Luận văn thạc sĩ khảo sát tập đoàn cà chua phát hiện gen chí chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử DNA

....

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------------------------

NGUYỄN THỊ VÂN

KHẢO SÁT TẬP ðOÀN CÀ CHUA, PHÁT HIỆN GEN
CHÍN CHẬM VÀ KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số

: 60 42 80

Người hướng dẫn khoa học

: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2012


LỜI CAM ðOAN

Tơi xin cam đoan tất cả số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
tốt nghiệp này là khách quan, trung thực và chưa từng ñược sử dụng để bảo
vệ một học vị nào.
Tơi xin cam đoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn tốt
nghiệp này đã được cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã
ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Vân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

i


LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tơi
đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng
như những người thân trong gia đình.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tơn,
người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi về chun mơn trong suốt q trình
thực hiện đề tài và hồn thành luận văn. Tơi xin chân thành cảm ơn KS. Tống
Văn Hải và toàn thể cán bộ, nhân viên bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ
sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ðH Nơng nghiệp Hà Nội đã rất
nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực
hiện đề tài tại bộ mơn. Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trường ðH nơng nghiệp Hà Nội đã trang bị cho tơi những kiến thức cần thiết

để có thể thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình,
anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tơi hồn thành
luận văn này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012
Tác giả

Nguyễn Thị Vân

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

ii


MỤC LỤC
Lời cam ñoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

v

Danh mục bảng

vi

Danh mục hình

vii

1

MỞ ðẦU

1

1.1

ðặt vấn đề

1

1.2

Mục đích, u cầu

3

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1

ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua

4

2.2

Một số ñặc ñiểm nơng sinh học của cây cà chua

5

2.3

u cầu điều kiện ngoại cảnh của cây cà chua

5

2.4

Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm

7

2.5

Tổng quan tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng

bệnh virus xoăn vàng lá

15

2.6

Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua trong nước

22

3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

25

3.1

ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

25

3.2

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

26

3.3

Phương pháp xử lý số liệu

34

4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

35

4.1

Khảo sát đánh giá các mẫu giống trong vụ đơng xn (2012)

35

4.1.1

Các giai đoạn sinh trưởng

35

4.1.2

Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc cây

37

4.1.3

Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm nở hoa

41

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii


4.1.4

ðánh giá tình hình nhiễm bệnh một số bệnh hại chính trên
đồng ruộng

43

4.1.5

Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

46

4.1.6

ðặc điểm hình thái quả

49

4.1.7

ðặc điểm chất lượng quả

52

4.2

Kết quả PCR phát hiện gen chín chậm rin

55

4.3

ðánh giá đặc tính chín chậm của quả

56

4.4

Kết quả PCR phát hiện gen kháng virus xoăn vàng lá

58

4.4.1

Kết quả PCR phát hiện gen Ty-1

58

4.4.2

Kết quả PCR phát hiện gen Ty-2

59

4.4.3

Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3

59

4.5

ðề xuất một số mẫu giống cà chua triển vọng

60

5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

63

5.1

Kết luận

63

5.2

Kiến nghị

63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

64

PHỤ LỤC

69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- PCR: Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp DNA
- TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus
- ACC

: 1-aminocylopropane-1-carbonxylic acid.

- Cnr

: Colorless non-ripening.

- ETB

: Ethidium bromide.

- DNA

: Deoxyribonucleotide acid.

- dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
- EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic
- FAO

: Food and Agriculture Organization.

- Gr

: Green ripe.

- rin

: ripening inhibitor.

- Nor

: non-ripening.

- Nr

: Never ripen.

- PG

: enzyme polygalacturonase.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

3.1

Nguồn vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

25

4.1

Các giai ñoạn sinh trưởng của các mẫu giống vụ ñông xuân 2012

35

4.2

Một số ñặc ñiểm cấu trúc cây của các mẫu giống vụ đơng xn 2012 38

4.3

Cấu trúc chùm hoa và ñặc ñiểm hoa của các mẫu giống vụ đơng
xn 2012

4.4

Thống kê sơ bộ tình hình nhiễm một số loại sâu bệnh hại của các
giống cà chua

4.5

45

Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các mẫu giống
vụ đơng xn 2012

4.6

42

47

Một số đặc điểm hình thái quả của các mẫu giống vụ đơng xn
2012

50

4.7

Một số đặc điểm về chất lượng quả vụ đơng xn 2012

53

4.8

ðánh giá đặc tính chín chậm quả các giống cà chua mang gen rin

57

4.9

Một số giống cà chua có triển vọng

62

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vi


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

2.1

Sơ đồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006

2.2

Sơ đồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng hợp

8

Ethylen

10

2.3

Sơ ñồ thể hiện cơ chế điều hịa, tác động của ethylen

11

2.4

Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua

12

2.5

Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua

14

2.6

Bản ñồ gen của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể số 1 của cà chua

15

2.7

Gen Ty-1 nằm trên NST số 6

18

2.8

Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11

18

2.9

Gen Ty-3 nằm trên NST số 6

20

2.10

Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3

20

2.11

Bản ñồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc
thể 4

21

4.2

Ảnh ñiện di sản phẩm chạy PCR phát hiện gen chín chậm rin

56

4.3.

Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1

58

4.4

Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-2 bằng cặp mồi

4.5

T0302F/TY-2R1

59

Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Ty-3

60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

vii


1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Cây cà chua (Licopersicum esculentum Mill) thuộc họ cà (Solanaceae)
có nguồn gốc từ Châu Mỹ là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, được
trồng với diện tích lớn nhất trong các cây rau. Quả cà chua có nhiều giá trị
dinh dưỡng cao, đặc biệt là trong quả chín có nhiều loại vitamin và khống
chất rất có lợi cho sức khỏe con người. Ngồi ra cây cà chua cịn được nhiều
phịng thí nghiệm sử dụng làm cây mơ hình cho các nghiên cứu di truyền, tế
bào và chọn giống ở thực vật bậc cao. Hiện nay ở các nước châu Âu, ngoài
giá trị dinh dưỡng, quả cà chua ñược dùng như một nguồn dược liệu làm chất
chống oxy hóa ở người.
Sản xuất cà chua ở miền Bắc nước ta khá thuận lợi ñặc biệt là vụ đơng
xn nên loại rau này được trồng chủ yếu từ tháng 10 ñến tháng 4 năm sau
(chiếm 70% sản lượng thu hoạch). Vụ đơng xn là thời kỳ có nhiều yếu tố
mơi trường như nhiệt độ, ẩm ñộ, ánh sáng..., rất thuận lợi cho cà chua sinh
trưởng, phát triển và ít bị sâu bệnh phá hại nên năng suất và chất lượng khá
cao. Tuy nhiên do thu hoạch tập trung nên giá tương ñối thấp ảnh hưởng ñến
thu nhập của người sản xuất. Trong khi ñó, từ tháng 6 đến tháng 9 do thời tiết
nóng bức nên nhu cầu cà chua ăn tươi, làm nước giải khát hay phục vụ chế
biến và cơng nghiệp đồ hộp rất cao, giá cà chua lúc này có lúc tăng gấp 2 – 3
lần thời điểm chính vụ. Vì thế, đã có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà
chua như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống

chống chịu nóng, úng và sâu bệnh. Tuy nhiên do điều kiện thời tiết khơng
thuận lợi nên hầu hết các giống cà chua mới chọn tạo của ta hiện nay chưa
thích ứng tốt và đem lại hiệu quả kinh tế khi trồng trái vụ.
Hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ nhiều nước trên thế
giới như Mỹ, Pháp và Nhật ñã tạo ñược nhiều giống cà chua có tính chín

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

1


chậm hoặc khơng chín. Những giống cà chua có đặc tính này quả dù đạt kích
thước và tích luỹ đủ chất khơ nhưng khơng chín trên cây do mất khả năng
sinh tổng hợp ethylene - là hoocmon tín hiệu giúp hoạt hố nhiều enzyme xúc
tiến cho q trình làm quả chín. Tính chín chậm hoặc khơng chín được xác
định là do một số gen quy ñịnh như: gen ức chế q trình chín của quả, ký
hiệu là rin (ripening inhibitor) nằm trên nhiễm sắc thể 5 (Vrebalov và cộng
sự, 2002), gen nor (non-ripening) và gen Nr (Never-ripening) quy định tính
khơng chín… Hiện nay người ta đã tìm thấy một số chỉ thị phân tử DNA ñể
phát hiện và chọn lọc các gen gây nên tính chín chậm này. Quả cà chua chín
chậm có thời gian sử dụng lâu hơn, độ cứng cao hơn cà chua thơng thường do
đó ít bị thối dập trong khi vận chuyển, kéo dài ñược thời gian bảo quản cũng
như thời gian sử dụng mà vẫn đảm bảo chất lượng. Chính vì thế, chọn tạo
giống cà chua có đặc tính chín chậm là một giải pháp ưu việt nhằm rải vụ
trong nhà mà không cần trồng trái vụ trên ñồng ruộng.
Mặt khác một trở ngại gây ảnh hưởng lớn ñến nền sản xuất cà ở miền
bắc cũng như nhiều nơi trên thế giới gặp phải là sự phá hại nặng của virus,
ñặc biệt ở vụ sớm, muộn và trái vụ. Cho ñến nay, biện pháp sử dụng giống
cà chua kháng virus ñược coi là hướng hiệu quả nhất để phịng chống bệnh.
Chính vì vậy, chọn tạo giống cà chua có khả năng kháng virus là rất cần

thiết. Hiện nay, đã có 5 gen kháng virus được phát hiện là Ty-1, Ty-2, Ty-3,
Ty-4 và Ty-5. Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR phát hiện gen Ty-1
(marker JB-1), Ty-2 (T0302) và Ty-3 (P6-25) cũng ñã ñược phát triển và sử
dụng rộng rãi (Pena và cộng sự, 2010). ðiều này có ý nghĩa rất quan trọng
trong việc phát hiện các gen kháng virus và chọn tạo các giống cà chua có
tính kháng bệnh.
Trong q trình giao lưu và hợp tác, bộ môn Sinh học phân tử và cơng
nghệ sinh học ứng dụng đã thu thập được một tập đồn các mẫu giống cà chua
đa dạng, phong phú, có chứa các gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2


ðể sử dụng chúng trong việc tạo ra giống có đặc tính chín chậm và kháng
virus xoăn vàng lá thì cần thiết phải khảo, sát đánh giá đặc điểm nơng sinh
học, năng suất, chất lượng, khả năng mang gen kháng virus và gen chín chậm.
ðể đáp ứng được u cầu trên dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Phan
Hữu Tôn chúng tơi đã tiến hành đề tài: “Khảo sát tập đồn cà chua, phát
hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá bằng chỉ thị phân tử
DNA”.
1.2. Mục đích, u cầu
1.2.1. Mục đích
- ðánh giá được các đặc điểm nơng sinh học, năng suất, chất lượng,
đặc tính chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trên ñồng ruộng của các mẫu
giống cà chua thu thập.
- Phát hiện gen chín chậm và kháng virus xoăn vàng lá trong tập đồn
cà chua bằng chỉ thị phân tử DNA.
- Tuyển chọn ñược một số dòng giống tốt.
1.2.2. Yêu cầu

- Khảo sát các ñặc ñiểm sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng
quả của các giống cà chua nhập nội.
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để phát hiện gen chín chậm, gen
kháng virus xoăn vàng lá trong tập đồn giống cà chua nhập nội.
- Tìm ra một số giống cà chua có triển vọng thích ứng với điều kiện thời
tiết khí hậu Việt Nam làm nguồn vật liệu tạo giống mới.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

3


2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua
Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và C rất quan trọng, là loại rau ăn
quả ñược sử dụng ở nhiều phương thức khác nhau. Trong quả cà chua chín có
nhiều dinh dưỡng như: ñường, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan
trọng như Ca, Fe, P, K, Mg… (Tạ Thu Cúc, 2006) [4]. Edward C. Tigchelaar
(1989) đã phân tích quả cà chua chín và xác định thành phần hóa học gồm: 94 95% nước, 5 - 6% chất khô.
Theo Võ Văn Chi (1997), về mặt y học cà chua có vị ngọt tính mát, giải
nhiệt chống hại huyết, kháng khuẩn, lọc máu, nhuận tràng, giúp tiêu hoá tốt
tinh bột... Nước ép cà chua kích thích gan, tốt cho dạ dày (Nguyễn Thị
Hồng Thuý, 2009) [10]. Một nghiên cứu của Mỹ cho thấy, lycopen trong quả
cà chua giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Ngồi ra lycopen được được
chứng minh là có thể ngăn ngừa bện ung thư tiện liệt tuyến (Trương Văn
Nghiệp, 2006) [8].
Bên cạnh giá trị dinh dưỡng lớn cây cà chua còn là một loại cây rau ăn
quả có giá trị kinh tế cao, chính vì vậy cà chua ngày càng chiếm vị trí quan
trọng trong cơ cấu cây trồng trên thế giới và không ngừng ñược mở rộng diện
tích gieo trồng. Sản suất cà chua ở đồng bằng sơng Hồng cho thu nhập bình

qn 42,0 ñến 68,4 triệu ñồng/ha/vụ với mức lãi thuần 15 ñến 26 triệu
ñồng/ha, cao gấp nhiều lần so với trồng lúa [8]. Ở ðài Loan hàng năm xuất
khẩu cà chua tươi với tổng giá trị là 925.000 USD và 40.800 USD cà chua
chế biến, mỗi hecta có thể đem lại thu nhập cho nông dân từ 4.000-5.000
USD. Ở. Mỹ hàng năm tổng giá trị xuất khẩu cà chua rất cao, chỉ tính riêng
kim ngạch xuất khẩu năm 1997 đạt hơn 4 lần so với lúa nước và 20 lần so với
lúa mì [4].

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4


2.2. Một số đặc điểm nơng sinh học của cây cà chua
Cà chua là cây trồng hàng năm, dạng thân bụi, phân nhánh mạnh, có lớp
lơng dày bao phủ, trên thân có nhiều đốt và có khả năng ra rễ bất ñịnh. Chiều
cao và số nhánh rất khác nhau phụ thuộc vào giống và ñiều kiện trồng trọt.
Rễ cà chua thuộc hệ rễ chùm, trên ñồng ruộng rễ cà chua có thể phát triển
rộng tới 1,3 m và sâu tới 1 m. Với khối lượng rễ lớn như vậy, cà chua được
xếp vào nhóm cây chịu hạn.
Lá cà chua đa số thuộc dạng lá kép, các lá chét có răng cưa, có nhiều
dạng khác nhau: dạng chân chim, lá khoai tây, lá ớt... tuỳ thuộc vào giống mà
lá cà chua có màu sắc và kích thước khác nhau.
Hoa cà chua ñược mọc thành chùm. Có ba dạng chùm hoa là ñơn giản,
trung gian và phức tạp. Số lượng hoa / chùm, số chùm hoa/cây rất khác nhau
ở các giống.
Quả cà chua thuộc loại quả mọng, có 2, 3 đến nhiều ngăn hạt. Hình dạng
và màu sắc quả phụ thuộc vào từng giống. Khối lượng quả dao ñộng rất lớn
tuỳ theo ñặc ñiểm của giống, từ 3 ñến 200g thậm chí 500g.
2.3. Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây cà chua

2.3.1. Nhiệt độ
Cây cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, khả năng thích nghi cao nên nó
được trồng ở khắp mọi nơi trên thế giới. Cà chua chịu ñược nhiệt độ cao
nhưng rất mẫn cảm với rét. Cây có thể sinh trưởng ñược trong phạm vi nhiệt
ñộ từ 15oC – 35oC, thích hợp là 22oC - 24oC [10].
Tỷ lệ ñậu quả ñạt tối ưu ở nhiệt 18 - 20oC, nhiệt ñộ cao vào 2 ñến 3
ngày sau khi nở hoa gây cản trở q trình thụ tinh, auxin khơng ñược hình
thành làm cho hoa rụng. Quả cà chua phát triển thuận lợi ở nhiệt ñộ thấp,
nhiệt ñộ trên 35oC ngăn cản sự phát triển của quả và làm giảm kích thước quả
rõ rệt [10].
Q trình sinh tổng hợp caroten rất mẫn cảm với nhiệt độ, do đó ảnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

5


hưởng lớn đến màu sắc quả. Sự hình thành lycopen và caroten diễn ra rễ dàng
ở 24-28oC làm cho quả có màu đỏ hoặc da cam đậm. Nhiệt độ cao trong quá
trình phát triển quả cũng làm giảm sự hình thành pectin nên quả nhanh mềm
hơn [10].
2.3.2. Ánh sáng
Theo nhiều tác giả cho rằng tất cả các giống cà chua trồng trọt đều thơng
qua giai đoạn ánh sáng, với chế ñộ chiếu sáng 11- 13h. Avakian nghiên cứu 25
giống trong nhà kính và 50 giống trên đồng ruộng đã đi đến kết luận: Khơng có
giống nào điển hình cho ngày ngắn hoặc ngày dài. Kết quả nghiên cứu trên ñã
khẳng ñịnh cà chua không phản ứng với ánh sáng (Avakian, 1952) [15].
Cà chua là cây ưa ánh sáng mạnh, nếu thiếu ánh sáng cây yếu ớt, lá
nhỏ, mỏng, lóng vươn dài, cây vống, ra hoa muộn, tỷ lệ ñậu quả thấp và chất
lượng kém [15]. Trong ñiều kiện ngày ngắn nếu khơng bón đạm thì chỉ cho
quả ít, trong điều kiện ngày dài mà khơng bón đạm thì cây khơng ra hoa và

khơng đậu quả [10].
2.3.3. Nước và độ ẩm
Cà chua có u cầu về nước ở các giai đoạn sinh trưởng rất khác nhau, xu
hướng ban đầu cần ít về sau cần nhiều. Ra hoa và hình thành quả là các thời
kỳ cây cà chua cần nhiều nước nhất. Thời kỳ này khơng đủ nước sẽ làm cho
hoa rụng, ít hoa, ít quả, quả khô.
Cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở ñộ ẩm ñất 70-80%, ẩm độ
khơng khí là 45-55%. ðộ ẩm khơng khí trên 90% dễ làm cho hạt phấn bị trương
nứt, hoa cà chua khơng thụ phấn được và sẽ rụng. ðộ ẩm thấp làm giảm năng suất
quả nhưng phần nào làm tăng phẩm chất quả vì hàm lượng đường và hàm lượng
chất khơ trong quả tăng lên. ðộ ẩm thấp cũng làm rút ngắn thời gian chín của quả
(Tạ Thu Cúc, 1983). Khi ñộ ẩm ñất quá cao, nước dư thừa cây sinh trưởng mạnh,
thân lá mềm yếu, giảm khả năng chống chịu, giảm chất lượng và phẩm chất quả,
khả năng bảo quản và vận chuyển kém [15].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6


2.3.4. ðất và dinh dưỡng
Cà chua là cây trồng thích nghi rộng, khơng kén đất nên có thể trồng ở
nhiều loại đất khác nhau (Bộ Nơng Nghiệp và PTNT, 2001) [2]. ðất phù hợp
với cây cà chua là ñất thịt nhẹ, ñất cát pha, tơi xốp, tưới tiêu dễ dàng.
Theo Figueira (1972) cho rằng, cây cà chua ñược trồng trong các ñiều
kiện sinh thái khác nhau, nền ñất khác nhau nhưng lượng các chất N, P, K mà
cây lấy ñi theo xu hướng chung là K >N>P [3]. Theo Becseev, ñể tạo 1 tấn
quả cà chua cần 3,8 kg N, 0,6 kg P2O5 và K2O (Kiều Thị Thư, 1998) [11].
Ngoài những ngun tố khống cần thiết là đạm, lân và kali thì với cây cà
chua các nguyên tố vi lượng có vai trị quan trọng đối với sự phát triển của cây,
đặc biệt góp phần cải tiến chất lượng quả. Cà chua phản ứng tốt ñối với các

nguyên tố vi lượng B, Mn, Zn, Mo...[15]. Khi thiếu các yếu tố vi lượng cây sinh
trưởng chậm, dễ nhiễm bệnh, rụng hoa, quả non làm giảm năng suất [10].
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm
2.4.1. Ethylene và cơ chế chín của quả
Ethylene là một phytohormon quan trọng trong cây, nó điều chỉnh
nhiều q trình sinh trưởng và phát triển của cây. Ethylene ñược tổng hợp
trong tất cả các tế bào và các mô nhưng nhiều nhất là các mơ già và đặc biệt
là trong quả đang chín.
Theo nghiên cứu của Barry và cộng sự (2005) [16]. Sơ ñồ con đường
tổng hợp ethylene gồm 2 bước chính: tổng hợp SAM và oxi hóa ACC.
Ngun liệu đầu tiên là acid amin methionine, methionine được hoạt hóa bằng
ATP để hình thành nên SAM (S-adenosyl ethionine). Sau đó SAM phân hủy
tạo ra ethylene, acid fomic và CO2.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7


Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006
2.4.1.1. Các phương pháp tạo giống cà chua chín chậm thơng qua điều khiển
tổng hợp ethylen
Hiện nay trên thế giới ñã sử dụng một số phương pháp ñể ñiều khiển q
trình chín chậm bằng cơng nghệ biến đổi gene, ñiều khiển sự tổng hợp
ethylene. Lượng ethylene tạo ra có thể được điều khiển bằng cách “đóng”
hoặc làm giảm sự tạo ethylene trong quả bằng một số cách sau:
1. Ức chế sự biểu hiện của gen ACC (1-aminocyclopropane-1carbonxylic acid) synthase. ACC synthase là enzyme chịu trách nhiệm chuyển
hóa S-adenosymethiomine (SAM) thành ACC từ bước thứ 2 tới bước cuối
cùng trong quá trình sinh tổng hợp ethylene. Sự biểu hiện của enzyme bị cản
trở khi một antisense hoặc một ñoạn của bản sao gene synthase ñược chuyển

vào trong genome của thực vật (Brady et al, 1985 ) [18].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

8


2. Chuyển gen ACC diaminase. Gene mã hóa cho enzyme này nhận được từ
một vi khuẩn đất (Pseudomonas chlororaphis) khơng gây bệnh. Vi khuẩn này có
khả năng chuyển hóa ACC thành một phân tử khác, nhờ vậy làm giảm lượng
ACC có thể nhận được để tạo ethylen ( Klee et al, 2002) [30].
3. Chuyển gen SAM hydrolase. Phương pháp này làm giảm tiền chất của
ethylen. Ở ñây SAM ñược chuyển hóa thành homoserine. Gene mã hóa cho
enzym này được phân lập từ thể thực khuẩn E. coli T3 [30].
4. Ức chế biểu hiện của gen ACC oxidase - enzyme xúc tác cho sự oxi
hóa ACC thành ethylene.Thơng qua cơng nghệ antisense, giảm sự ñiều khiển
gene ACC oxidase dẫn ñến ức chế sự hình thành ethylen, do đó làm làm chậm
sự chín của quả [30].
5. ðiều khiển việc nhận ethylen: Khi ethylen có tín hiệu bắt đầu cho việc
chín quả, việc làm chậm q trình chín có thể đạt được bằng cách biến ñổi
thụ thể của ethylen. Gen ETR1 là một ví dụ, nó mã hóa cho protein liên kết
ethylen. Gen này được biến đổi thì mất khả năng phản ứng với ethylen
(Wilkinson et al., 1995) [38].
6. Ức chế hoạt tính của polygalacturonase: enzym polygalacturonase
(PG) chịu trách nhiệm cho việc phân giải pectin, chất duy trì độ cứng thành tế
bào thực vật. ðể tạo ra quả chín chậm bằng phương pháp này, người ta ñã
chuyển gene antisense hoặc một ñoạn bản sao của gene PG vào trong genome
của thực vật dẫn ñến sự ức chế tạo ra enzym PG (Redenbaugh & Kramer
1994) [37].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

9


Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng
hợp Ethylen [12]
2.4.1.2. Nghiên cứu các thụ thể tiếp nhận ethylen (Ethylene Receptor)
Nghiên cứu trên cây Arabidopsis người ta đã phát hiện và nhân dịng
được 5 gen mã hóa cho các receptor liên quan đến việc cảm ứng sinh ra
ethylene trong q trình chín gồm có CTR1 (constitutive-tripe-respone)
(Kieber et al., 1993), EIN2 (ethylene-insensitive) (Alonso et al., 1999), EIN3
(Chao et al., 1997), ERF1 (ethylene-response-factor) (Solano et al., 1998) và
ETR1 (Chang et al., 1993) mã hóa cho các loại recetor có tên tương ứng.
Dựa vào đặc điểm cấu trúc protein, gia đình receptor ETR1 liên quan đến
cảm ứng ethylene ở Arabidopsis được chia thành 2 gia đình nhỏ (subfamily):
Subfamily I gồm ETR1, ERS1 có cấu trúc protein tương ñồng cao với enzyme
histidine kinase; subfamilyII gồm ETR2, EIN4, ERS2 có khả năng hoạt động
như enzyme serine kinase (Klee et al, 2007 ) [31].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10


Theo các nghiên cứu của Bleecker & Kende (2000), Giovannoni (2004)
và Stepanova and Alonso (2005) ñã chỉ ra cơ chế ñiều hòa của ethylene như
sau: Khi Ethylene gắn vào vùng cảm ứng của receptor (gồm 1 hệ thống các
receptor thuộc gia đình ETR) sẽ cảm ứng cho phản ứng xảy ra giữa vùng
histidine kinase với vùng điều hịa của receptor CTR1 (Raf-like kinase) tạo

thành phức hợp receptor. Phức hợp receptor CTR1 tác ñộng lên protein màng
EIN2 (là một kênh protein vận chuyển ngun tố khống). ðầu C của EIN2 là
tín hiệu dương cảm ứng với yếu tố sao mã EIN3 nằm trong nhân. Yếu tố sao
mã này hoạt ñộng sẽ cảm ứng sao mã cho gen ERF1 sinh ra yếu tố phản ứng
với ethylene.

Hình 2.3. Sơ đồ thể hiện cơ chế điều hịa, tác động của ethylen
(Bleecker và Kende, 2000) [17]
Các nghiên cứu trên cà chua cho thấy có ít nhất 6 loại receptor:
LeETR1, LeETR2 (Zhou et al., 1996; Lashbrook et al., 1998), NR (LeETR3)
(Wilkinson et al., 1995; Payton et al., 1996), LeERT4, LeETR5 (Tieman and
Klee, 1999) [38], và LeETR6 (Ciardi and Klee, 2000) [19]. Sự biểu hiện của
các receptor này phụ thuộc vào từng giai ñoạn sinh trưởng, phát triển, phụ
thuộc vào sự tác động từ mơi trường [36].
+ LeETR1 và leETR2: Biểu hiện ở tất cả các loại mơ đã bước sang giai
đoạn phát triển.
+ NR: Có liên quan đến giai đoạn trước hạt phấn.

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

11


+ NR và LeETR4: Liên quan ñến giai ñoạn trước chín, già hóa,sự rụng
(Payton et al,1996), sự xâm nhiễm của nguồn bệnh [19].
+ LeETR5: Biểu hiện trong quả, hoa khi có sự xâm nhiễm của nguồn
bệnh [38].

Hình 2.4. Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua
(Tieman và Klee, 1999) [38]

2.4.2. Các dạng ñột biến liên quan đến sự chín ở cà chua
Khi quả cà chua chín có sự biến đổi hóa sinh rất mạnh mẽ và nhanh
chóng gắn liền với những thay đổi về màu sắc, ñộ mềm và hương vị. Theo
nghiên cứu của nhiều tác giả thì các dạng đột biến liên quan đến sự chín ở cà
chua có thể chia thành 2 dạng chính: các đột biến liên quan đến sự tổng hợp
tăng cường của ethylene trong q trình chín và các ñột biến liên quan ñến
khả năng phục hồi biểu hiện của các gen liên quan đến sự chín của ethylene
(sự cảm ứng của ethylene tới các gen biểu hiện khi chín) (Adams-Phillips et
al., 2004a; Giovannoni, 2004) [12].
ðại diện cho nhóm thứ nhất gồm có các đột biến: rin (ripening inhibitor),
non-ripening (nor) và ñột biến liên quan ñến sự biến ñổi màu của quả chín. ðặc
điểm của các dạng đột biến này là ethylene khơng được tổng hợp khi chín nhưng
ln ñược duy trì ở mức cơ bản (baseline). Khi xử lý với ethylene có thể phục
hồi được biểu hiện của một số gen nhưng quả khơng chín. ðiều này có thể giải
thích là do các locus đột biến này điều hòa biểu hiện của các yếu tố trong quá
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12


trình quả chín mà độc lập với ethylene và các yếu tố đó có thể ức chế sự chín
hồn tồn của quả [12].
ðại diện cho nhóm thứ hai là các ñột biến liên quan ñến các thụ cảm tiếp
nhận ethylen như Nr. Với dạng ñột biến này, ethylene vẫn tăng trong khi chín
nhưng sự biểu hiện của các gen liên quan đến sự chín bị giảm. Chúng sẽ
khơng chín ngay cả khi xử lý với ethylen (Lanahan và cộng sự, 1994) [32].
* Dạng ñột biến rin (ripening inhibitor)
Theo nghiên cứu của Picton và cộng sự năm 1993 ñã thực hiện nhân dịng
các cDNA liên kết với dạng đột biến này phát hiện ñược 1 loạt các ERT:
ERT1, ERT10 và ERT15 là các cDNA có phản ứng sinh mARN trong q

trình chín của dạng đột biến này. Khi xử lí dạng ñột biến này với ethylene thì
1 phần các gen này ñược sao mã, chứng tỏ dạng ñột biến này vẫn có khả năng
phản ứng với ethylene ngoại sinh (Lincoln & Fischer, 1987) [33].
Ở thực vật, mỗi lồi đều có hộp gene chứa các gene mã hóa cho các yếu tố
sao mã, điều khiển q trình ra hoa và chín của quả được gọi là MADS-box
transcription factor. Ví dụ như ở Arabidosis, hộp gen MADS-box có 47 gen
(Rebekah et al, 2002) [36]. Trong khi đó ở cà chua, theo nghiên cứu của
Vrebalov và cộng sự năm 2002 [29] ñã phát hiện ra rằng gene rin là một gen
nằm trong hộp gen này. Cũng theo nghiên cứu này gene rin nằm trên nhiễm
sắc thể số 5 và sự biểu hiện của rin là do tác động của 2 locus kiểm sốt sự
chín và ñiều khiển sự phát triển của ñài hoa. Từ ñó thiết kế ñược các cặp mồi
phát hiện các gene này dựa vào phương pháp PCR.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

13


Hình 2.5. Bản đồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua [20]
* Dạng ñột biến Never ripe (Nr):
Dạng ñột biến này ñược phát hiện từ rất sớm bởi Rick & Butler,1956.
ðây là một dạng ñột biến bán trội xảy ra tại 1trong các receptor cảm ứng với
ethylene [38]. Dạng ñột biến Nr này ñã ñược sử dụng trong nhiều nghiên cứu
về vai trò của ethylene trong các giai ñoạn phát triển khác nhau như: (Aloni
et al., 1998) [13] nghiên cứu biểu hiện của gene; khả năng kháng stress [19].
Quả cà chua đột biến khơng chín hồn tồn ngay cả khi xử lí bởi ethylene
ngoại sinh.
* Dạng ñột biến: Never-ripe-2 (Nr-2) và Green ripe (Gr)
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng dạng đột biến Nr-2 có trình tự gen mã hóa
khơng tương đồng với đột biến Nr. ðột biến Nr-2 ñược chỉ ra là do gen Nr-2,

nằm trên vùng cánh dài của NST số 1 (Giovannoni và cộng sự năm 2005) [21].
Nghiên cứu sự di truyền của 2 dạng ñột biến Gr và Nr-2 cho thấy ñây là 2
dạng ñột biến trội. Khi lập bản ñồ di truyền của 2 dạng ñột biến cho thấy gen
qui ñịnh dạng ñột biến này nằm trên 1 vùng 2cM giữa 2 chỉ thị TG260 và
TG245 trên cánh dài của NST số 1 [16].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14


Hình 2.6. Bản đồ gene của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể
số 1 của cà chua [16]
2.5. Tổng quan tình hình nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng bệnh
virus xoăn vàng lá
Nhìn chung, các nghiên cứu tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá
ñi theo các hướng chủ yếu: (1) tạo giống kháng vector bọ phấn; (2) tạo giống
kháng virus xoăn vàng lá nhờ những nguồn kháng tự nhiên từ cà chua dại và
(3) tạo giống kháng bệnh nhờ nguồn kháng từ virus thông qua công nghệ
RNAi. Trong đó, tạo giống mang tính kháng tự nhiên được cho là hiệu quả
nhất để phịng chống bệnh (Pena và cộng sự, 2010) [34].
2.5.1. Nguyên nhân gây bệnh virus xoăn vàng lá
Bệnh xoăn vàng lá cà chua lần ñầu tiên ñược xác ñịnh tại Israel vào năm
1930 và hiện nay đã được xác định do một nhóm các lồi begomovirus khác
nhau thuộc họ geminivirus gây ra, ñược lan truyền bởi vector bọ phấn trắng
(Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (Hà Viết Cường, 2008) [5].
Mặc dù nhóm geminivirus này bao gồm các lồi riêng biệt, nhưng chúng vẫn
được gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus
(Vidavski, 2007) [39].

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15


TYLCVD cho đến nay được biết có liên quan tới ít nhất 11 loài và hơn
25 chủng monopartite begomoviruses (Fauquet và cộng sự, 2008) [20]. Bệnh
virus xoăn lá cà chua (Tomato leaf curl virus disease - ToLCVD) có những
triệu chứng khác rất nhỏ với TYLCVD, nó được chú ý sau này do được gây ra
bởi các lồi begomovirus bộ gen kép (bipartite begomovirus) và bởi sự khác
biệt trong chuỗi DNA [4], [34]. Các loài begomovirus bộ gen kép (bipartite
genome) gồm hai phân tử DNA sợi vịng đơn: DNA-A (2,6-2,8 kb) và DNAB (2,5-2,8 kb) (Gronenborn, 2007) [23], các lồi có bộ gen ñơn tương ñương
phân tử DNA-A.
Ở Việt Nam ñã phát hiện có 3 lồi begomovirus gây ra bệnh xoăn
vàng ngọn cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV); Tomato
yellow leaf curlKanchanaburi (TYLCKaV) vàTomato yellow leaf curl
Vietnam virus (TYLCVNV) [23].
2.5.2. Nghiên cứu về các nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá
Loài cà chua trồng (Solanum lycopersicum) cực kỳ mẫn cảm với virus
xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV). Tuy nhiên, mức ñộ
kháng cao với TYLCV ñã được tìm thấy trong các lồi cà chua dại S.
pimpinellifolium, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, và S.
cheesmaniae. Một vài accession của và S. pimpinellifolium cũng biểu hiện
mức ñộ chống chịu tốt với TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a) [24]. Trong các
lồi cà chua dại biểu hiện tính kháng với TYLCV, S. chilense, S.
habrochaites, và S. peruvianum cung cấp khả năng kháng tốt và ñã ñược sử
dụng rộng rãi trong chương trình tạo giống để phát triển các giống cà chua
thương mại kháng TYLCV [24], [34].
Tiếp đó, các dịng giống với khả năng kháng cao như TY172, TY197…
ñã ñược phát triển tại Trung tâm Volcani ở Israel từ loài S. Peruvianum [24].

Tính kháng trong TY172 được điều khiển bởi một QLT (Quantitative Trait
Locus)lớn và bốn QLT nhỏ, QLT lớn ñược ñặt tên là Ty-5, nằm trên nhiễm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

16


sắc thể số 4 (Anbinder và cộng sự, 2009) [14]. Các accession LA372, LA452,
LA462, LA1274, LA1333, LA1373, và CMV sel INRA (PI126926 ×
PI128648-6), cũng như S. peruvianumvar. humifusum LA385 đã ñược phát
hiện là có khả năng kháng cao với TYLCV. Các gen từ S. peruvianum đã
nhanh chóng được đưa vào các giống lai thương mại tên tuổi và cung cấp khả
năng kháng tốt với TYLCV [24].
S. chilense là nguồn gen kháng rất quan trọng trong nhiều chương trình
tạo giống trên thế giới. Năm 1991, Zakay và cộng sự ñã báo cáo khả năng
kháng cao với TYLCV trong các cá thể LA1969 [25]. Năm 1994, Zamir và
cộng sự [35] ñã lập bản ñồ gen Ty-1 trên nhiễm sắc thể số 6 và hai gen bổ
sung trên nhiễm sắc thể số 3 và 7 [25]. Hiện đã tìm ra ở S. chilense các
accession LA1932, LA1938, LA1959, LA1960, LA1961, LA1963, LA1968,
LA1969, LA2747, LA2774, và LA2779 có khả năng kháng ToMoV ở Florida
và đã ñược sử dụng ñể bắt ñầu một chương trình tạo giống kháng bằng
phương pháp lai khác lồi. Các đánh giá tại trung tâm rau thế giới (The World
Vegetable Center -AVRDC) cũng cho thấy LA1932 kháng tốt tại tất cả 8 ñịa
ñiểm thử nghiệm tại ðông Nam Á (Green và Shanmugasundaram, 2007) [22],
gợi ý rằng LA1932 có thể là một nguồn gen kháng tốt cho Việt Nam và cần
ñược nghiên cứu thêm.
Năm 1982, Hassan và cộng sự ñã ñánh giá các accessionLA0386,
LA1252, LA1295, LA1352, LA1393, LA1624, và LA1691 thuộc loài S.
habrochaitesvà thấy rằng chúng có khả năng kháng cao với TYLCV, tính
kháng từ các accession này là trội [25].

Tại Ấn ðộ, S. habrochaites f. glabratum B6013 đã được chứng minh có
hai gen lấn át (epistatic genes) kiểm sốt tính kháng Tomato leaf curl virus
(ToLCV). Sau đó, các nhà nghiên cứu ở ñây ñã phát triển dòng giống H24 từ
accession này. "H24" ñã ñược chứng minh mang gen kháng Ty-2. "H24" tạo
ra tính chịu bệnh rõ ràng với một số chủng (strains) TYLCV/ToLCV nhưng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

17