Tài liệu Kỷ thuật thực hành nuôi cấy mô ppt

LỜI MỞ ĐẦU

Từ rất lâu, con người đã biêt nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biện pháp. Từ cách gieo
hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây để trồng ,gọi là giâm cành ,chiết
cành…Hay chắp nối những thân cây này với thân cây kia bằng cách ghép cành. Những
ưu điểm vượt trội của nó rất được ứng dụng rộng rãi. Cùng một lúc chúng ta có thể nhân
giống cây lên hang lọt mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt ,chờ cho cây con lớn.
Bên cạnh đó người ta lại có một công nghệ hiện đại hơn, gọi là công nghệ nuôi cấy mô tế
bào. Cùng với sự phát triển của khoa hoc kỹ thuật, nền công nghệ này đã và đang ứng
dụng rộng rãi trong cây trồng…Cùng một lúc nó cũng tạo ra hang vạn cây trồng mới,
nhanh chống mà không nhất thiết phải là từ các hạt của cây mà có thể lấy bất kỳ mô bào
nào , trừ những mô tế bào đã hoá gỗ. Tuy nhiên nền công nghệ này đòi hỏi khá tốn kém,
sự kiên nhẫn và khéo léo .


CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

I.CƠ SỞ CỦA VIỆC NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế
bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng)một cách có định
hướng vào sự phân hoá và sự phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế
bào thực vật.
1.1 Tính toàn năng của tế bào:
Tế bào bất kỳ nào của cơ thể sinh vật đa bào nào cũng đều có khả năng phát triển thành
cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.Đó là tính toàn năng của tế bào.
(Theo Gottlied Haberlandt trong cuốn “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” )
1.2 Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào:
Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình
thành từ nhiều loại tế bào. Tất cr các tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế
bào hợp tử).Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa
mang chức năng riêng biệt(chuyên hoá).Sau đó ,các tế bào phôi sinh này tiếp tục được

biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô ,cơ quan khác nhau.Đó là sự
phân hoá.
Tuy nhiên ,khi tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng
không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình.Trong điều kiện thích hợp chúng có thể
trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ .Qúa trình đó gọi là quá trình phản
phân hoá tế bào.
1.3 Môi trường dinh dưỡng :
Là nhân tố quan trọng quyết định sự thành công của quá trình nuôi cấy .Hầu hết các môi
trường dinh dưỡng nhân tạo được sử dụng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao
gồm các thành phần sau:
Các nguyên tố muối khoáng
+Nguyên tố đa lượng
+Nguyên tố vi lượng
Nguồn cac bon
Vitamin
Bảng Thành Phần Một Số Môi Trường Thông Dụng


Thành phần Môi trường
(Mg/l) Murashige và
Skoog (MS)
Gamborg (B5) Woody plant
medium
(WPM)
Nitsch và
Nitsch
Khoáng đa
lượng

NH

4
NO
3
1650 - 400 -
NH
4
SO
4
- 134 - -
CaCl
2
.2H
2
O 332,2 150 96 166
Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O - - 556 -
MgSO
4
.7H
2
O 370 250 370 185
KNO
3
1900 2500 - 950
K

2
SO
4
- - 990 -
KH
2
PO
4
170 - 170 68
NaH
2
PO
4
- 130,5 - -
Khoáng vi
lượng

H
3
PO
3
6,2 3,0 6,2 10
CoCl
2
.6H
2
O 0,025 0,025 - -
CuSO
4
.5H

2
O 0,025 0,025 0,25 0,025
Na
2
EDTA 37,3 37,3 37,3 37,3
FeSO
4
.7H
2
O 27,8 27,8 27,8 27,8
MnSO
4
.H
2
O 16,9 10,0 22,3 18,9
KI 0,83 0,75 - -
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,25 0,25 0,25 0,25
ZnSO
4
.7H
2
O 8,6 2,0 8,6 10
Chất hữư cơ
Myo-inositol 100 100 100 100

Glycine 2,0 - 2,0 2,0
Acid nicotinic 0,5 1,0 0,5 5
B1 0,5 0,1 0,5 0,5
B6 0,1 10,0 1,0 0,5


Các chất điều hoà sinh trưởng
Ví dụ auxin,cytokinin…
1.4 pH của môi trường
1.5 Vô trùng mẫu cấy
II NHÂN GIỐNG INVITRO
2.1 Ý nghĩa của nhân giống in vitro
+Sử dụng mô nuôi cấy có kích thước nhỏ
+Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen hiếm ,làm vật liệu cho chọn giống
+nhân nhanh với hiệu qủa kinh tế cao
….
2.2 Các phương thức nhân giống in vitro
- Tái sinh cây mới từ cấu trúc sinh dưỡng
- Nhân giống thong qua mô sẹo (callus)
Nuôi cấy mô không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo
- Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính-Công nghệ hạt nhân tạo
- Nhân giống trong các nồi phản ứng sinh học

SƠ ĐỒ CÁC PHƯƠNG THIỨC TẠO CÂY HOÀN CHỈNH TRONG NHÂN GIỐNG IN
VITRO:

cây

chồi

Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy phôi
Nuôi cấy callus
Nuôi cấy cơ quan
Cây trưởng
thành
chồi ,cụm
chồi,phôi

củ nhỏ
cây


callus

tế bào đơn

tế bào đơn

cây

phôi

cây

callus

chồi

III.CÁC GIAI ĐOẠN TRONG QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO
3.1 Giai đoạn 1- Cấy khởi đầu:
- lựa chọn mẫu
Hầu hết là các cơ quan hay bộ phận của cây như:chồi ngọn ,phiến lá…
Mẫu phải ít mầm bệnh,cây mẹ khoẻ mạnh,không bị bệnh
Tuỳ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu .
-Nuôi cấy khởi động
Đưa mẫu từ ngoài môi trường vào phải đảm bảo yêu cầu sau:
+ Tỷ lệ nhiễm thấp
+ Tỷ lệ sống cao

+ Tốc độ sinh trưởng nhanh
3.2 Giai đoạn 2- Nhân nhanh:
Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm
kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát
sinh.Những khả năng tạo cây đó là:
+ Phát triển chồi nách
+ Tạo phôi vô tính
+ Tạo đỉnh sinh trưởng mới
- Bổ sung tổ họp hormone sinh trưởng mới:tăng cytokinin giảm auxin.
Tỷ lệ auxin/cytokinin<1 tăng cường quá trình tạo chồi.
Tỷ lệ auxin/cytokinin =1cân bằng hai quá trình tạo rễ và chồi
Tỷ lệ auxin/cytokinin > tăng cường quá trình tạo rễ
- Bảo đảm ở chế độ nhiệt 20-27
0
c
Tuy nhiên cần xác định số lần cấy chuyển hợp lý ,bởi vì nếu số lần cấy chuyền quá lớn
thì sẽ dẫn tới hiện tượng cây bị thoái hoá và sinh trưởng kém ,có thể mất đi những đặc
tính ban đầu của cây bố mẹ.
3.3 Giai đoạn 3- Tạo rễ:
Giai đoạn này bao gồm quá trình kéo dài chồi để tạo kích thước thích hợp và tạo rễ,tức là
quá trình tạo cây hoàn chỉnh.Môi trường lúc này không cần bổ sung cytokinin mà có thể
chỉ bổ sung auxin.Nồng độ auxin tối ưu được xác định dựa trên tỷ lệ tạo rễ ,số lượng rễ
và chiều dài rễ.
3.4 Giai đoạn 4- Đưa ra ngoài đất:
Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm công việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với
điều kiện khí hậu thay đổi :nhiệt độ ,ánh sang, độ ẩm…và chuyển từ trạng thái dị dưỡng
sang trạng thái tự dưỡng hoàn toàn. Qúa trình thích nghi ở đây phải được hiểu như là quá
trình thay đổi những đặc diểm sinh lý, giải phẫu, của bản than cây con đó .Thời gian tối
thiểu cho sự thích nghi là 2-3 tuần .Trong thời gian này cây phải được bảo vệ trước
những yếu tố bất lợi như:

+Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô
+Nhiễm vi khuẩn và nấm làm cho cây bị héo khô
+Cháy lá do nắng
IV.CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG NUÔI CẤY
- Đảm bảo điều kiện vô trùng
- Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách
- Chọn mô cấy, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy
4.1 Đảm bảo điều kiện vô trùng:
Ý nghĩa:
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối, khoáng…rất thích hợp cho các loại nấm
và vi khuẩn phát triển.Với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực
vật nên nếu môi trường bị nhiễm thì sau vài ngày đến một tuần ,toàn bộ bề mặt nuôi
cấy sẽ phủ đầy vi khuẩn và nấm, mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
Vô trùng các nguồn tạp chất:
- dụng cụ thuỷ tinh :rửa sạch và sấy ở 160
0
c/1 giờ (trừ các loại dung để đo thể tích)
- Nút đậy: bong không thấm nước .Nút phải tương đối chặt để bụi không đi qua
được và nước không bay đựơc trong quá trình nuôi cấy.
- Mô nuôi cấy :dung các chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn,..
- Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy
4.2 Môi trường dinh dưỡng (phần 1.3)
4.3 Chọn mô cấy và xử lý mô cấy:
Tuỳ từng loại mà chọn mô thích hợp.
Thong thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dung làm mô cấy,trừ những
mô đã hoá gỗ.
Tuy vậy, khi để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước
tiên người ta chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn.

KỸ THUẬT THỰC HÀNH NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

NUÔI CẤY HOA CÚC VÀ HOA LAN



I.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY



1. Pha dung dịch mẹ:
Ký hiệu Thành phần nồng độ (mg/l) Dung dịch
stock(mg/l)
số ml dung
dịch cần thiết
để pha 500 ml
môi trường
nuôi cấy
KNO
3
1900 38.000
KH
2
PO
4
170 3.400 25ml
MS1( 20X) NH
4
NO
3
1650 3.300
MgSO

4
.7H
2
O 370 7.400
MS2( 20X) CaCl
2
.2H
2
O 440 8.800 25ml
H
3
PO
3
6.2 1240
MnSO
4
.4H
2
O 22.3 4460
MS3(200X) CoCl
2
.6H
2
O 0.025 5
CuSO
4
0.025 5 2.5ml
ZnSO
4
8.6 1720

Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0.025 5
KI 0.83 166
MS4(40X) FeSO
4
.7H
2
O 27.8 1112 12.5ml
Na
2
-EDTA 37.3 1492
(100X) Myo-inositol 100 10.000 5ml
B1 0.1 10.000
MS5 B6 0.5 20 2.5ml
Acide nicotinic 0.5 100
Glycine 2 400

Sau khi cân hoá chất xong cho vào lọ thuỷ tinh và cho 500 ml nước cất vào ,đặt lên
máy khuấy tan rồi đổ vào bình có ghi tên từng loại dung dịch.
2.Pha môi trường:
Đối với 1lit môi trường: