Tài liệu Sản xuất enzyme protease từ vi sinh vật pdf

Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
I- GIỚI THIỆU
Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học
và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều
nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn.
Ngoài số enzyme đa được sử dụng rộng rãi và lâu đời( amylaza, prôtêaza…), còn
có hàng chục loại enzyme khác đã được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế.
Trước đây, các enzyme dùng nghiên cứu hoặc áp dụng trong sản xuất, thường thu
nhận từ động vật, thực vật. Nhưng vài chục năm gần đây, người ta đã chú ý đến
một nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền, đó là nguồn enzyme từ vi sinh
vật. Thực ra đây là một nguồn enzyme rất quen thuộc đối với một số nước phương
đông( Trung Quốc, Nhật Bản…).
Để mở rộng việc sử dụng các enzyme vào thực tế ở nước ta và đáp ứng yêu cầu của
một số cơ sở sản xuất trong những năm qua, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên
cứu tách và chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, nghiên cứu các điều
kiện thích hợp cho việc tổng hợp mạnh mẽ enzyme của chúng, thu nhận chế phẩm
enzyme .
Các protease khá phổ biến ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên sự phân
bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô, các cơ quan khác nhau. Một số
loài, cơ quan và mô của động thực vật có chứa một hay một số protesae nhất định
có thể dùng làm nguồn nguyên liệu để tách các enzyme tương ứng.
Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở
trong tế bào( protease nội bào ) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy( protease
ngoại bào ). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so
với protease nội bào.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 1
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều ngành kĩ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học.
Trong bài này chúng tôi xin giới thiệu một phương pháp tách chiết enzyme
prôtêaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

II- CHUẨN BỊ GIỐNG – TẠO SINH KHỐI
2.1. Phân lập giống VSV – Chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae.
Quá trình lên men là hoạt động sống của tế bào VSV trong môi trường. Quá trình
này xảy ra ở điều kiện tự nhiên và quá trình sản xuất công nghiệp. Bản chất của 2
quá trình này có thể nói là như nhau nhưng về mặt hình thức và phương diện thì
khác nhau hoàn toàn.
Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn của VSV. Tự
tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tự nhiên. Các VSV và
vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rất phức tạp, không đồng đều về
chủng loại và về số lượng. Mặt khác, quá trình lên men này không được kiểm soát,
bao gồm nhiều pha và không định hướng. Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn
định; do dó, chất lượng sản phẩm kém không đồng nhất.
Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lập giống
VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinh học, quá trình thu
nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn ( Sản phẩm tạo ra mang
tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâu chọn giống VSV cho đến cuối quá
trình thu nhận sản phẩm ) . Do đó chất lượng sản phẩm được cải thiện .
2.1.1. Vai trò của giống trong công nghệ enzyme.
Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:
- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 2
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học ( hay là hoạt
tính enzyme).
- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất.
- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm.
Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV.
2.1.2. Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme.
Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản
xuất theo quy mô công nghiệp. Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệ

enzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định. Đó là:
- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm này phải có
số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác. Vì trong quá trình trao đổi
chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàng nghìn lần cơ
thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSV cần tổng hợp
nhiều chất. Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác. Chính vì thế, giống
VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sản phẩm này phải trội hơn các
sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng.
- Giống phải cho năng suất sinh học cao.
- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều
kiện sản xuất công nghiệp.
- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại
địa phương nơi nhà máy đang hoạt động.
- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV
thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh.
- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng tách
sản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản.
 Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên men
công nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 3
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
2.1.3. Giới thiệu về chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.

Aspergillus oryzae
Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes ( nang
khuẩn ). Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh,
chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều
bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng
thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào

tử của Asp.oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía
đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những
tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Đầu các tế bào hình chai phân
chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Đính bào tử của
Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau…
Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu,
trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã
bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc,
có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị
gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 4
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
2.1.4. Quá trình phân lập giống VSV.
VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đến nơi có địa
thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV.Ở những nơi giàu chất hữu cơ, những nơi
nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt các vật, trong cơ thế người, động
vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ở nơi có nhiệt độ cao. VSV có khả năng
thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà
VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàn cảnh khắc nghiệt nhất.
Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì có 3 cách
phân lập:
+ Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên
+ Phân lập giống trong điều kiện sản xuất
+ Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng
Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập cho
phù hợp nhất. Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt. Sau
đây là 1 số ưu điểm:
a. Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên.
Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanh được thì cần

phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme để chuyển hóa nhanh cơ
chất có trong môi trường thành vật chất cung cấp cho tế bào. Điều này thì không
thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme ( ở quy mô sản xuất công nghiệp ) với
một loại enzyme thật sự mạnh.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 5
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó với hàng loạt
các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chất khác nên VSV bắt
buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lực rất lớn.
Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt
đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự
nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại. Chúng đã quá quen thuộc với
sự thay đổi thất thường của điều kiện tự nhiên. Khi chúng ta đưa chúng vào điều
kiện sản xuất công nghiệp với nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài
VSV giống phải có một thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp.
Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần
thiết.
Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thường tập trung
ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng. Dựa và đặc điểm này để chúng ta
có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loại VSV sinh tổng hợp enzyme mà ta
cần.
Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase cao, ta phải
tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phân lập VSV có khả
năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiều protein trong tự
nhiên.
Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSV trong
điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến. Những đột biến
thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết; thứ hai là nhiều đột biến
tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzyme rất cao. Việc tìm ra những đột
biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rất cần tiến hành. Và một lợi điểm nữa là,

những đột biến có lợi kiểu này thường rất bền vững. Rất thích hợp để đưa vào sản
xuất ở qui mô công nghiệp.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 6
Công nghệ protein – enzyme Sản Xuất Protease Từ vi si h vật
b. Phân lập giống trong điều kiện sản xuất.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều
kiện sản xuất. Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cần qua giai đoạn sản
xuất thử, thí nghiệm.
Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống đã được
chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn
hẳn các giống vi sinh vật hoang dại.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men, dịch nước
thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao. Do đó, khả năng thu nhận
được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thường rất cao.
c. Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng.
Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm, có thể rất nhiều
tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bào không bị thoái hoá.
Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạt được những kết quả tốt.
2.2. Giới thiệu phương pháp phân lập nấm mốc Aspergillus Oryzae
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease. Ở
nấm mốc nguồn cơ chất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp enzyme protease này
là protein. Chúng ta có thể phân lập từ đất, thức ăn hay có thể mua trực tiếp từ cung
cấp nấm mốc giống. Ưu điểm của việc này là giống mua thì thời gian bảo quản và
hiệu suất chất lượng giống được đảm bảo chắc chắn. Tuy nhiên, quá trình phân lập
giống này có thể cho những kết quả đầy thú vị và có ý nghĩa trong việc bổ sung
một chủng giống mới tại phòng thí nghiệm.
Nhóm Sinh Viên Lớp 07S1 Thực Hiện GVHD: Phạm Thị Kim Cúc Trang: 7