KIỂM NGHIỆM bài sắc kí GIẤY

Sắc Ký Giấy

(Paper Chromatography)


Nguyên tắc
 Giấy làm giá mang pha tónh
 Pha tónh và pha động đều là chất lỏng

 Pha tónh được hấp phụ trong các lỗ xốp của chất mang
 Pha tónh thường là nước
 Sau khi chấm hỗn hợp phân tích trên giấy, cho dung môi thứ hai (pha động) đi
qua, các cấu tử của hỗn hợp sẽ được phân bố thành từng vùng trên giấy
 Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả tách. Sự cân bằng giữa

pha tónh và pha động đòi hỏi dụng cụ để SKG phải thật kín và có giá đỡ giấy sắc
ký. Để tách tốt, hướng chuyển động của dung môi phải trùng với hướng sợi giấy


Trang thiết bị – Giấy sắc ký
 Cellulose tinh khiết: độ dày và độ hút khác nhau  hiệu lực tách
khác nhau
 Hút nước
 Tách các chất hữu cơ không tan trong nước: tẩm thêm một chất kỵ

nước (dầu silicon, dầu parafin)
 Các thông số kỹ thuật:

 Độ dày (mm)
 Trọng lượng (g/m2)
 Chiều cao thấm nước trong một đơn vị thời gian

 Thời gian khai triển một đoạn dung moâi (h)


Trang thiết bị – Giấy sắc ký
 Điều kiện lựa chọn
 Sức cản vừa đủ

 Đồng nhất về cỡ hạt và tỷ trọng
 Tinh khiết hóa học
 Ít hấp phụ

 Giấy Whatman (Wh)
Giấy
Wh
Số
1
2
3
3MM
4

Trọng
lượng
(g/m2)
87
97
185
185
92

Độ
dày
(mm)
0,16
0,18
0,38
0,31
0,20

Thời gian hút nước
đến độ cao 7,5 cm

Thời gian khai triển một
đoạn dung môi 40 cm

Đặc điểm

9
12,5
9
9
9

15 giờ
15 giờ
13,5 giờ
12,5 giờ
7 giờ

Giấy chuẩn

Giấy chuẩn
Giấy chuẩn
Tách nhiều chất
Nhanh


Trang thiết bị – Giấy sắc ký
 Giấy FN
Giấy FN
số
1
2
3
4
5
6
7

Trọng lượng
(g/m2)
85-90
120-125
85-90
120-125
85-90
120-125
145-150

Độ dày
(mm)

0,18-0,20
0,20-0,23
0,18-0,20
0,20-0,23
0,17-0,19
0,20-0,23
0,28-0,30

Mức hút nước/30
phút (mm)
140-160
140-160
90-100
90-100
60-70
60-70
140-160

Tương đương
giấy Wh
4
1
20
3


Trang thiết bị – Giấy sắc ký
 Các loại giấy sắc ký thường dùng
Loại giấ
y

Whatman

Schilcicher & Schull

Arches Durieux
Grycksbo
Papersbruck
FN

Cỡsố
1
2
3
4
7
17
20
31
2040a
2040b
2043a
2043b
2045a
2045b
598G
602hp
1101
1104
1,2
3,4

5,6
7,8

Tính chấ
t
Hay dù
n g nhấ
t
Chả
y chậ
m (dù
n g cho acid amin, peptid, protein)
Giấ
y dà
y , chả
y trung bình
Cótố
c độchả
y lớ
n (dù
n g cho acid amin vàđườ
n g)
Hạt giấ
y lớ
n , tố
c độchả
y trung bình giữ
a 1 và4
Rấ
t dà

y vàmề
m , tố
c độchả
y trung bình (dù
n g điệ
n di vàsắ
c kýsơ khở
i trê
n tỷlệnhỏ
)
Chả
y rấ
t chậ
m , đô
i khi dù
n g đểtá
ch cá
c acid amin
Giấ
y dà
y , rử
a vớ
i acid, chả
y nhanh
Mề
m , nhanh (bằ
n g vớ
i Whatman cỡsố4)
Mề
m , dà

y hơn loại 2040a
Cứ
n g, nhanh trung bình (bằ
n g vớ
i Whatman cỡsố1)
Cứ
n g, nhanh trung bình, dà
y hơn loại 2043a
Cứ
n g, rấ
t chậ
m
Cứ
n g, rấ
t chậ
m , dà
y hơn loại 2045a
Mề
m , dà
y vànhanh (dù
n g cho sắ
c kýđi lê
n)
Lá
n g, cứ
n g vàchậ
m
Chậ
m vàtương đố
i dà

y
Nhanh trung bình, tương đố
i dà
y
Nhanh
Trung bình
Chậ
m
Nhanh


Trang thiết bị – Dung môi
 Dung môi làm pha tónh thường là các dung dịch nước
 Pha động thường là dung môi có độ phân cực thấp hơn pha tónh
 Dung môi phải đạt các yêu cầu sau:

 Tinh khiết
 Dung môi dùng làm pha động và pha tónh không hỗn hòa nhau
 Độ tan và hệ số phân bố của các cấu tử phải khác nhau trong 2 pha. Độ
tan của các cấu tử trong pha động nên nhỏ hơn trong pha tónh
 Thành phần dung môi trong quá trình sắc ký không được biến đổi

 Dung môi dễ loại khỏi giấy.


Trang thiết bị – Pha tónh
 Nước và dung dịch nước: Giấy sắc ký được nhúng vào dung dịch nước rồi làm khô tự
nhiên, sau đó cho vào bình bão hòa hơi nước. Với pha tónh là nước có thể nhúng giấy vào
nước, rồi treo giấy lên cho chảy hết nước dư hoặc treo giấy vào môi trường bão hòa hơi
nước trong một thời gian đủ để giấy bão hòa hơi nước.

 Các dung môi thân nước (các alcol): Treo giấy vào bình đã bão hòa hơi dung môi pha
tónh (MeOH, EtOH) hoặc nhúng giấy vào dung dịch pha tónh. Trong trường hợp hệ dung
môi hai pha thì pha thân nước làm pha tónh, pha kỵ nước làm pha động.
 Dung môi hữu cơ không phân cực (đảo pha): Để tách các chất hữu cơ không tan trong
nước người ta dùng SKG đảo pha. Giấy được tẩm dung môi không phân cực (silicon/nhexan) hay được ankyl hóa, acetyl hóa.


Trang thiết bị – Pha động
 Dung môi làm pha động trong SKG thường có tính phân cực hơn dung môi pha
động trong SKLM
 Một số hệ dung môi thường dùng trong SKG

Các chất tan nhiều
 Isopropanol - amoniac - nước (9:1:2), (6:3:1)
trong nước
 n-BuOH - acid acetic - nước (4:1:5), (4:1:1)
 Giấy được thấm bằng formamid 40% trong EtOH, pha động là
chloroform (formamid // chloroform)
 Formamid // benzen - chloroform (Tỷ lệ pha động benzen – chloroform Các chất ít thân
thay đổi từ 1:9 đến 9:1 tùy thuộc tính tan của chất cần phân tích)
nước
 Formamid // benzen
 Formamid // benzen - cyclohexan (1:9 đến 9:1)
 Dimetylformamid // cyclohexan (pha tónh là dung dịch dimetylformamid
50% trong EtOH)
 Kerosene // 70% isopropanol (pha tónh là kerosene 10-20% trong ete dầu
Các chất kỵ
hỏa)
 Dầu parafin // dimetylformamid - MeOH - nước (10:10:1) (pha tónh là
nước

dung dịch dầu parafin 10% trong benzen)


Trang thiết bị – Bình sắc ký – Dụng cụ khác
 Bình sắc ký
 Thủy tinh, nắp đậy kín, mép mài nhám, không dùng nút cao su
 Hình trụ hay hình hộp chữ nhật với nhiều kích thước khác nhau
 Có thể dùng ống nghiệm hay ống đong có nút hay nắp kín
 Các dụng cụ khác
 Dụng cụ chấm sắc ký: ống mao quản, micropipet...

 Tủ sấy giấy sắc ký
 Bình phun thuốc thử hay khay nhúng thuốc thử
 Keïp plastic, inox...


Quá trình và kỹ thuật sắc ký
 Chuẩn bị: bình sắc ký, dung môi, giấy sắc ký
 Chấm dung dịch lên giấy
 Khai triển sắc ký
 Phát hiện các vết trên giấy
 Màu sắc tự nhiên của vết
 Phun thuốc thử cho màu đặc trưng

 Soi UV
 Vị trí các vết trên sắc ký đồ: Rf hay Rs


Các kỹ thuật khai triển SKG
 Sắc ký đi lên

Phương pháp
Sắc ký đi lên
Đầu giấy có chấm chất phân
tích nhúng vào dung môi ở
đáy bình. Pha động chạy lên
nhờ lực hút mao quản.

Giấy và kiểu dụng cụ

Chậu đựng dung môi

Ưu điểm
- Dụng cụ đơn giản.
- Thao tác nhanh.
- Có thể định lượng
và tách các chất có
Rf khác nhau xa.

Nhược điểm
Trọng lực tác
dụng
ngược
chiều với lực hút
mao quản nên
tốc độ hút giảm
nhanh khi đã
chạy lên.


Các kỹ thuật khai triển SKG

 Sắc ký đi xuống
Phương pháp
Sắc ký đi xuống
Đầu giấy có chấm chất phân
tích nhúng vào máng dung
môi. Pha động chạy từ trên
xuống nhờ trọng lực.

Giấy và kiểu dụng cụ

Ưu điểm
Nhược điểm
- Có thể tách các Dụng cụ phức
chất có Rf khác tạp hơn phương
nhau nhỏ.
pháp khác.
- Có thể định lượng.


Các kỹ thuật khai triển SKG
 Sắc ký đi ngang – Sắc ký hình tròn
Phương pháp
Sắc ký đi ngang
Giấy cắt hình vuông hoặc
hình chữ nhật được đặt nằm
ngang trên các đũa thủy tinh.
Đầu giấy chấm chất phân
tích nhúng vào chậu dung
môi.
Phương pháp

Sắc ký hình tròn
Giấy cắt hình tròn, có một
bấc, được nhúng vào chén
dung môi. Pha động đi từ
tâm ra ngoài theo vòng tròn.

Giấy và kiểu dụng cụ

Giấy và kiểu dụng cụ

Ưu điểm
- Dụng cụ đơn giản
có thể đặt trong tủ
ấm hoặc tủ lạnh.
- Định lượng nhanh
đường, acid amin,
chất béo.

Ưu điểm

Nhược điểm

- Thao tác nhanh.
- Vùng tách nhỏ,
chính xác.
- Hiệu ứng tách cao
hơn các phương
pháp trên.

- Chỉ dùng để

định tính.
- Việc so sánh
với chất mẫu
có khó khăn.


Ứng dụng của SKG
 Định tính và thử tinh khiết
 Dựa vào Rf
 Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ
 Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau
 Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ

 Bán định lượng – định lượng
 Đo chiều dài hay đo diện tích của vết (bằng máy, bằng cách cân khoanh giấy có
vết, đếm ô vuông,…)
 Đo cường độ màu của vết (bằng máy, bằng mắt)
 Phương pháp rửa: cắt khoanh giấy có vết, chiết bằng dung môi rồi định lượng
bằng các phương pháp thích hợp


Ứng dụng của SKG
 SKG theo cơ chế kết tủa
 Giấy là chất mang chứa thuốc thử làm kết tủa
 Pha động chứa chất tan
 Sự tạo thành kết tủa xảy ra trên bề mặt giấy do tương tác của các phân tử
thuốc thử bị hấp phụ trên giấy với các ion trong pha động
 Một số ion có thể sắc ký kết tủa trên giấy
Ion
Al3+

Ag+
Bi3+
Hg2+

Chất làm kết tủa
K4Fe(CN)6 4%
KI
KI
KI

Hàm lượng chất kết tủa (%)
1
5
5
5

Thuốc thử phát hiện - màu
Alizarin - đỏ
vàng
đen
đỏ


Ưu và nhược điểm của SKG
 Ưu điểm:
 Kỹ thuật và dụng cụ đơn giản, dễ thực hiện
 Phương pháp vi phân tích vì lượng mẫu cần dùng nhỏ ( 1 g)
 Có thể ứng dụng để xác định nhiều chỉ tiêu như định tính, định lượng, xác định
tạp liên quan,…
 Hiện là phương pháp đơn giản nhất để tách và phát hiện các hợp chất có chứa

nguyên tố phóng xạ.

 Nhược điểm:
 Không làm sắc ký chế hóa bằng SKG
 Không dùng được các hóa chất có tính ăn mòn trong phát hiện vết
 Thời gian khai triển lâu từ 4 - 5 giờ (thậm chí từ 2 -3 ngày)

 Giấy dễ hấp phụ các chất khác có trong môi trường nên phải bảo quản giấy sắc
ký thật kỹ.