: độ pha loãng (lần)
Bảng 3. Kết quả đo protein trong chế phẩm CGTase
Phương pháp

Hấp phụ

Bắt giữ

ΔOD595 nm

0,405

0,220

Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml)

27,746

13,940

20

20

1,110

0,558

Độ pha lỗng (lần)
Hàm lượng protein (mg)
c. Tính hàm lượng protein cố định
Cơng thức tính tốn


Hàm lượng protein khơng cố định được tính theo cơng thức:
CxV
mkhơng cố định =
1000
Trong đó,

mcố định: hàm lượng protein cố định (mg)
C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml)
V: thể tích dịch gộp (ml)



Hàm lượng protein khơng cố định được tính theo cơng thức:
mcố định = mban đầu – mkhông cố định



Hiệu suất cố định (%) =

mcố định
mban đầu

x

100

Bảng 4. Kết quả hàm lượng protein cố định
Phương pháp

Hấp phụ

Bắt giữ

ΔOD595

0,165

0,080

Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml)

9,836

3,493

40

45

Hàm lượng protein không cố định (mg)

0,393

0,157

Hàm lượng protein cố định (mg)

0,717

0,401

64,60%

71,86%

Thể tích dịch gộp (dịch lọc + dịch rửa) (ml)

Hiệu suất cố định
13


Nhận xét
Hiệu suất cố định bằng phương pháp bắt giữ cao hơn so với phương pháp hấp phụ.
Có thể giải thích rằng, phương pháp bắt giữ là phương pháp cố định không thuận nghịch,
CGTase bị nhốt trong hạt gel không thốt ra được.
Cịn phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định thuận nghịch, CGTase chỉ bám lên bề
mặt hạt gel.
2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và hoạt tính enzyme cố định
a. Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin
Bảng 5. Tương quan giữa nồng độ cyclodextrin và ΔOD550
Số thứ tự

0

1

2

3

4

5

Nồng độ CD
(mg/ml)

0

10

20

30

40

50

1,940

1,719

1,514

1,338

1,215

1,054

0

0,221

0,426

0,602

0,725

0,886

OD550
ΔOD550
Vẽ đường chuẩn
∆OD550

y = 0.0874x + 0.0397
R² = 0.9901

0.800

0.600

0.400

0.200

0.000
0

2

4

6

8

Nồng độ CD (mg/ml)

Đường chuẩn xác định hoạt tính CGTase

14

10


b. Xác định hoạt tính của CGTase
Cơng thức tính tốn


Hoạt tính CGTase trong 1 ml được tính theo cơng thức:
A=
Trong đó,

CD x 10 x n
Mxt

A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml)
CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml)
n = 40: độ pha lỗng (lần)
M = 1135: khối lượng phân tử cyclodextrin
t = 15 phút: thời gian phản ứng
10: tỷ lệ enzyme phản ứng (có 0,1 ml enzyme tham gia phản ứng)



Tổng hoạt tính CGTase ban đầu = A x 2
Giá trị 2 là số ml CGTase ban đầu được dùng



Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu (U/mg) =

Tổng hoạt tính CGTase ban đầu
Hàm lượng protein ban đầu

Bảng 6. Kết quả đo hoạt tính enzyme ban đầu
Phương pháp cố định

Hấp phụ

Bắt giữ

1,073

0,695

Hoạt tính của CGTase
trong 1 ml (U/ml)

277,772

264,237

Tổng hoạt tính (U)

555,544

528,474

Hoạt tính riêng của CGTase
(U/mg protein)

500,489

947,084

ΔOD550

c. Xác định hoạt tính enzyme sau cố định
Cơng thức tính tốn


Hoạt tính CGTase sau cố định trong 1 ml được tính theo cơng thức:
A=

CD x 10 x n
Mxtxm

15


Trong đó, A: hoạt tính CGTase cố định trong 1 ml dung dịch (U/ml)

CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml)
n = 1: độ pha lỗng (lần)
M = 1135: khối lượng phân tử cyclodextrin
t = 15 phút: thời gian phản ứng
m = 0,6 g: khối lượng 20 hạt gel được sử dụng
Tổng lượng enzyme cố định trong gel là 10 g


Tổng hoạt tính CGTase sau khi cố định = A x V
Trong đó, A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml)
V: thể tích dịch gộp (ml)



Hoạt tính riêng của CGTase sau cố định (U/mg) =



Tỉ lệ hoạt tính (%) =

Tổng hoạt tính CGTase sau cố định
Hàm lượng protein cố định

Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu
Hoạt tính riêng của CGTase sau cố định

x

100

Bảng 7. Kết quả đo hoạt tính enzyme sau cố định
Hấp phụ

Bắt giữ

0,566

0,593

Tổng hoạt tính (U)

141,480

223,107

Hoạt tính riêng (U/mg)

197,322

556,377

Tỉ lệ hoạt tính (%)

39,43%

58,75%

ΔOD550

Nhận xét

Hoạt tính của enzyme cố định giảm nhiều so với enzyme tự do ban đầu.
Vì cố định enzyme ít nhiều làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme cũng như cản trở
không gian tiếp xúc giữa cơ chất – enzyme, dẫn đến hoạt tính enzyme sau cố định thường
giảm đi.

16


3. Câu hỏi

Nhỏ từ từ 15 ml alginate 2% vào 30 ml CaCl2

Hạt gel Ca–Alginate

20 ml đệm Tris–HCl pH8 + Hạt gel
1. Thêm 2 ml CGTase
2. Cố định 45 phút
3. Lọc
Enzym
cố đinh

Dịch lọc

Rửa 2 lần với
đệm Tris–HCl

Gộp dịch
Xác định hàm lượng
enzyme không cố định

Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp hấp phụ

17


2 ml enzyme + 15 ml dung dịch alginate
2%

Phức hợp Enzyme–Alginate
Nhỏ giọt từ từ 30ml CaCl2 0,2M
Phức hợp Enzyme–Alginate–Ca

Hạt gel
Rửa 2 lần với
đệm Tris–HCl
Dịch rửa

Dịch lọc

Gộp dịch
Xác định hàm
lượng enzyme
không cố định

Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp bắt giữ

18


BÀI 10. TINH CHẾ LYSOZYME

BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION

I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp được sử dụng phổ biến để tinh chế protein.
Đây là phương pháp tách các chất tan dựa vào lực hút tĩnh điện trái dấu giữa các phân
tử chất tan với các nhóm mang điện tích trên nhựa trao đổi ion.
– Nhựa trao đổi ion được chia làm 2 loại: nhựa cationit và nhựa anionit.
Nhóm mang điện tích trên nhựa mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào mức biến động của sự ion
hố theo pH, chứ khơng phải là độ mạnh của liên kết.
Nhựa trao đổi mạnh có khả năng hoạt động trong dải pH rộng hơn, bị ảnh hưởng bởi
pH môi trường.
– Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion dựa trên cơ sở điểm đẳng điện pI. Nó là giá trị
pH mà protein có tổng điện tích bằng 0. Như vậy:
 Khi pH > pI, protein sẽ tích điện âm
 Khi pH < pI, protein sẽ tích điện dương
Protein tích điện (–)

Protein tích điện (+)
0

14

pI

– Lysozyme có pI = 10, cịn các protein khác trong lịng trắng trứng có pI ≤ 6.
Do đó, ta sử dụng nhựa cationit tại pH = 8 thì lysozyme tích điện dương và bị giữ lại
trên cột sắc ký, các protein khác tích điện âm và đi ra khỏi cột. Sau đó lysozyme được
thơi ra bằng cách nâng pH lên 10, hoặc tăng nồng độ ion trong dung dịch để cạnh tranh
và đẩy lysozyme ra ngoài.

II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford bài 5:
2

y = 0,0134x + 0,0032 (R = 0,9917)
1. Mẫu thử protein
Cơng thức tính tốn
Lượng protein (μg) = Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) x Độ pha loãng x Thể tích (ml)

19


Bảng kết quả sắc ký trao đổi ion

Mẫu

A

B

C

D1

D2

D3

D4

0,236

0,116

0,091

0,114

0,082

0,053

0,065

20

20

1

1

1

1

1

15,13

6,18

4,31

6,03

3,64

1,48

2,37

Thể tích (ml)

1

0,5

3,84

1

1

1

1

Lượng
protein (μg)

304,48

61,80

16,55

6,03

3,64

1,48

2,37

OD595
Độ pha loãng

Nồng độ protein
mẫu đo (μg/ml)

Tổng lượng protein trong mẫu gộp D = 6,03 + 3,64 + 1,48 + 2,37 = 13,52 (µg)
Tổng lượng protein trong mẫu B, C và D = 61,80 + 16,55 + 13,52 = 91,87 (µg)
Hiệu suất (%) =

Mẫu gộp D
Mẫu A

x

100 =

13,52
304,48

x

100 ≈ 4,44%

Nhận xét
– Hiệu suất tinh chế lysozyme là 4,44%, còn thấp.
– Theo lý thuyết, A = B + C + D. Thực tế A > B + C + D.
– Dịch B vả C chứa nhiều protein tạp. Mẫu tinh chế (dịch D) thì chứa rất ít protein đích.
Giải thích
– Thực tế lysozyme trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất nhỏ.
– Hiệu suất thấp có thể do:


Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, còn làm tung nhựa trao đổi.



Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả đo
quang.



Chưa hoạt hoá tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký.



Các thể tích đo được chỉ ước lượng nên kết quả nồng độ protein cũng kém chính
xác.

20


2. Câu hỏi

Ly tâm lấy dịch 1ml lòng trắng trứng nạp lên cột
Hứng thu dịch B
Tốc độ 0,5–1 ml/phút
Rửa cột với đệm chạy, tốc độ 1–2 ml/phút, đến khi
khơng cịn protein
Hứng dịch chảy ra C
Thôi lysosym bằng đệm thôi, tốc độ 1 ml/phút

Thu dịch theo từng ml
Kiểm tra đến khi hết protein

Định lượng đo
quang

Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích đệm chạy

Sơ đồ tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion

21

MỤC LỤC

Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật
......................................................................................................................... Trang 1
Bài 3. Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
......................................................................................................................... Trang 4
Bài 4. Tinh chế enzyme amylase bằng alginate
......................................................................................................................... Trang 7
Bài 5. Cố định CGTase lên alginate
......................................................................................................................... Trang 11
Bài 10. Tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion
......................................................................................................................... Trang 19

22