Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily sibberia và bước đầu chuyển gen nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

....

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I
---------

---------

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
CHO CÂY LILY SIBBERIA VÀ BƯỚC ðẦU CHUYỂN GEN
NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Trồng trọt
Mã số: 606201

Người hướng dẫn : PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI - 2007


LI CAM OAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và cha từng đợc ai công bố
trong bất kì công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ

đợc chỉ rõ nguồn gốc.

H Ni, ngy 10 tháng 9 năm 2007
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

i


LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS.TS.Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã trực tiếp hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian tơi thực hiện đề tài tốt nghiệp, cũng như trong thời
gian tơi hồn thành bản luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
GS.TS.Nguyễn Quang Thạch, Viện trưởng Viện Sinh học Nông nghiệp,
Trường ðại học Nông nghiệp I, Hà Nội, ñã tạo ñiều kiện về vất chất cũng như
tinh thần tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi làm việc cũng như thời gian
tơi thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths. ðinh Trường Sơn, và
toàn thể anh chị em của Viên Sinh học Nơng nghiệp đã giúp đỡ tơi rất nhiều
trong thời gian tơi thực hiện đề tài.
Hà Nội, ngày 10 tháng 9 năm 2007
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hương

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

ii


MC LC
Trang
1. mở đầu
1
1.1.
t vn ủ
1
1.2.
Mc ủớch, yờu cu ca ñề tài
2
1.2.1. Mục ñích
2
1.2.2. Yêu cầu
3
1.2.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài
3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
5
2.1.
Giới thiệu chung về cây hoa lily
5
2.1.1. Nguồn gốc
5
2.1.2. Vị trí phân loại thực vật

5
2.1.3. ðặc tính sinh vật học
6
2.1.4. Tình hình phát triển hoa lily
7
2.1.4.1. Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới
7
2.1.4.2. Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam
8
2.2.
Chuyển gen ở thực vật
9
2.2.1. Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen
9
2.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
9
2.3.
Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
10
2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật
10
2.3.1.1. Tính tồn năng của tế bào.
10
2.3.1.2. Sự phân hố, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào
11
2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật.
13
2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
14

2.3.2.1. Ti-plasmid
15
2.3.2.2. Chức năng của T-ADN
15
2.3.2.3. Chức năng của gen Vir
16
2.3.2.4. Cơ chế lây nhiễm
19
2.3.2.5. Kỹ thuật chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
22
2.4.
Tình hình phát triển cây trồng chuyển gen
23
2.4.1. Những hướng chuyển gen chính ở thực vật
23
2.4.2. Tình hình chung về phát triển cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu
25
2.5.
Nghiên cứu chuyển gen trên cây hoa lily
26
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

iii


3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
29
3.1.
ðối tượng nghiên cứu
29

3.2.
Nội dung nghiên cứu
30
3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh tạo nguyên liệu chuyển gen
30
3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ ñường saccaroza
30
3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất cytokinin
30
3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của nhóm chất auxin
31
3.2.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng
32
3.2.1.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và đường
saccaroza
33
3.2.2. Các thí nghiệm chuyển gen.
33
3.3.
Phương pháp nghiên cứu
34
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tái sinh mô vẩy củ tạo mẫu cho chuyển gen.
34
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy và lây nhiễm vi khuẩn.
34
3.3.3. Cách bố trí thí nghiệm
35
3.3.4. Chỉ tiêu theo dõi
35
3.3.5. ðịa ñiểm và thời gian thực hiện

36
3.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
36
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
37
4.1.
Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro
37
4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ saccaroza
38
4.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của chất ñiều tiết sinh trưởng
41
4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin
41
4.1.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất auxin
46
4.1.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng
52
4.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường
sacaroza
60
4.2.
Nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
63
4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của cefotaxime
64
4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy
66
74
5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

5.1.
Kết luận
74
5.2.
ðề nghị
75
TÀI LIỆU THAM KHẢO
76
PHỤ LỤC 1
80
PHỤ LỤC 2
81

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

Dichlorophenoxyacetic acid

BA

Benzyl adenin

αNAA

α-Naphthylacetic acid

IAA

Indol acetic acid

MS

Murashige and Skoog, 1962

ðC

ðối chứng

psht

Phát sinh hình thái

ðNC

ðồng ni cấy

GFP

Green fluoresence protein

AS

Acetosyringone

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của saccaroza ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

38

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy

42

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của BA ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

43

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của IAA ñến sự phát sinh hình tháicủa mẫu cấy

46

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của αNAA đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

47

Bảng 4.6. Ảnh hưởng của 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

49

Bảng 4.7. Ảnh hưởng tổ hợp kinetin + 2,4D đến sự phát sinh hình thái của
mẫu cấy

53

Bảng 4.8. Ảnh hưởng tổ hợp BA + 2,4D ñến sự phát sinh hình thái của
mẫu cấy

56

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D + saccaroza ñến sự phát sinh
hình thái của mẫu cấy

60

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của cefotaxime đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy
lát mỏng vẩy củ
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng ñộ cefotaxime ñến khả năng diệt khuẩn

64
66

Bảng 4.12. Ảnh hưởng của thời gian đồng ni cấy đến tỷ lệ mẫu mọc khuẩn 67
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng ni cấy ñến tỷ lệ mẫu sạch và mẫu
sống sau khi diệt khuẩn

70

Bảng 4.14. Ảnh hưởng của thời gian đồng ni cấy ñến tỷ lệ mẫu mang gen
chỉ thị GFP

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

71

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1. Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra

14

Hình 2.2. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-ADN

20

Hình 2.3. Mơ hình chuyển nạp T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây

21

Hình 3.1. Giống Lilium Oriental hybrid “Siberia”

29

Hình 3.2. Sơ đồ Plasmid mang gen GFP

29

Hình 4.1. Mẫu tái sinh tạo callus, chồi và rễ trên mơi trường 30g/l sacaroza

40

Hình 4.2. Ảnh hưởng của sacaroza ñến sự phát sinh hình thái của lát mỏng
vẩy củ
40
Hình 4.3. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên môi trường 1mg/l kinetin

45

Hình 4.4. Mẫu tái sinh tạo callus và chồi trên mơi trường 1mg/l BA

45

Hình 4.5. Ảnh hưởng của BA và kinetin đến sự phát sinh hình thái của mơ
vẩy củ
45
Hình 4.6. Mẫu tái sinh tạo callus, rễ trên mơi trường 2mg/l αNAA

51

Hình 4.7. Mẫu tái sinh tạo callus và rễ trên mơi trường 1mg/l 2,4D

51

Hình 4.8. Ảnh hưởng của IAA, αNAA và 2,4D đến sự phát sinh hình thái của mơ
vẩy củ
51
Hình 4.9. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên mơi trường 1mg/l 2,4D + 0,2mg/l
kinetin

59
Hình 4.10. Mẫu tái sinh tạo chồi, callus và rễ trên mơi trường 1mg/l 2,4D
+ 0,2mg/l BA
59
Hình 4.11. Ảnh hưởng của tổ hợp auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái của
mô vẩy củ. Trên môi trường 1mg/l 2,4D + 0,2 mg/l kinetin và
1mg/l2,4D + 0,2mg/l BA
59
Hình 4.12. Mẫu tái sinh trên mơi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9%
saccaroza
62
Hình 4.13. Mẫu tạo callus trên môi trường 1mg/l 2,4D +0,2mg/l BA + 9%
saccaroza
62

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

vii


Hình 4.14. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + BA + saccaroza đến sự phát sinh hình
thái của lát mỏng vẩy củ
62
Hình 4.15. Khuẩn lạc trên mơi trường ðNC - Cơng thức 3 ngày ðNC

69

Hình 4.16. Khuẩn lạc trên mơi trường ðNC - Cơng thức 5ngày ðNC

69

Hình 4.17. Khuẩn lạc trên mơi trường ðNC - Cơng thức 7 ngày ðNC

69

Hình 4.18. Khuẩn lạc trên môi trường ðNC - Công thức 10ngày ðNC

69

Hình 4.19. Khuẩn lạc trên mơi trường ðNC - Cơng thức 15 ngày ðNC

69

Hình 4.20. ðối chứng

69

Hình 4.21. Ảnh hưởng của thời gian đồng ni cấy đến tỷ lệ mẫu mang
gen GFP
72
Hình 4.22. Mẫu mang gen GFP (1 ngày ðNC)

73

Hình 4.23. Mẫu mang gen GFP (3 ngày ðNC)

73

Hình 4.24. Mẫu mang gen GFP (5 ngày ðNC)

73

Hình 4.25. Mẫu mang gen GFP (7 ngày ðNC)

73

Hình 4.26. Mẫu mang gen GFP (10 ngày ðNC)

73

Hình 4.27. Mẫu đối chứng (khơng mang gen GFP)

73

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

viii


1. mở đầu

1.1. T VN

Lily l loi hoa ct rất quan trọng trên thế giới và ở Việt Nam. Trong
nhiều năm qua, hoa lily ln được đánh giá là một loại hoa cao cấp, có giá trị
kinh tế cũng như giá trị xuất khẩu cao. Nhu cầu về loại hoa này trên thị trường
hoa trong nước và trên thế giới là rất lớn. Vì thế, loại hoa này hiện ñang rất
ñược quan tâm và trú trọng phát triển.
ðể phát triển loại hoa này ở Việt Nam, nhiều cơ quan và nhà nghiên
cứu ñã tập trung nghiên cứu nhân giống bằng cả phương pháp truyền thống

(nhân giống bằng củ) và phương pháp ni cấy mơ, tế bào. ðã có rất nhiều
thành công trong việc nhân giống hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy mô,
tế bào, như: Nhân giống lily bằng phương pháp tạo củ in vitro; nhân giống
lily bằng phương pháp tạo cây in vitro,…(Viện Sinh học Nông nghiệp,
Viện Di truyền Nông nghiệp). Tuy nhiên, chúng ta mới chỉ thành cơng
trong việc nghiên cứu nhân giống, cịn việc nghiên cứu tạo giống vẫn cịn
là vấn đề mới mẻ và chưa ñược tập trung nghiên cứu cụ thể. ðến nay, việc
nghiên cứu tạo giống hoa lily thích ứng với điều kiện khí hậu Việt Nam
vẫn chưa được đề cập đến.
Trong tạo giống hoa nói chung và hoa lily nói riêng thì phương pháp
chuyển gen được coi là phương pháp có hiệu quả. Việc chuyển gen cho cây
hoa lily nhằm mục đích tạo sự ña dạng về màu sắc hoa hay tăng khả năng
thích nghi cho cây ở các điều kiện trồng trọt khác nhau là nội dung rất ñược
quan tâm của nhiều nhà khoa học nông nghiệp trên thế giới và cả trong nước.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

1


Hiện nay trên thế giới, việc tạo giống cây trồng chuyển gen ngày càng
phát triển và thu ñược nhiều thành tựu. Năm 2006 diện tích cây trồng chuyển
gen đạt trên 100 triệu ha, với 22 nước trồng cây biến ñổi gen. Các loại cây
trồng chuyển gen chủ yếu ñược chuyển nạp đặc tính kháng thuốc trừ cỏ và
kháng sâu, bệnh. Các nỗ lực chính trong nghiên cứu chuyển gen vào cây lily
ñã ñược thực hiện bởi các phương pháp chuyển gen trực tiếp như bắn gen
(Nishihara và cộng sự, 1993; Sanford và cộng sự, 1993; Wilmink và cộng sự,
1995; Tsuchiya và cộng sự, 1996), sử dụng xung ñiện (Miyoshi và cộng sự,
1995). Trong những năm gần đây, sự thành cơng trong nghiên cứu chuyển
gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược cơng bố trên một số lồi thuộc họ

liliaceae bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka và Kameya, 1998), Allium
sativum (Kondo và cộng sự, 2000), và Muscari armeniacum (Suzuki và
Nakano, 2002). Gần ñây nhất, tác giả Y. Hoshi và cộng sự ñã nghiên cứu
thành cơng quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid lily, Lilium
Oriental hybrid “Acapulco” bằng vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên cho
ñến nay việc nghiên cứu chuyển gen cho cây lily cịn hồn tồn chưa được đề
cập ở Việt Nam. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi tiến hành ñề tài:
"Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên cây lily Sibberia
và bước ñầu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens".

1.2. MỤC ðÍCH, YÊU CẦU CỦA ðỀ TÀI

1.2.1. Mục đích
+ Nghiên cứu các đường hướng tái sinh in vitro nhằm tạo nguyên liệu
cho công tác chuyển gen cho cây hoa lily.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

2


+ Bước ñầu nghiên cứu một số khâu kỹ thuật ñể chuyển gen cho cây
hoa lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm cơ sở cho việc xây
dựng quy trình chuyển gen.
1.2.2. Yêu cầu
a. Xây dựng hệ thống tái sinh
* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của ñường saccaroza tới sự phát sinh hình thái
của mẫu cấy.
* Xác định được ảnh hưởng riêng rẽ và tổ hợp của một số chất ñiều tiết sinh
trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.

* Xác định được ảnh hưởng của tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng và ñường
saccaroza tới sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.
b. Các thí nghiệm chuyển gen
* Xác định được ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim
tới khả năng sống và tái sinh của mẫu thí nghiệm.
* Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số nồng ñộ chất kháng sinh cefotaxim
tới sự sống sót của vi khuẩn A. tumefaciens sau q trình đồng ni cấy .
* Bước đầu thử nghiệm chuyển gen GFP (gen chỉ thị) vào cây hoa lily
nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
1.3. Ý nghĩa khoa học, thực tiễn và tính mới của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
ðề tài sẽ cung cấp thêm nhưng dẫn liệu cơ bản góp phần xây dựng hệ
thống tái sinh in vitro ở cây hoa lily, ñặc biệt là ñường hướng tái sinh tạo
callus từ mô vẩy củ tạo nguyên liệu phù hợp cho quá trình chuyển gen gián
tiếp nhờ vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu của ñề tài chứng minh khả năng có thể
chuyển gen vào cây hoa lily một loại cây thuộc nhóm một lá mầm bằng vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

3


1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Trong nghiên cứu chọn tạo giống hoa nói chung và đặc biệt là chọn tạo
giống hoa lily ở nước ta còn rất hạn chế. Kết quả nghiên cứu của ñề tài làm
tiền ñề và thúc ñẩy việc ứng dụng một phương pháp mới trong chọn tạo giống
cây trồng nói chung và cây hoa lily nói riêng ở Việt Nam là tạo giống cây
trồng chuyển gen.
1.3.3. Tính mới của đề tài
ðề tài là một trong những cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu

chuyển gen cho cây lily nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Việc chuyển
nạp thành công gen chỉ thị GFP (green fluoresence protein) cho mô vẩy củ của
cây hoa lily Sibberia là những kết quả đầu tiên rất có ý nghĩa của hướng nghiên
cứu hồn tồn mới nêu trên.

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

4


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY HOA LILY

2.1.1. Nguồn gốc
Cây hoa lily có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên,
Mỹ và một số nước khác. Hoa lily ñã ñược nghiên cứu và thuần hóa gần 100
năm nay từ các lồi hoang dại phân bố ở hầu hết các châu lục từ 100 ñến 600
vĩ bắc, đặc biệt là những vùng có khí hậu ôn ñới và lạnh, hoặc ở những vùng
núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt ñới như Trung Quốc, Ấn ðộ,
Indonexia, Việt Nam ...[7].
2.1.2. Vị trí phân loại thực vật
Trong hệ thống phân loại thực vật cây hoa lily được xếp vào nhóm cây
một lá mầm (Monocotyledones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales),
họ hành (Liliaceae), chi Lilium.[14].
Chi Lilium có tới hơn một trăm lồi, ở châu Á có khoảng 50 đến 60
lồi (Nhật, Trung Quốc, Triều Tiên, Việt Nam ...), Bắc Mỹ có tới 24 lồi (Mỹ,
Canada, Argentina), châu Âu có 12 lồi (Hà Lan,Ý, Pháp) [7].
Ở Việt Nam mới chỉ phát hiện thấy 2 loài cây là cây bách hợp (L.brownii
F.E Brow war oldiesteriwils), mọc hoang dại trên các ñồi cỏ ở Bắc Giang, Thái

Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, có vẩy củ của thân dùng làm thuốc và lồi Lilium
poilanei Ganep có ở đồi cỏ Sa Pa, Hồng Liên Sơn.
Ngồi ra, hiện nay có rất nhiều giống lai được tạo ra bằng phương pháp lai
hữu tính giữa các loài hoa loa kèn với nhau. Các giống lồi này có sức sinh trưởng

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

5


khỏe, có khả năng chống sâu bệnh, mang lại các ñặc trưng hình thái, dạng hoa
trung gian của bố và mẹ với các màu sắc hết sức ñộc ñáo và lạ mắt [11].
2.1.3. ðặc tính sinh vật học
Cây hoa lily là loại cây thân thảo, thân cao từ 50-200cm. Bộ phận trên
mặt ñất là thân, lá, hoa và quả, là phần thương phẩm của lily. Bộ phận dưới
mặt ñất là rễ và thân vẩy (củ) là bộ phận làm giống của cây lily.
Thân cây lily thường mọc đơn có lá. Lá ln có hình mũi mác hay hình
vạch ít khi rộng, hình tim và mọc xung quanh thân, khơng có cuống hoặc
cuống rất ngắn, một số ít giống ở nách lá có mầm, có thể dùng nhân giống.
Hoa lưỡng tính, kích thước lớn mọc ở nách lá hay ở ngọn. Hoa có hình loa
kèn, hình phễu, hình sao, hình cái chén nông. Màu sắc hoa rất phong phú:
màu trắng, màu vàng lục, màu phấn hồng, màu cam, màu ñỏ, màu tím ... Màu
cánh hoa thường là đơn sắc hoặc có đốm màu nâu, màu tím một số có hương
thơm. Hoa có thể mọc riêng lẻ hay thành cụm gồm nhiều hoa, bao hoa 6 mảnh
dạng cánh, nhị 6, bầu hình trụ, đầu nhụy hình đầu, chia 3 thùy. Quả nang có 3
góc và 3 nang, quả nang có nhiều hạt, ñộ lớn, trọng lượng hạt tùy theo giống.
Trong ñiều kiện khơ, lạnh, hạt có thể bảo quản được ba năm.
Rễ lily có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vẩy gọi là rễ gốc, to, mềm, có
ngay trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng. Rễ mọc ở nơi tiếp giáp
giữa củ và thân trên mặt ñất gọi là rễ thân.

Phần thân vẩy là phần phình to của thân tạo thành, có màu trắng
hoặc màu hồng nhạt, phía ngồi khơng có màng bao bọc, nên gọi là thân
vẩy trần. Trên đĩa thân vẩy có vài chục vẩy hợp lại, chất ñất, kỹ thuật trồng
và tuổi của thân vẩy ảnh hưởng rất lớn đến hình thái thân. Màu sắc, kích
thước của thân vẩy tùy thuộc vào lồi, giống khác nhau. ðộ lớn của thân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

6


vẩy tương quan chặt chẽ với số nụ hoa. Thân vẩy chứa 70% nước, 23%
chất bột, một lượng nhỏ protein, chất khoáng và chất béo. Theo Linline
(1970) [4], số thân vẩy cũng tỷ lệ thuận với số lá và số nụ hoa, số vẩy càng
nhiều thì số lá và số nụ hoa càng nhiều. Nếu bóc bỏ lớp vẩy củ ngồi thì
tốc độ nảy mầm của của củ nhanh hơn, nhưng tốc độ hình thành của các cơ
quan sinh sản giảm, ra hoa muộn hơn.
2.1.4. Tình hình phát triển hoa lily

2.1.4.1. Tình hình phát triển hoa lily trên thế giới
Trên thế giới, lily cùng với tuylip, freesia là ba loại hoa dạng thân củ chủ
yếu quan trọng trong ngành sản xuất hoa, chiếm 24% giá trị sản phẩm hoa
thương mại. Những vùng sản xuất hoa lớn trên thế giới gồm các nước Châu Âu
như Hà Lan, Pháp, Bỉ, ðức, Ý,...; các nước Bắc Mỹ như Mỹ, Canada...; một số
nước ở Châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan,...[4].
Năm 1997, Hà Lan có 356 ha lily, đứng thứ hai trong tổng diện tích
hoa cắt trồng bằng củ ở đất nước này (sau tuylip). Sở dĩ hoa lily ñược phát
triển mạnh trong những năm gần ñây là do người Hà Lan ñã tạo ra rất nhiều
giống mới có hoa ñẹp, chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao. Hiện nay, Hà
Lan mỗi năm trồng khoảng 18.000 ha hoa lily trong đó xuất khẩu 70%. Hà

Lan cịn là nước có cơng nghệ tạo giống và trồng lily tiên tiến nhất hiện nay.
Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15 ñến 20 giống mới, sản xuất 1,315 triệu củ giống
lily, cung cấp cho 35 nước khác nhau trên thế giới [4].
Ở Italia, tổng diện tích trồng hoa chiếm 8000ha, tổng giá trị hàng năm
khoảng 1,1tỷ đơla, trong đó hoa lily là một trong những loại hoa cắt quan trọng
chiếm 280 – 300ha với tổng giá trị thu ñược hang năm là 71 triệu ñôla [34].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

7


Kenia là nước sản xuất hoa tươi chủ yếu của Châu Phi và là nước
xuất khẩu hoa tươi lớn nhất châu lục này. Mỗi năm nước này xuất khẩu
sang Châu Âu là 65 triệu USD, trong đó riêng lily chiếm 35% [4].
Ở Canada, hoa lily ñược sử dụng chủ yếu ở các dạng hoa cắt và hoa
chậu. Sản lượng hoa lily cắt cành tăng lên qua các năm. Năm 1998, sản lượng
hoa cắt cành là 11,28 triệu cành, hoa chậu là 4,2 triệu chậu; tăng lên 17,13
triệu cành và 4,39 triệu chậu vào năm 2000 [4].
Từ năm 1999 ñến năm 2003, tỷ lệ hoa cắt tăng 6-9% so với những năm
trước đó, đem lại lợi nhuận trên 35tỷ đơla, tập trung chủ yếu ở các nước như
Hungari, Trung Quốc, Nhật Bản, Hà Lan [4].
Nhật Bản có 1558 ha trồng các loại hoa có củ cho sản lượng hàng năm
là 33,047 triệu n Nhật trong đó diện tích trồng hoa lily chiếm khoảng 508
ha cho sản lượng hàng năm khoảng 15,068 triệu yên Nhật [34].
2.1.4.2. Tình hình phát triển hoa lily ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hoa lily ñã ñược trồng thành công ở nhiều tỉnh nước ta
như ðà Lạt - Lâm ðồng, Sapa – Lào Cai, Mộc Châu – Sơn La, Hà Nội với
hiệu quả kinh tế rất cao.
Hoa lily ở nước ta ñược xem là một trong bốn loại hoa quan trọng ñang

ñược nghiên cứu, nhằm ñưa loại hoa này thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn
của ngành trồng hoa trong tương lai. ðà Lạt là nơi hiện ñang có diện tích trồng
hoa lily lớn nhất trong cả nước (chiếm 8% diện tích trồng hoa trong cả nước).
Tình hình phát triển hoa lily ở ðà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu
ñãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa lily nói riêng, một
phần do kỹ thuật trồng hoa lily ở ðà Lạt tương ñối cao nên hoa sinh trưởng phát
triển khá tốt. Hiện nay, lily trong những loại hoa ñem lại hiệu quả kinh tế cao
nhất cho một số công ty ở ðà Lạt như: Công ty Hasfarm, công ty Bonifarm,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

8


cơng ty Thanh Sơn,… Phân viện sinh học nhiệt đới ðà Lạt. Trong đó, cơng ty
Hasfarm đã áp dụng cơng nghệ trồng hoa mới trên 28 ha với 60% sản lượng hoa
xuất khẩu sang Singapo, Nhật Bản, Thái Lan, Úc. Hoa lily là một trong số những
loại hoa ñược sản xuất nhiều nhất của công ty này [32].
2.2. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT

2.2.1. Khái niệm về kỹ thuật chuyển gen
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết
kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các
sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật…) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các
gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện
các đặc tính mới ở cơ thể chuyển gen.
2.2.2. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật
Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân
loại thành hai nhóm phương pháp chính:

+ Nhóm phương pháp chuyển gen gián tiếp gồm: Phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium và phương pháp chuyển gen nhờ virus.
+ Nhóm phương pháp chuyển gen trực tiếp gồm: Phương pháp chuyển
gen nhờ kỹ thuật siêu âm (Mild sonication); chuyển gen nhờ kỹ thuật ñiện
xung (electroporation); kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide; chuyển gen
bằng phương pháp súng bắn gen; phương pháp trực tiếp chuyển gen thông
qua ống phấn (pollen tube).
Trong các phương pháp chuyển gen nói trên thì phương pháp chuyển gen
gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp ñược sử dụng nhiều nhất

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

9


hiện nay. ðây là phương pháp khá ñơn giản, dễ dàng thực hiện và hiệu quả thành
cơng tương đối cao. Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens,
người ta ñã dùng vi khuẩn ñể chuyển các gen mong muốn trên cơ sở thiết kế
lại hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng
chuyển gen nhưng khơng mang các gen gây độc cho cây. Người ta ñã tạo ra
các dạng vectơ mới ñể chuyển gen là những vectơ liên hợp và vectơ nhị thể.
Các hệ thống vectơ mới ñược tạo thành này ñều ñược dựa trên cơ sở cải tiến
Ti-plasmid. Phần T-ADN của Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và gen
tổng hợp opine, thay thế vào ñấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị
và gen khởi động.
Ngồi ra, phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn (pollen
tube) cũng là phương pháp ñược sử dụng rộng rãi. Phương pháp chuyển gen này
cịn được xem là phương pháp chuyển gen khơng qua ni cấy mơ. Phương
pháp này được nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) đề xuất năm 1988 trên đối
tượng cây lúa. Theo phương pháp này thì ADN chuyển vào có thể theo đường

ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt phấn mọc qua
vịi nhụy và bắt đầu đưa tinh tử vào thụ tinh. Theo tác giả thì chuyển gen qua bao
phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh sảy ra ở noãn nhưng tế bào sinh dục
cái chưa phân chia. Như vậy, sự chuyển gen chỉ xảy ra ñối với một tế bào sinh
sản cái (trứng) duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không xuất hiện thể khảm. ở Việt
Nam, phương pháp này ñang ñược Viện nghiên cứu cây bông và Viện Công
nghệ sinh học thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông [13].
2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT
NHỜ VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

2.3.1. Cơ sở khoa học về khả năng tái sinh ở thực vật
2.3.1.1. Tính tồn năng của tế bào.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

10


Haberlandt (1902), lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ
của một cơ thể sinh vật ña bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành
một cá thể hoàn chỉnh. Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào
riêng rẽ đã phân hố đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền cần thiết và
đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có
thể phát triển thành một cá thể hồn chỉnh. ðó là tính tồn năng của tế bào.
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con người đã hồn
tồn chứng minh ñược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ
một tế bào riêng rẽ [13], [24].
2.3.1.2. Sự phân hoá, phản phân hoá và tái phân hoá của tế bào
Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm
nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào

khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó ñều bắt nguồn từ một tế bào
ñầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai ñoạn ñầu, tế bào hợp tử liên tục phân chia
hình thành nhiều tế bào phơi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chun
hóa). Sau đó từ các tế bào phơi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành
các tế bào chun hóa đặc hiệu cho các mơ, cơ quan có chức năng khác
nhau. ðó là q trình phân hố tế bào ở cơ thể thực vật [13].
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hố thành các tế bào có chức năng riêng
biệt, chúng khơng hồn tồn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường
hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi
sinh và phân chia mạnh mẽ. Q trình đó gọi là phản phân hố tế bào, ngược
lại với sự phân hoá tế bào.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

11


Q trình phân hố tế bào có thể biểu thị:
Q trình phân hố

Tế bào phơi sinh
(hợp tử)

Q trình phản phân hố

Tế bào chun hố

Tế bào phơi sinh
(mơ sẹo)

Q trình tái phân hố

Trong điều kiện ni cấy nhân tạo (ni cấy in vitro), các tế bào phơi
sinh (mơ sẹo) có thể tái sinh thành các dạng tế bào chuyên hoá như chồi, rễ và
có thể thành cây hồn chỉnh dưới sự tác ñộng của một số chất ñiều tiết sinh
trưởng. ðây chính là q trình tái phân hố tế bào thực vật, q trình này chỉ
xảy ra trong ni cấy in vitro.
Về bản chất thì sự phân hố và phản phân hố là một q trình hoạt hố,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong q trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hố (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới,
cịn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. ðiều này xảy ra theo một chương
trình đã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá
trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật ln được hài hịa.
Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế
bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của
khối mơ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ, tế bào thực vật thực
chất là kết quả của q trình phân hố, phản phân hố và tái phân hố tế bào.
Kỹ thuật ni cấy mơ, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát
sinh hình thái của tế bào thực vật (khi ni cấy tách rời trong điều kiện nhân
tạo và vơ trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa
của tế bào trên cơ sở tính tồn của tế bào thực vật. ðể ñiều khiển sự phát sinh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

12


hình thái của mơ ni cấy, người ta thường bổ sung vào mơi trường ni cấy
hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin.

Tuỳ theo mục đích nghiên cứu đặt ra như tạo mơ sẹo, tạo chồi phụ, tạo
rễ, tạo phơi vơ tính hay cho mọc chồi trực tiếp từ mơ ni cấy, mà mơi trường
thích hợp là rất cần thiết [13].
2.3.1.3. Vai trò của hệ thống tái sinh in vitro trong chuyển gen ở thực vật.
Trong kỹ thuật chuyển gen vào cơ thể thực vật, thì nguồn vật liệu
thường được sử dụng để chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẩu callus, phôi,
những tế bào tách rời… Những vật liệu này sau khi ñã ñược biến nạp thành
cơng, các tế bào đã dung nạp những gen ngoại lai, ta phải tìm cách làm cho
những tế bào này tái sinh được thành một cơ thể hồn chỉnh bằng cách đặt nó
vào một mơi trường tái sinh thích hợp. Nếu như, sự tái sinh thành cây hồn
chỉnh khơng thành cơng thì tất cả những vật liệu đã được biến nạp đó sẽ trở
nên vơ nghĩa. Chính vì vậy, sự thành công của kỹ thuật chuyển gen phụ thuộc
vào sự tái sinh của tế bào. Do vậy, việc lựa chọn và điều chỉnh mơi trường
ni cấy mơ và tế bào thực vật đóng vai trị hết sức quan trọng, mang tính
quyết định tới thành cơng hay thất bại của thí nghiệm biến nạp, bên cạnh đó,
vấn đề sử dụng mơ hay tế bào thích hợp để biến nạp cũng là mục tiêu nghiên
cứu không kém phần quan trọng [9].
James F. Hutchinson, Daniel Isenegger, Savitri Nadesan, Neil Smith
and Peter Waterhouse, năm 2000 [26] nhận thấy: để có thể tạo ñược giống
mới nhờ cải biến di truyền một cách hiệu quả thì phải đảm bảo 4 u cầu sau:
- Hệ thống tái sinh thích hợp để tái sinh được cây đã chuyển gen.
- Hệ thống vectơ thích hợp để có thể ñưa các gen lạ vào bộ gen của ñối
tượng ñược chuyển gen.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

13


- Có các gen thích hợp đã được nhân dịng và đã xác định được các đặc tính

- Các phương pháp để đánh giá các cây chuyển gen trong phịng thí
nghiệm, nhà kính và đồng ruộng.
2.3.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là lồi vi khuẩn được sử dụng phổ biến
nhất trong chuyển nạp gen. Agrobacterium tumefaciens thuộc vi khuẩn đất,
gram âm, hình que, có khả năng di động (có 5-11 lơng roi), khơng sinh bào tử
và cùng họ với vi khuẩn cố ñịnh ñạm Rhizobium. Vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tối ưu ở nhiệt ñộ 290C [10].
Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây do nó có khả năng
chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ, sau đó T-ADN này hợp nhất vào bộ gen
của tế bào cây chủ dẫn đến hình thành khối u. Khối u được hình thành trên rễ
(phần nằm trên mặt đất) và đỉnh của nhiều lồi cây hai lá mầm, một số loài
cây ăn quả như táo, lê, ñào, nho và những cây cảnh như hoa hồng [15].

Hình 2.1. Khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra
(nguồn />
Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens có kiến trúc vịng,
kích thước 2,6 Mb. Ngồi ra vi khuẩn cịn mang plasmid lớn có kích thước 200800 kbp, phần lớn những gen có liên quan đến sự hình thành khối u ở thực vật ñều
nằm trong plasmid này nên ñược gọi là Ti-plasmid [15].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

14


2.3.2.1. Ti-plasmid
Ti-plasmid là một phân tử ADN sợi đơi mạch vịng nằm tách biệt với
nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách ñộc lập trong tế bào vi khuẩn.
Cấu trúc chung của một Ti-plasmid gồm: vùng T-ADN - trình tự mã hố được
chuyển vào trong cây; vùng mang các gen vir - vùng trực tiếp tham gia tạo TADN sợi ñơn và chuyển T-ADN này vào tế bào cây; vùng rep - cần cho sự tái bản
của Ti-plasmid, vị trí tra và trb - tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của Tiplasmid, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine. Hai yếu tố quan

trọng trong cấu trúc của Ti-plasmid cần cho sự chuyển gen vào cây là ñoạn TADN bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai bờ của đoạn T- ADN và gen vir [13], [15].
2.3.2.2. Chức năng của T-DNA
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước từ 10-30 kbp, có mang các
gen mã hố cho việc tổng hợp auxins, cytokinins, opines và các gen gây
khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bởi các trình tự
lập lại có chiều dài khoảng 25 bp nằm ở 2 ñầu gọi là bờ phải và bờ trái.
Tuy nhiên, bờ trái của T-ADN bị mất khơng ảnh hưởng đến tính độc nhiều,
trong khi đó bờ phải lại cần thiết và được đề nghị rằng tiến trình chuyển
nạp diễn ra với bờ phải trước rồi tiến dần về phía trái. Việc ñảo ngược bờ
phải sẽ làm yếu ñi khả năng tạo khối u [13].
T-ADN mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây
ñược chuyển gen sẽ làm thay đổi hình thái của cây. Theo Binns và Costantino
(1998) [15], T-ADN mã hóa cho 13 protein và những vùng khơng sao mã của
các gen được chuyển mang nhiều ñặc ñiểm của các gen trong nhân của thực
vật, thí dụ như kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box). Một
nhóm các gen của T-ADN điều khiển tổng hợp các hormon sinh trưởng của

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

15


cây, những hormon này làm các tế bào tăng trưởng và làm thay đổi hình dạng
bên ngồi. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hố
tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm
của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP và các enzyme
trong cây được cho là chuyển hố isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin
bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử hydro của một
nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-ADN khác được cho là có chức
năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5

ñiều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, ñó là một chất ñồng ñẳng với auxin.
Trong khi ñó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức ñộ nhạy cảm của các
tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chưa được giải thích. Gen tml
có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác.
Một nhóm gen được chuyển vào tế bào ñể ñiều khiển sản xuất nguồn
dinh dưỡng cho vi khuẩn Agrobacteriu tumefaciens phát triển, đó là các
opines. ðây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit
hoặc với một ñường. Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lượng
lớn các opines. Các opines này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên
ngoài vùng T-ADN và thường trên plasmid ñộc) cần cho việc phân giải các
opines ñược tổng hợp từ khối u [13], [15].
2.3.2.3. Chức năng của gen Vir
Quá trình chuyển T-ADN từ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sang
tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt động của các gen vir. Có ít nhất 25
gen được nhận biết trong 7 ñơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE,
virG, virF và vùng này có kích thước khoảng 30- 40 kbp. Theo Stachel và ctv.
(1987) [15] vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB,
virC, virD, virE và virG. Những gen vir này có vai trị trong việc tạo sợi ñơn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------

16