Góp phần nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

Tr-ờng Đại Học Vinh
Khoa Sinh Học

Góp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh
giống hoa đồng tiền gerbera bằng công
nghệ nuôi cấy mô invitro

Luận văn tốt nghiệp đại học
Ngành cử nhân s- phạm sinh học

Ng-ời thực hiện:

Trần Nữ Thanh Xuân

Ng-ời h-ớng dẫn: Th.S Mai Văn Chung

Vinh , 2006
1


Lời cảm ơn
Để hoàn thành đề tài này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi xin chân
thành cảm ơn sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của Thầy giáo, Th.S Mai Văn
Chung, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào, những ý kiến đóng góp quý báu của
các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Sinh lý- Sinh hoá thực vật, sự tạo điều
kiện và ủng hộ của khoa, của các cán bộ phòng thí nghiệmNuôi cấy mô, tế
bào thực vật và sự giúp đỡ, cung cấp t- liệu, mẫu vật của nhân dân huyện
Nghĩa Đàn.
Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong nhận đ-ợc ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để
đề tài nghiên cứu khoa học của tôi đ-ợc hoàn thiện hơn.

Xin chân thành cảm ơn.
Tác giả.

2


Những chữ cái viết tắt sử dụng trong luận văn

NCM - TB

:

Nuôi cấy mô - tế bào

CNSH

:

Công nghệ sinh học

IAA

:

Axit - indol axetic

NAA

:

Axxit - naphtyl axetic

IBA

:

BA/BAP

:

6 benzyl adenin(6 benzyl amino purin)

GA

:

Gibberelin

K

:

Kinetin

MS

:

Murashige – Skoog 1962

Ppm

:

part per million(phÇn triƯu)

mM

:

milimol

3


Mở đầu
Lý do chọn đề tài
Ngày nay, sử dụng hoa trong sinh hoạt và công tác hàng ngày đà trở
thành một thói quan tót,tạo nên một nét văn hoá mới trong th-ởng ngoạn,
giải trí cũng nh- trong tiêu dùng. Hoa đà trở nên quen thuộc và cần thiết
trong cuộc sống hàng ngày của mỗi con ng-ời.Để có thể đáp ứng đ-ợc nhu
cầu tiêu thụ hoa ngày càng tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị
thẩm mĩ, giá trị kinh tế và giá trị văn hoá đ-ợc đ-a vào sản xuất trên quy mô
lớn, dùng nhiều ph-ơng thức tạo giống khác nhau, trong đó, Nuôi cấy mô - tế
bào thực vật invitro đ-ợc đánh giá là một ph-ơng pháp tiên tiến, -u việt.
Trong các loại hoa đ-ợc -a chuộng trên thế giới hiện nay, Đồng
tiền(gerbera) đ-ợc coi là một trong 10 loài hoa đẹp nhất, chỉ xếp sau hoa
hồng, lay ơn, cúc, cẩm ch-ớng. Đồng tiền là loại hoa có nhiều -u điểm nổi
bật: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, cho
năng suất cao, nên đang ngày càng đ-ợc ng-ời tiêu dùng -a chuộng. Song

một khó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền hiện nay là nguồn giống cây cung
cấp cho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù sinh tr-ởng
mạnh trong giai đoạn đầu nh-ng sau đó cây sinh tr-ởng chậm, nhanh già cỗi,
do đó năng suất thấp, chất l-ợng và sản l-ợng hoa không cao, không ổn định.
Bên cạnh đó,bằng ph-ơng pháp tách thân, số l-ợng cây giống mỗi lần tạo ra
là không nhiều,do đó không đủ đáp ứng nhu cầu của thị tr-ờng sản xuất.[ ]
Ph-ơng pháp nhân giống vô tính invitro đà bổ sung cho kĩ thuật tạo cây
giống bằng cách tách thân trong sản xuất hoa đồng tiền và đang ngày càng
đ-ợc chú ý phát triển bởi kỹ thuật nhân giống vô tính invitro cho phÐp s¶n
4


xuất những cây giống đòng tiền khoẻ mạnh, sạch bệnh, có đọ đồng đều cao
va chất l-ợng tốt. Hiện nay ở Việt Nam đà có nhiều nghiên cứu về quy trình
nhân giống vô tính các loại hoa đa đ-ợc công bố và ứng dụng.[ ].Tuy nhiên
việc tiếp tục hoàn thiện cũng nh- đề xuất những quy trình kỹ thuật mới cho
các giống hoa vẫn thực sự cần thiết. Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn đó,
chúng tôi thực hiện đề tài Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa
đồng tiền - gerbera bằng công nghệ nuôi cấy mô - invitro.
Mục đích của đề tài là áp dụng cơ sở khoa học của công nghệ vi nhân
giống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh của cây,
nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này,
Nội dung của đề tài là nghiên cứu tim ra các điều kiện nuôi cấy invitro
thích hợp trong các giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro, ra rễ, tạo cây
hoàn chỉnh, huấn luyện thích nghi,từ đó đề xuất một quy trình nhân giống
hoàn thiƯn ®èi víi hoa ®ång tiỊn.

5

CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu

1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô invitro[ ].
1.1.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật
Theo Habertland, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật nào cũng đều
mang toàn bộ l-ợng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ
thể hoàn chỉnh.
Tính toàn năng của tế bào mà Habertland đ-a ra chính là cơ sở lý luận
của Nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay con ng-ời đà hoàn toàn
chứng minh đ-ợc khả năng tái sinh mọt cơ thể thực vật từ một tế bào riêng
rẽ.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro
thực chất là kết quả của sự phân hoá và phản phân hoá tế bào[]
1.1.2 Phân hoá và phản phân hoá tế bào
Tất cả các loại tế bào trong một cơ thể sinh vật đều bắt nguồn t- một tế
bào phôi sinh, từ tế bào phôi sinh này sẽ chuyển thành tế bào của các mô
chuyên hoá đảm nhận các chức năng khác nhau. Đó gọi là sơ phân hoá tế
bào.
Tuy nhiên trong tr-ờng hợp cần thiết ở diều kiện nhất định, các tế bào
của các mô chuyên hoá lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại có khả
năng phân chia mạnh mẽ. Quá trình này đ-ợc gọi là phản phân hoá tế bào.[]
1.1.3 Môi tr-ờng nuôi cấy [ ]
Môi tr-ờng nuôi cấy là một trong những điều kiện đặc biệt cần thiết ,
quyết định đến sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. Môi tr-ờng nuôi cấy
phải có đầy đủ các chất dinh d-ỡng cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế
bào cũng nh- hco quá trình sinh tr-ởng bình th-êng cđa c©y.

6

Thành phần của môi tr-ờng nuôi cấy thay đổi tuỳ đối t-ợng nuôi cấy,
bộ phận nuôi cấy, ngoài ra còn tuỳ thuộc giai đoạn phát triển của cây và mục
đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo.
Tuy nhiên tất cả các môi tr-ờng nuôi cấy bao giờ cũng có các thành
phần :
_ Nguồn carbon (th-ờng là đ-ờng)
_ Khoáng đa l-ợng.
_ Khoáng vi l-ợng.
_ Vitamin.
_ Chất điều tiết sinh tr-ởng.
Có thể bổ sung thêm một số hợp chất : axit amin, EDTA, n-ớc dừa hay
dịch chiết nấm men, . . .
a. Đ-ờng
Đ-ờng là nguồn cung cấp carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên
các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối của mô nuôi cấy nhân
tạo. Các loại đ-ờng th-ờng dùng là saccaroze va glucoze nh-ng saccaroze
đ-ợc dùng phổ biến hơn. Nồng độ đ-ờng có thể thay đổi từ 1-6%, thông
dụng nhất là 2-3 % .
b. Các khoáng đa l-ợng
+. Nitơ : Cây sử dụng đ-ợc d-ới hai dạng NH4+ và NO3- với tỷ lệ tuỳ
loại cây và tuỳ giai đoạn phát triển.
Nitrat đ-ợc cung cấp chủ yếu d-ới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3,
NaNO3 hoặc NH4NO3, (NH4)2SO4 và trong một số tr-ờng hợp còn d-ới dạng
ure. Nồng độ trong môi tr-ờng khoảng 3-6 mM.
+ L-u huỳnh ( S )
L-u huỳnh đ-ợc cây hấp thu d-ới dạng SO42-; còn SO32- và SO2 th-ờng
gây độc cho cây.
L-u huỳnh tham gia vào cấu trúc của một số loại axit amin và tham gia
vào quá trình khử, tổng hợp chất hữu cơ t-ơng ứng, ngoàI ra, l-u huỳnh còn

7


điều tiết quá trình trao đổi chất và năng l-ợng, xây dựng các chất kháng sinh,
vitamin, . . .
+Kali ( K )
Cung cấp cho cây d-ới dạng KNO3, KCl, KH2PO4, với nồng độ biến
thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10 mM.
+ Magie ( Mg )
Mg đ-ợc cung cấp cho cây d-ới dạng MgSO4.7H2O, nồng độ 0,5-3 mM
Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, là
cầu nối giữa enzim và cơ chất, làm tăng hoạt tính enzim, Mg còn ảnh h-ởng
đến quá trình hấp thu, đồng hoá P, O2, . . .
+ Sắt ( Fe )
Trong môi tr-ờng cổ điển, dùng Fe d-ới dạng FeCl 2.FeCl3.6H2O;
FeSO4.7H2O; Fe2(SO4)2; Fe(C4H4O), còn hiện nay dùng Fe ở dạng EDTA, ở
dạng này Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần ra môi tr-ờng tuỳ nhu cầu
của mô thực vật.
+Canxi ( Ca )
Đ-ợc cung cấp cho cây d-ới dạng Ca(NO3).4H2O, CaCl2.6H2O,
CaCl2.2H2O, nồng độ 1-3,5 mM.
c. Các khoáng vi l-ợng
Các nguyên tố vi l-ợng đ-ợc tìm thấy trong cây d-ới dạng các phức
chất hữu cơ- khoáng, các phức chất này có thể tham gia vào các phản ứng mà
bản thân các chất thành phần không thể tham gia đ-ợc. Đặc biệt vai trò của
các nguyên tố vi l-ợng quan träng nhÊt lµ tham gia vµo cÊu tróc cđa các
enzim và tham gia vào tất cả các quá trìng sinh tổng hợp và chuyển hoá các
chất trong tế bào, do đó có thể nói các nguyên tố vi l-ợng là cơ sở của sự
sống.
Bảng : Một số các nguyên tè vi l-ỵng th-êng dïng []

8


Nguyên tố

Dạng sử dụng

Nồng độ (mM)

Mn

MnSO4.4H2O

15-100

B

H3PO3

6-100

Zn

ZnSO4.7H2O

15-30

Cu

CuSO4.5H2O

0,04-0,08

Mo

(NH4)6Mo7O24.4H2O
NaMoO4.2H2O

0,07-1

Co

CoCl2.6H2O

0,1-0,4

I

KI

2,5-20

d. Các vitamin
Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả
năng tổng hợp đ-ợc hầu hết các vitamin nh-ng th-ợng không đủ về l-ợng,
do đó cần phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, nhất là các vitamin nhóm B.
Bảng : Một số vitamin th-ờng đ-ợc dùng trong môi tr-ờng nuôi cấy [ ]
Tên vitamin

Nồng độ sử dông (mg/l)

Myo_Inositol

100

Axit nicotinic ( niaxin )

0,5-1

Pyridoxine HCl ( vitamin B6 )

0,05-0,5

Thiamine HCl ( B1 )

10-50

Pandothenat canxi

1-5

Riboflavin ( B2 )

1-5

Biotin

0,1-1

Axit folic

0,1-1

9


Các vitamin th-ờng đ-ợc pha trong hỗn hợp các dung dịch mẹ có nồng
độ cao gấp 500 đến 1000 lần so với dung dịch lam việc, cần giữ trong điều
kiện lạnh d-ới 0oC để tránh nấm khuẩn nhiễm tạp.
e. Các chất điều khiển sinh tr-ởng
Bảng : Một số chất điều khiĨn sinh tr-ëng th-êng dïng [ ]

Tªn chÊt sinh tr-ëng

Nång ®é sư dơng ( mg/l )

2,4 D [dichlorophenoxy axetic]

0,2-5

_NAA [ naphtylaxetic axit]

0,1-5

_NAA [ indol axetic axit]

5-20

IBA [ indol butyric axit]

1-5

Kinetin [6 finfurylaminopurine]

0,1-2

BA [ 6_BAP ][ 6 benzyl amino purine]

0,1-2

2_iP [ N6 _ Dimetylallylaminopurine]

0,1-2
0,1-2

GA [ Gibberelic axit ]

Th-êng pha c¸c dung dịch mẹ chất sinh tr-ởng có nồng độ cao gấp 1000
lần so với dung dịch làm việc.
g. Các hỗn hợp chất tự nhiên
+ N-ớc dừa:
Từ 1941, n-ớc dừa đà đ-ợc sử dụng để nuôi phôi Daruta và năm 1949
nuôi mô của Daucus. L-ợng n-ớc dừa dùng trong môi tr-ờng khá lớn, 10-20
% thể tích môi tr-ờng.
+ Dịch chiết nấm men
Là các chế phẩm th-ờng dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào
động vật. 1934,White lần đầu tiên đà nuôi cấy thành công rễ cà chua trong
ống nghiệm kéo dài vô thời hạn trên nền dịch chiết nấm men. Thµnh phµn

10


hoá học không rõ, chủ yếu chứa đ-ờng, axit nucleic, axit amin, vitamin,
auxin và khoáng.L-ợng th-ờng dùng là 1g/l môi tr-ờng.
h. Một số môi tr-ờng nuôi cấy cơ bản
+ Môi tr-ờng Murashige-Skoog( MS ): Là một trong những loại môi
tr-ờng đ-ợc sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Thích
hợp cho cây Một lá mầm và cây Hai là mầm.
+ Môi tr-ờng Anderson : Chuyên dùng cho việc nhân giống vô tính các
cây họ Rhododendron ( Mẫu đơn ) và một số cây thân gỗ loại nhỏ. Nồng độ
các loại muối khoáng dùng trong môi tr-ờng này thấp, chỉ bằng một nửa so
với môi tr-ờng MS.
+ Môi tr-ờng Gamborg: Đ-ợc thử nghiệm lần đầu tiên cho cây đậu t-ơng
nh-ng đ-ợc dùng nhiều trong nhân giống vô tính, đặc biệt trong nuôi và tách
tế bào trần.
+ M«i tr-êng nu«i cÊy phong lan ( P )
+ M«i tr-ờng N6 _ Chu : Hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa và
cây hoà thảo

Bảng : Thành phần một số loại môi tr-ờng thông dụng dùng trong
Nuôi cấy mô_ Tế bào thực vật[]

STT

Thành phần

MS

A

G

P

N6

Muối khoáng
1

NH4NO3

1650

400

134

825

-

2

(NH4)2SO4

-

-

-

-

463

3

H3PO3

6,2

6,2

3,1

3,1

1,6

4

CaCl2

166

125,3

322,2 332,2 113,2
11

5

Ca3(PO4)2

-

-

-

-

-

6

CuSO4.5H2O

0,025 0,025 0,025 0,0125

-

7

CoCl2.6H2O

0,025 0,025 0,025 0,0125

-

8

Natri tactrat.2H2O

37,26

74,5

37,26

37,26

37,26

9

S¾t tactrat.2H2O

-

-

-

-

-

10

FeSO4.7H2O

27,8

55,7

27,8

27,8

27,8

11

MgSO4

180,7 180,7 122,1

90,35

90,35

12

MnSO4

16,9

16,9

10

8,45

33,3

13

Na2(NH4)4Mo7O24.H2O

0,25

0,25

0,25

0,125

-

14

KI

0,83

0,3

0,75

0,415

0,8

15

KNO3

1900

480

2500

950

2830

16

K2HPO4

-

330

130,5

85,5

400

17

KCl

-

-

-

-

-

18

ZnSO4.7H2O

8,6

8,6

2,0

5,3

1,5

Chất hữu cơ và vitamin
19

Glyxin

2

-

-

-

2

20

Vitamin B1

0,4

0,4

10

1

1

21

Bios I

100

100

100

100

100

22

Vitamin B6

0,5

-

1

0,5

0,5

23

Axit nicotinic

0,5

-

1

0,5

0,5

24

MES

-

-

-

1000

-

25

Pepton

-

-

-

2000

-

Các chất ®iÒu tiÕt sinh
tr-ëng
26

Adenin hemisulphat

-

-

-

-

-

27

6_Dimetylallylaminopurine

-

80

-

-

-

28

2,4_ Dichlophenoxy axetic
-

2

-

-

2

axit
12


29

_indolaxetic axit

-

-

-

-

-

30

_ Naphthalen axetic axit

-

-

-

0,5

-

31

6_Benzyl amino purine

-

0,5

-

2

-

32

Saccaroza (g/l)

30

30

30

20

20

33

Agar ( g/l )

8

8

8

-

8

PH

5,6

5,8

5,8

5,8

5,8

1.2 Quy trình chung của NCM_TB invitro
Về nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính invitro gồm 4 giai đoạn []
1.2.1 Giai đoạn vào mẫu và cấy gây
Đây là giai đoạn rất quan trọng, đóng vai trò quyết định đối với toàn
bộ quy trình. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo đ-ợc nguyên liệu thực
vật vô trùng để đ-a vào nuôi cấy invitro.
Yêu câù của giai đoạn này lµ:
- Tû lƯ nhiƠm thÊp
- Tû lƯ sèng cao
- Tèc độ sinh tr-ởng cao

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy các mẫu, quan trọng
nhất là đỉnh sinh tr-ởng, chồi nách, sau đó là hoa tự. đoạn thân, cành,mảnh
lá, rễ,Để khử trùng mô, ng-ời ta th-ờng dùng mét sè ho¸ chÊt: HgCl 2,
CoCL2, NaOCl, H2O2, . . .tuỳ thuộc vào từng loại mô thực vậtmà lựa chọn
nồng độ và thời gian xử lý hoá chất thích hợp. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi
nuôi cấy, có thể bổ sung vào môi tr-ờng than hoạt tính hoặc ngâm mẫu tr-ớc
khi cấy vào hỗn hợp axit ascobic và axit citric nồng độ 25-150 mg/l
Chọn đúng ph-ơng pháp khử trùng sẽ đ-a lại tỷ lệ sống cao, chọn môi
tr-ờng dinh d-ỡng thích hợp sẽ giúp cho mẫu đạt tốc độ sinh tr-ởng nhanh.
Môi tr-ờng nuôi cấy th-ờng dùng là môi tr-ờng MS.
1.2.2 Giai đoạn nhân nhanh

13


Toàn bộ quá trình nhân giống invitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân
chồi invitro cao nhất, vì vậy đây đ-ợc coi là giai đoạn then chốt của quá
trình.
Để tăng hệ số nhân,phải đ-a thêm vào môi tr-ờng dinh d-ỡng nhân tạo
các chất điều hoà sinh tr-ỡng: auxin, xitikinin, gibberelin,,các hợp chất tự
nhiên: n-ớc dừa, dịch chiết nấm men,kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh
sáng thích hợp. Trong giai đoạn này, ng-ời ta kích thích tạo cơ quan phụ
hoặc có cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh.Những khả
năng tạo cây mới là: phát triển chồi nách, tạo phôi vô tính hoặc tạo đỉnh
sinhtr-ởng mới.
1.2.3 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi, cần chuyển chồi sang môi tr-ờng tạo rễcó bổ sung
một l-ợng nhỏ auxin, th-ờng sau 2-3 tuần,từ những chồi riêng lẻ sẽ xuất hiện
rễ và tạo thành cây hoàn chỉnh.Auxin là nhom hoormon thực vật quan trọng
có vai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy, trong đó các chất IAA;

IBA; _NAA; 2,4D đ-ợc sử dụng nhiều nhất.
1.2.4 Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Quá trình thích nghi đ-ợc hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm
sinh lý và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích
nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây cần đ-ợc chăm sóc bảo vệ cẩn thận
tr-ớc một số yếu tố bất lợi: mất n-ớc, nhiễm khuẩn, nấm , nắng,
Trong giai đoạn huấn luyện thích nghi này, cây hoàn chỉnh với đầy đủ
rễ, thân , lá đ-ợc đ-a từ ống nghiệm ra đất. Giai đoạn này cây cần có giá thể
và chế độ chăm sóc phù hợp. Yêu cầu của giai đoạn này là:
- Cây trong ống nghiệm đà đạt đ-ợc những tiêu chuẩn hình thái nhất
định
- Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp, đạt yêu cầu tơi, xèp,
tho¸t n-íc.
14


- Phải giữ ẩm cho cây khi mới đ-a ra từ ống nghiệm, cần che chắn để
giữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh.Cụ thể độ ẩm đất phải đạt 76-80
%, độ ẩm không khí phải đạt 82-85 %.
1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống invitro trên thế giới và ở Việt
Nam
1.3.1 Trên thế giới:
Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mố phát triển trong mộ
vài thập niên trở lại đây, với thời gian ngắn nh-ng có ý nghĩa thực tiễn và
triển vọng phát triển to lớn, công nghệ sinh học đà có nhiều thành tựu đáng
kể, đặc biƯt trong lÜnh vùc trång trät. HiƯn nay c«ng nghƯ sinh học là lĩnh
vực đ-ợc đầu t- khá lớn ở hầu hết các n-ớc trên thế giới.Cây giống nuôi cấy
mô- tế bào không còn xa lạ đối với các nông hộ.
Đối với lĩnh vực nhân giống cây trồng, Công nghệ nuôi cấy mô- tế
bào đà cho phép sản xuất giống nhiều loại cây trồng nh-: khoai tây, bắp cải,

củ kiệu, các cây công nghiệp nh-: bông , hông , tếch,...,các loại cây thuốc
quý: sa nhân, sâm,..., nhiều loại hoa: cúc, hồng, phong lan, ...,cây cảnh, các
loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao: nho, chuối , cam , chanh,...[]
Đối với các lĩnh vực khác có ứng dụng những thành tựu của nuôi cấy
mô- tế bào cũng có nhiều thành tựu đáng chú ý: phục tráng cây, tạo dòng cây
sạch bệnh [], lựa chọn dòng lúa , ngô đáp ứng yêu cầu cụ thể của môi tr-ờng,
cấy ghép cam, chanh, nhân nhanh cây từ phôi,....
Công nghệ Mô- tế bào, ngoài việc sử dụng để nhân nhanh các giống
cây trồng, còn đ-ợc sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác đạt nhiều thành công,
đóng góp đáng kể cho nhiều ngành sản xuất, phục vụ nhu cầu ngay càng lớn
của con ng-ời: sản xuất sinh khối các loại thức ăn cho ng-ời và động vật,
nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài cây, con, tạo ngân hàng gen va
tinh trùng, thụ tinh nhân tạo, chuyển gen,...Trong t-ơng lai đây sẽ là một
trong những ngành có nhiều tiềm năng phát triển nhất, và n-ớc nào phát
15


triển đựơc càng cao về công nghệ nuôi cáy mô- tế bào, n-ớc đố sẽ phát triển
về cong nghiệp, nông nghiệp, và có nền kinh tế vững mạnh.
1.3.2 ở Việt Nam
ở n-ớc ta, ứng dụng thành tựu của Nuôi caýy mô- tế bào còn là một lĩnh vực
khá mới mẻ và có nhiều tiềm năng phát triển.Do điều kiện chiến tranh kéo
dài, các ngành khoa học nói chung và Nuôi cấy mô- tế bào nói riêng của
n-ớc ta đà đi chậm hơn so với thế giới, tuy vạy chúng ta cũng đà đạt đ-ợc
một ssố thành tựu đáng kể, nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mo- tế bào đÃ
đ-ợc xây dựng tại các Viện: Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh học nhiệt
đới thành phố Hồ Chí Minh, Viện Nghiên cứu Đà Lạt,...Ngoài ra nhiều
tr-ờng Đại họccũng đà bắt đầu chú ý đầu t- xây dựng các phòng thí nghiệm
Nuôi cấy mô- tế bào để cho sinh viên có thể tiếp cận với công nghệ mới mẻ
này.ở nhiều tỉnh, thành phố đà xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô- tế

bào , thực hiện những nghiên cứu và chuyển giaocong nghệ nuôi cấy mô- tế
bào trên các đối t-ợng có kinh tế của địa ph-ơng( Thanh Hoá, Nghệ An, Hà
Tĩnh, Bình Định,...)
Hiện nay, Công nghệ sinh học nói chung, Nuôi cấy mô- tế bào nói
riêng đà thu đ-ợc nhiều thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh các
loại cây: cà phê, cỏ ngọt, chuối(Trung tâm công nghệ sinh học), dứa(Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đ-ờng(Trung
tâm công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh
học thực nghiệm), cây vani(Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu), nho không
hạt(Trung tâm công nghệ sinh học), dâu tằm, măng cụt, lúa, khoai tây và các
loại cây có củ khác.Đối với các giống hoa, ngoài phong lan và cúc là hai đối
t-ợng th-ờng đ-ợc nuôi cấy mô- tế bào, hiện nay có rất nhiều loại hoa đ-ợc
nghiên cứu nhân nhanh bằng công nghệ này, chủ yếu phụ thuộc vào giá trị
của các loại hoa chứ không phải phụ thuộc vào mức độ dễ thành công nhtr-ớc đây: rẻ quạt (Viện ngiên cứu hạt nhân Đà Lạt ),Cẩm ch-ớng(Đại học
Tổng hợp Đà Lạt ), cúc chùm Hà Lan, loa kèn,[]......
16


Ch-ơng II: Đối t-ợng, nội dung và
ph-ơng pháp nghiên cứu

I.Đối t-ợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.
2.1.1Đối t-ợng nghiên cứu.
Đối t-ợng nghiên cứu của đề tài là hoa đồng tiền (gerbera) kép, hoa đỏ,
vàng có nguồn gốc từ Hà Lan đ-ợc nhập nội từ 2003 . Các bộ phận đ-ợc sử
dụng để tiến hành nghiên cứu là : chồi , đỉnh sinh tr-ởng, chồi nách,
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu
_ Các giai đoạn: khử trùng, vào mẫu, nhân nhanh, ra rễ, tạo cây hoàn
chỉnh đ-ợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô_ tế bào thực vật
Khoa sinh học, tr-ờng Đại học Vinh.

_ Các nghiên cứu về khả năng thích ứng của cây invitro với điều kiện
môi tr-ờng bình th-ờng đ-ợc tiến hành tại nhà l-ới _ Koa Sinh học_ tr-ờng
Đại học Vinh.
2.1.3 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 3-2005 đến tháng 4-2006
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của đề tài là:
17


ảnh h-ởng của thời gian, nồng độ, hoá chất khử trùng đến các chỉ tiêu:
tỷ lệ sống, tỷ lệ nhiƠm, tû lƯ bËt chåi cđa mÉu.
 ¶nh h-ëng cđa BAP đến sự phát triển của chồi invitro trong quá trình
nhân nhanh.
ảnh h-ởng của - NAA đến sự ra rễ của chồi invitro.
ảnh h-ởng của giá thể đến sức sống của chồi exvitro.
2.3 Ph-ơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Vật liệu khởi đầu
Vật liệu khởi đầu,tức là các cây giống để từ đó lấy các chồi, đỉnh sinh
tr-ởng, là các cây đồng tiền tr-ởng thành đ-ợc trồng tại nhà l-ới. Các cây
muốn đ-ợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu phải đạt đ-ợc các yêu cầu về hình
thái, phải khoẻ mạnh, không mang mầm bệnh, phát triển tốt. Mẫu đ-ợc lấy
vào những ngày nắng ráo , tr-ớc đó 3 ngày không có m-a để hạn chế sự
nhiễm khuẩn.
2.3.2 Giai đoạn khử trùng mô nuôi cấy_ vào mẫu
Bộ phận đ-ợc dùng là đỉnh sinh tr-ởng . Đồng tiền có đỉnh sinh tr-ởng
yếu, ít, khó tách, mặt khác có nhiều lông tơ là nơi có nhiều vi khuẩn, do đó
việc vào mẫu gặp nhiều khó khăn, hoá chất và thời gian xử lý phải vừa đủ để
diệt hết vi khuẩn, nấm mà không ảnh h-ởng đến đỉnh sinh tr-ởng. Các công
thức đ-ợc sư dơng lµ :

 CT M1 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (10 phót) + HgCl2 0,1%
(10 phót)
 CT M2 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1%
(10 phót)
 CT M3 : Cån 700 (3 phót) + H2O2 15% (15 phót) + HgCl2 0,1%
(15 phót)
 CT M4 : NaOCl 10% (10 phót) + NaOCl 5% (8 phót) + NaOCl 1%
(3 phót)
18


Môi

tr-ờng

đ-ợc

sử

dụng

để

vào

mẫu

cấy

gây

là

MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 2mg/l BAP + 10% n-ớc dừa
giai đoạn này , các chỉ số đ-ợc đánh giá là:
_ Tỷ lệ cây chết
_ Tỷ lệ cây bật chồi
_ Tỷ lệ cây đ-ợc sử dụng để cấy chuyển
Thời gian nghiên cứu giai đoạn này là 2-3 tuần
2.3.3 Giai đoạn nhân nhanh
Giai đoạn này chúng tôi bố trí các công thức nuôi d-ỡng chồi đồng tiền
có các chất điều tiết sinh tr-ởng khác nhau và với nồng độ khác nhau trên
nền công thức dinh d-ỡng giống nhau để nghiên cứu ảnh h-ởng của các chất
điều tiết sinh tr-ởng đến sự sinh tr-ởng của chồi invitro.
Các chất điều tiết sinh tr-ởng và nồng độ ở các công thức nh- sau:
CT N1: 1,5 mg/l BAP
CT N2 : 1,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IAA
CT N3 : 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IAA
CT N4 : 1,5 mg/l BAP + 1,0 mg/l IAA
CT

N5

:

5mg/l

CT N6 : 5mg/l K

K

+

0,5

+ 1,0 mg/l IAA

M«i tr-ờng dinh d-ỡng nền để nghiên cứu giai đoạn này lµ:
MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% n-íc dừa
Các chỉ tiêu cần nghiên cứu là:
_ Số lá/ cây
_ Số chồi / cây sau thời gian nuôi cấy
_ Hệ số nhân nhanh
_ Hình thái cây
Thời gian nghiên cứu giai đoạn này là 4 tuần
2.3.4 Giai đoạn ra rễ- tạo cây hoàn chỉnh
19

mg/l

IAA


Các công thức nghiên cứu giai đoạn ra rễ bao gồm thành phần cơ bản là
môi tr-ờng nền MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + than ho¹t tÝnh + 10%
n-ớc dừa; các môi tr-ờng khác nhau ở nồng độ các chất điều tiết sinh tr-ởng
bổ sung để nghiên cứu ảnh h-ởng của các chất điều tiết sinh tr-ởng đến sự ra
rễ của chồi invitro.
Các chất điều tiết sinh tr-ởng và nồng độ sử dụng nh- sau:
CT R1: 0,5mg/l NAA

CT R2: 1,0mg/l NAA
CT R3: 1,5mg/l NAA
Các chỉ tiêu cần theo dõi:
_ Số rễ trên 1 cây
_ Chiều dài rễ
_ Hình thái cây, rễ
Điều kiện nuôi cấy:ở cả ba giâi đoạn cấy gây, nhân nhanh và ra rễ các
chồi invitro đều đ-ợc nuôi cấy trong điều kiện ổn định về nhiệt ®é, ¸nh s¸ng:
-NhiƯt ®é: 250C ± 20C
-¸nh s¸ng: 2000-2500 lux
-Thêi gian chiếu sáng 12h/ngày
2.3.5 Giai đoạn huấn luyện
ở giai đoạn này chúng tôi bố trí các cây exvitro vào các giá thể khác
nhau trong cùng điều kiện nuôi cấy để nghiên cứu ảnh h-ởng của các giá thể
khác nhau đến tỷ lệ và sức sống của cây exvitro.
Các công thức gi¸ thĨ:
CT H1 : C¸t
CT H2 : TrÊu hun
CT H3 : Cát + trấu hun
Điều kiện huấn luyện:
_ Độ ẩm kh«ng khÝ: 80-85%
20


_ Độ ẩm giá thể: 65-80%
_ Nguồn khoáng bổ sung là dung dịch NPK với tỷ lệ 1:1:1 với nồng độ
2% phun trực tiếp lên lá.
Các chỉ tiêu theo dõi:
_ Tỷ lệ cây sống thích nghi với môi tr-ờng.
_ Các chỉ tiêu về hình thái: chiều cao cây, số lá/cây, màu sắc lá, sự phát

triển của rễ, ...
2.3.6 Ph-ơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đ-ợc xử lý bằng toán thống kê:

- Giá trị trung bình:
X =


xi (i là số lần thực hiện thí nghiệm)
n

- Độ lệch chuẩn:



21


Ch-ơng III: kết quả nghiên cứu và bàn luận

2.3 Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu
Chồi đỉnh ngọn đồng tiền đ-ợc lấy từ cây giống trồng ở nhà l-ới vào
thời điểm râm mát, tr-ớc đó 3 ngày không có m-a để hạn chế sự nhiễm
khuẩn. Mẫu đ-ợc làm sạch sơ bộ bằng chất tẩy rửa, rồi rửa sạch d-ới vòi
n-ớc chảy. Sau khi xử lý bằng cồn 700 trong thời gian 3 phút, các mẫu đ-ợc
khử trùng bằng các loại hoá chất có nồng độ và thời gian khác nhau.
Kết quả giai đoạn khử trùng mẫu và cấy gây thĨ hiƯn ë b¶ng 1
B¶ng 1: KÕt qu¶ xư lý mẫu đồng tiền
Công Hoá
thức

M1

M2

M3

M4

Nồng độ Thời gian Tổng

chất

xử lý

H2O2

15%

10 phút

HgCl2

0,1%

10phút

H2O2

15%

15 phút

HgCl2

0,1%

10phút

H2O2

15%

15 phút

HgCl2

0,1%

15phút

NaOCl

10%

10 phút

NaOCl

5%

8phút

NaOCl

1%

3 phút

Số

mẫu Số

mẫu

số

nhiễm

bật

mẫu

chết(%)

chồi(%)

30

28(93,3%) 2(6,7%)

30

17(57%)

30

25(83,3%) 5(16,7%)

30

25(83,3%) 5(16,7%)

13(43%)

Môi tr-ờng đ-ợc sử dụng để cấy gây là môi tr-ờng dinh d-ỡng MS +
50g/l sacaroza + 6g/l âgar + 2mg/l BAP.
Kết quả bảng 1 cho thấy:
_Công thức khử trùng M1 : H2O2 15 % trong 10 phót vµ HgCl2 0,1%
trong 10 phót, trong 30 mÉu xö lý, chØ cã 2 mÉu sèng( chiÕm tû lÖ 6,7 %),
22


còn 28 mẫu còn lại đều chết và nhiễm nấm,trong sè 28 mÉu cã 20 mÉu
nhiƠm nÊm vµ vi khn ( chiÕm tû lÖ 66,7 % ) chøng tá hiÖu quả khử trùng
của công thức này yếu, không loại trừ hết các nấm và vi khuẩn trên mẫu cấy
gây.
_ Công thøc khư trïng M2 : H2O2 15% trong 15 phót và HgCl2 0,1 %
trong 10 phút, kết quả thông kê cho thấy công thức này cho kết quả khử
trùng tốt nhÊt. Trong 30 mÉu xö lý cã 13 mÉu sèng, nảy chồi đẹp(43%),

công thức này cho tỷ lệ mẫu bật chåi cao nhÊt(22 mÉu bËt chåi chiÕm tû lÖ
73%), trong ®ã cã nhiỊu mÉu bËt 2-3 chåi.Sè mÉu nhiƠm vµ chết chiếm tỷ lệ
57%, trong đó số mẫu chết là 8 mÉu chiÕm tû lƯ 27%, 9 mÉu bÞ nhiƠm(30%)
_ C«ng thøc khư trïng M3: H2O2 15% trong 15 phót và HgCl2 0,1 %
trong 15 phút, kết quả cho thấy trong 30 mẫu cấy gây có 10 mẫu nảy chồi
( 33,3%)trong đó chỉ có 5 mẫu không bị nhiễm (16,7%) ,20 mẫu bị hoá nâu
sau 2-3 ngày nuôi cấy(66,7%).Nh- vậy tăng thời gian xử lý HgCl2 có ảnh
h-ởng xấu đến chồi invitro,làm chết mẫu cấy gây, thpì gian các mẫu nảy
chồi chậm ( sau 2 tuần mới có dấu hiệu nảy chồi).Xử lý HgCl 2 lâu sẽ ảnh
h-ởng không tốt đến chất l-ợng của mẫu cấy gây.
_ Công thức khử trùng M4 : Thay đổi hoá chất khử trùng bằng NaOCl , với 3
lần khử trùng với nồng độ và thời gian xử lý giảm dần , sau mỗi lần xử lý
mẫu sẽ đ-ợc rửa sạch và bóc dần các lớp bao bọc phía ngoài, sau 3 lần xử lý
chỉ còn lại đỉnh sinh tr-ởng thì sẽ tiến hành cấy vào môi tr-ờng.Kết quả cho
thấy trong 30 mẫu xử lý chỉ có 5 mẫu sống và phát triển tốt(16,7%), số mẫu
nảy chồi nhiều(17 mẫu chiếm tỷ lệ 57%) nh-ng đều bÞ nhiƠm nÊm, vi
khn.Nh- vËy NaOCl cã tÝnh khư trïng yếu, không đủ để tiêu diệt hết các
vi khuẩn và nấm trên mẫu cấy gây, cho nên không thích hợp ®Ĩ khư trïng
chåi ®Ønh ngän ®ång tiỊn.
NhËn xÐt:
Khi khư trïng b»ng H2O215% trong 10 phót vµ HgCl2 0,1 % trong 10 phút
cho kết quả không tốt, nh-ng khi tăng nồng ®é H2O2 15% lªn 15 phót cho
23


kết quả tốt hơn hẳn,chứng tỏ H2O2 thích hợp để khử trùng chồi đỉnh ngọn
đồng tiền,còn khi tăng thời gian xử lý HgCl 2 0,1 % lên 15 phút thì co nhiều
mẫu chết, do đó xử lý HgCl2 quá lâu sẽ ảnh h-ởng không tốt đén sức sống
và khả năng phát triển của chồi invitro vì tinh năng khử trùng của HgCl 2 quá
mạnh sẽ làm chết chồi.

Qua các công thức khử trùng với những hoá chất khử trùng có nồng độ
và thời gian khác nhau, chúng tôi nhận thấy công thức khử trùng cho hiệu
quả tốt nhất là công thøc khư trïng kÐp:
H2O2 15% trong 15 phót
HgCl2 0,1 % trong 10 phút
3.2 Kết quả nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh
ở giai đoạn này, chúng tôi nghiên cứu sự ảnh h-ởng của các loại chất
điều tiết sinh tr-ởng khác nhau đến tỷ lệ phát triển của chồi invitro thông qua
hệ số nhân nhanh và hình thái chồi invitro
số chồi sau thời gian nuôi cấy
Hệ số nhân chồi =
số chồi ban đầu
Môi tr-ờng nền nuôi cây trong giai đoạn nhân nhanh là môi trowngf
dinh d-ỡng MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% n-ớc dừa. Các công
thức khác nhau ở loại chất điều tiết sinh tr-ởng và nồng độ của chúng.Kết
quả nghiên cứu giai đoạn này đ-ợc thể hiện ở bảng 2:
Bảng 2 : ảnh h-ởng của chất điều tiết sinh tr-ởng lên sự phát triên của
chồi invitro

Công Nồng

độ Số

Sau 1 tuÇn

24

Sau 2 tuÇn

Sau 3 tuÇn

thức

chất ĐTST

mẫu

Số

Hệ số Số

chồi nhân

Hệ số Số

chồi nhân

chồi

Hệ số

chồi nhân

chồi

chồi

N1

1,5mg/lBAP

50

90

1,80

120

2,4

140

2,80

N2

1,5mg/lBAP+ 50

71

1,42

102

2,04

136

2,72

90

1,80

131

2,62

150

3,00

78

1,56

104

2,08

114

2,28

50

87

1,74

112

2,24

128

2,56

50

103

2,06

110

2,20

114

2,28

0,2mg/lIAA
1,5mg/lBAP+ 50

N3

0,5mg/lIAA

1,5mg/lBAP+ 50

N4

1,0mg/lIAA
5mg/lK

N5

+0,5mg/lIAA
5mg/lK

N6

+1,0mg/lIAA
Nhận xét
_ Công thức nhân nhanh N1: Chỉ dùng BAP 1,5 mg/l là chất ĐTST , kết quả
cho thấy cây chịu ảnh h-ởng tốt từ BAP, thể hiện ở hệ số nhân chồi t-ơng
đối cao, tăng đều qua các thời điểm nghiên cứu.BAP là loại chất kích thích
sự phân chia chồi, ngọn, thí nghiệm với công thức N1 cho thÊy ®èi víi chåi
®Ønh ngän ®ång tiỊn ®· sinh tr-ởng và phát triển tốt trong môi tr-ờng có
BAP.
_ Công thức nhân nhanh N2: Kết hợp BAP 1,5mg/l và 0,2 mg/l IAA nhằm
nghiên cứu ảnh h-ởng tổng hợp của BAP và IAA đến sự phát sinh và phát
triển của chồi invitro.Kết quả cho thấy ở tuần đầu, các chồi phát triển rất
chậm, hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,42, thấp nhất trong tất cả các môi tr-ờng bố
trí.Sang tuần 2 và 3, hệ số nhân chồi đà tăng đáng kể (2,04 và 2,73 ), chứng
tỏ IAA cũng đà có tác dụng tốt đối với sự phát triển của chồi invitro,song sự
ảnh h-ởng này chỉ thể hiện sau một thời gian nhất định.
25