ĐẠI CƯƠNG về sắc kí

Chương1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ
I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:
Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet.
Ơng thực sự là người đầu tiên có cơng tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất
giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên
phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm.
Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải
thích các q trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo
dược phẩm. Do có cơng trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được
nhận giải thưởng Nobel về hoá học.
Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao. Cột mao
quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể
phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng
dụng được nhiều trong thực tế.
Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký
lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính
và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp.
Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép
nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện
mao quản (CEC)... Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức
tạp hơn.
II. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI
1.1 Định nghĩa:
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha
thường đứng n có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ
pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác
nhau và tách ra khỏi nhau.
1.2 Phân loại các phương pháp tách sắc ký
1.2.1 Phân loại theo hệ pha
Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại đơn giản theo hệ

pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì?
hệ
pha
Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký

1

Cơ
chế


1.2.2 Phân loại theo cơ chế tách
1.2.2.1 Sắc ký hấp thụ:
Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động nhờ
tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt
lớn, bền vững về mặt hố học. Chúng hấp thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau
khi cho pha động chứa chất phân tích tiếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử
chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau.
1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng
Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng
- lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân
tích giữa hai pha lỏng giống như q trình chiết, cịn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích
vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn.
Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân bố
lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có
nhược điểm là pha tĩnh khơng được bền vững, hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.
1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion)
Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha
động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, cịn chất có khả năng trao đổi anion gọi lá anionit. Lực
liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích

của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: phản ứng
trao đổi ion giữa cationit acid mạnh và Ca2+ có thể viết như sau:
2R-SO3H + Ca2+ = (R-SO3)Ca + 2H+
Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl- :
R-N(CH3)3OH + Cl- = R-N(CH3)3Cl + OH2


1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở)
Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lịng chất rắn, cịn gọi
là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác
nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất phân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha
tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh cịn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ
bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của các
chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với
pha tĩnh. Như vậy một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét
ở đây.
1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ
1.2.3.1 Phân tích tiền lưu
Các cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B< C. Cho hỗn hợp chất phân tích liên tục đi qua
cột, chất phân tích có ái lực với

pha tĩnh thấp

Nồng độ

nhất đi trước, tiếp theo là chất

có ái lực yếu

hơn. Tuy nhiên do chúng ta cho

liên tục chất

phân tích vào nên đi sau A là A

+

A+B+C. Chỉ có một phần chất

tinh khiết A

đi trước

B

và

C
1.2.3.2

Phân

Trong sắc ký này, chúng
lượng nhỏ hỗn hợp chất

A

B

B

A

A

tích thế đẩy
t. V

phân tích A,

Nồng độ
Hình 1: Sắc đồ phân tích tiền lưu

B, C vào cột sau đó cho chất

ta cũng nạp
D là chất đẩy

liên tục đi qua cột.
Ái lực hấp thụ là A


Do D đẩy C, C lại đẩy B, B

lại đẩy A nên

sắc đồ có dạng::
A

B

C

D

1.2.3.3 Phân
Đưa một lượng nhỏ
các chất A, B, C vào cột sau

t, V
tích rửa giải:

Hình 2: Sắc đồ phân tích thế đẩy
(phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

mẫu bao gồm
đó dùng chất E

có ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục. Cả A, B, C, E đều tan tốt trong pha động . Thứ tự
ái lực hấp thụ là E < A < B < C. Một câu hỏi đặt ra làm sao E có ái lực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có
thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đơng
ở pha tĩnh khơng phải chỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể có
nhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử).

3


Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trở lại pha động phải
cần tới nhiều cấu tử rửa giải E. Quy luật ưu thế số đơng xem ra có tác dụng. Vì vậy khi rửa giải người ta

thường chất rửa giải có nồng độ lớn hơn chất phân tích rất nhiều.
Tóm

lại

một

nhìn

theo

phân

loại

nào

cũng có thể

liên

quan

đến một hay

nhiều cách

phân

loại

khác,

thí

dụ ở sắc ký

lỏng-

rắn

phép sắc ký
cách

Chiều cao (h)
Diện tích (S)

Thời gian (t)

chỉ đơn giản
là chất rắn,
chất

lỏng

Hình 3: Sắc đồ phân tích rửa
giải

là pha tĩnh
pha động là

theo

cách

phân loại theo liên kết pha nhưng theo cách phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao
đổi ion. Tuỳ theo pha tĩnh sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân
tử. Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay lỏng- rắn.
Sắc ký rửa giải có ứng dụn Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu
vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra
trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau:
Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO 3.
Tiếp theo, cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành
các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, βxantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ơng gọi đó là
“Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó cịn giữ đến
ngày nay.
Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ
không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng
cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố
tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.
Khi cho dung mơi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất
được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng khơng di chuyển
cịn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất
phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển
nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một
sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di
chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

4

Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs biệt về quãng đường di
chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu
tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là q trình
tách sắc ký.
g nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao

2. QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ VÀ CÁC LOẠI LỰC LIÊN KẾT TRONG HỆ SẮC KÝ
2.1 Quá trình tách sắc ký
Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất
phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của
Txvet, tiến hành như sau:
Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO 3. Tiếp theo,
cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt.
sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất màu
nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ơng gọi đó là “Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp,
“Chroma” là ,màu cịn “Graphy” là ghi, danh từ đó cịn giữ đến ngày nay.
Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ không
chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là
không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với
pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.
Khi cho dung mơi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất được phân bố
tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng khơng di chuyển cịn khi ở pha động
chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian
ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và
giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau
mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

5

Hình 4 :Quá trình tách A và B trong cột tách sắc ký .
Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs biệt về quãng đường di chuyển
sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc
theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là q trình tách sắc ký

2.2 Các loại lực liên kết trong hệ sắc ký
Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chất phân tích, pha tĩnh,
pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với
tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất phân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động
chất phân tích ln thay đổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong st q
trình phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thành phần này tương
tác như thế nào với nhau, bằngc lực liên kết nào mà kết quả các chất phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở
mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của các thành phân trong hệ sắc ký. Chất phân tích có thể là
ion, phân tử trung hoá hay chất phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân
cực. Như vậy tuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tác với
nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại:
2.2.1 lực liên kết ion
Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả năng phân ly tạo
thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung
dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh
cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha
tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng
tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các
cation và anion.
Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng.
Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion.
6


2.2.2 Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh
có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do
cảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất này liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên
kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.
Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để
phân chia chúng trong các phép tách sắc ký.
Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về vị trí nhóm CH 3- trong phân tử. Chính sự khác
nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về
độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh khác nhau. Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá
trình sắc ký
2.2.3 Lực Van- de- Van (lực phân tán)
Lực này có bản chất điện, tuy nhiên khơng hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên
quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định.
Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử .
Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ khơng phải là chất khí sự tương tác giữa các phân tử n-heptan là lực
phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác
làm pha tĩnh.
2.2.4 Lực tương tác đặc biệt
Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.Sự
hình thành liên kết giữ ngun tử hidro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F... gọi là liên kết
hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm
điện lớn hơn. Như vậy các nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt.
3. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ
3.1 Hệ số phân bố KD và cách xác định
Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập
As


→
¬




Am

(1)

hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha
KD =

[ As ]
(2)
[ Am ]

Trong đó : [Am ] là nồng độ chất phân tích trong pha động
[As ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh
Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng - lỏng, khí-lỏng, rắnlỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa thứ n. Nhưng do pha động di chuyển,
chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1.
Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của
chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha động. Hệ số phân bố K D có thể được xác
7


định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích
trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần đúng KD được xác định theo công thức sau:
KD =

( M − M 1 ) .V
M 1.m

(3)

Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg
M1 là lượng chất phân tích cịn lại sau khi tiếp xúc mg
V là thể tích pha động ml
m là lượng chât hấp thụ, gam
3.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD
Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi f A là phần thời gian A ở pha động:
fA =

[ A] m .Vm
[ A] m .Vm + [ A] s .[ V ] s

(4)

chia cả tử và mẩu cho [A]m . Vm ta có:

fA =

1
fA =
1+ k 'A

1
1+ KD

VS
Vm

(5)

Trong đó k ’A là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là:
u.fA = u / (1+k’A)

uA =

(7)

U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi KD hoặc fA càng lớn ;
thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược
lại khi fA càng nhỏ, chất phân tích di chuyển càng nhanh.
3.3 Thời gian lưu tR, thời gian lưu hiệu chỉnh t’R
Thời gian lưu tR là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại.
tR =

(8)

L L(1 + k A )
=
uA
u

L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết

V
t R A = t m 1 + K D . s
Vm


(9)


 = t m (1 + k ' A )


thời gian lưu hiệu chỉnh t’R là thời gian lưu khơng tính thời gian chết

t R' A = t R A − tm = tm .k ' ⇒ k ' =

t R'
V'
= R
tm Vm

(10)

3.4 Thể tích lưu Vm, thể tích lưu hiệu chỉnh V’m
Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột cho đến khi pic đạt
cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu V R được tính theo cơng thức:VRA = tRAF; Vm
= tmF
VRA = Vm(1 + k’)

(11)
8


Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột
VR’ = VR – Vm = VmkA’ = KDAVS
Thể tích lưu riêng Vg là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích
trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh

'
VRA
= K DA = Vg
VS

(12)

3.5 Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối)
Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc
vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất: một chất phân tích A và một chất khác
B hoặc một chất chuẩn.
Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1
α=

k
K DA
= A' ≠ 1
K§ DB
kB

(13)

Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt
khác tỷ số thể tích lưu của hai chất, t’RA/ t’RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố.
Vậy có thể tóm tắt là:

α=

'
k

K DA
t'
VRA
= A' = RA
=
'
'
K§DB
kB
t RB
VRB

(14)

3.6 Đĩa lý thuyết và xác định số đĩa lý thuyết bằng thực nghiệm
3.6.1 Khái niệm đĩa lý thuyết:
Đĩa lý thuyết là phần nào

đó của cột

mà ở đó cân bằng được thiết lập.

Theo quan

niệm của Martin và Synge, cân

bằng được

thiết lập nhanh chóng, tức thời.

Tuy nhiên

điều này gặp khó khăn khi giải

thích hiện

tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện

tương pic

sắc

ký

khơng

cân

đối.

Amundson và Lapidus và sau đó

Hình 5:Xác định số đĩa lý thuyết từ thực nghiệm

Deemter cho rằng đĩa được cân

là
bằng

Van

khi

đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác giả đã đưa ra thuyết
tốc độ.
Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân bằng phân bố chất
phân tích.
Gọi n là số đĩa lý thuyết,

σ là độ lệch chuẩn; σ ~

n

. Đối với cột sắc ký n càng lớn pic càng hẹp,

thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, tR ~ n, nên ta có thể vết:
2
tR
n
 tR 
=
hay n =  
σ
n
σ 

9


w = 4 σ hay σ =

Mặt khác:

W
4

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là:
(15)
3.6.2 Đĩa lý thuyết có tính thời gian khơng lưu giữ, nef
nef

( t − tm )
=16 R
w

nef = 16

2

=

2

2
16 ' 2
16
t
= 2 t m2 k '
2 ( R)
W
W

t R2
k2
k2
=
n
.
2
w2 ( 1 + k ) 2
(1+ k )

(16)

Vì từ (8) ta có tm= tR/(1+k’). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính:
Hf =

L
n f(16)

Từ (15) và (16) ta có:
H ef

1 +k ' )
(
L
w2
=
=H
2
16 ( t R −t m ) 2

k'

2

(17)

3.7 Sắc đồ.
Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hấp
thụ quang,cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện ...liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân
tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính tốn hàm lượng chất phân
tích, tính diện tích pic sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các
thiết bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động

t RB .VRB

S, h

'
'
t RB
,VRB

t RA ,VRA
'
t ¶' RA , VRA

tm

t, V
t0

WB

¦ WA

Hình 6: Sắc đồ hai cấu tử A&B
3.8 Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải:
3.8.1 Độ phân giải

10


Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tủ khỏi nhau trong một phép tách sắc ký. Hai cấu tử A và B
được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc
trưng là: thời gian lưu, tRA, tRB và rộng pic WA, WB.
Độ phân giải R được tính theo cơng thức:

R=

2( t RB − t RA )
W A + WB

(18)

Trong đó: tRB – tRA= ΔtR là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng thể tích lưu V RA- VRB)của hai cấu tử
A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên khả năng
tách của cột.
Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: tR ~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với
Vì vậy

R~

n
n

hay

n

R~ L

3.8.2 Cách làm tăng độ phân giải
Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột. Trong phương pháp này có các biện pháp: Tăng
chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là
giảm đường kinh cột
Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tơi ưu hố tơc độ pha động, giảm lượng mẫu, giảm
nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC)
3.9 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter
Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này được Van Deemter phát
triển.
Theo thuyết này các yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha
động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng rất nhiều tới sự giản rộng
vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ. Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất
phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do ba thành phần H1,H2, H3.
H = H1 + H2 + H3

(19)

H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho sự đồng đều của cột nhồi, đường kính của hạt nhồi, khả
năng nạp cột
H1 = 2λdp

(20)

Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; dp là đường kính hạt nhồi
H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về
hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phất phân tích trong pha
động, đường đi của chất phân tích, được biểu diển bằng phương trình:
H2 = B/u trong đó B= 2γDm

11


Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó.
Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích khơng q khúc khuỷu, γ = 1; Dm là hệ số khuếch
tán của chất phân tích trong pha động, như vậy H2 có thể viết lại là:
H2 = 2γDm/u

(21)

H 3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là yếu tố phụ thuộc vào tốc độ hấp thụ và
giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha động và pha tĩnh, vì vậy H3 có thể viết: H3= (CS - Cm)u (22)
Trong đó Cs là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha tĩnh, phụ thuộc
vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ khi tốc độ dịng F≥1ml/phút, Cs ≈0

Cs= K.df2/Ds

(23)

Trong đó: K- hệ số
Ds- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh

df2- chiều dày pha tĩnh
Cm là hằng số chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động, được xác định theo
biểu thức:
Cm = βdp2/Dm

(24)

β là hệ số thực nghiệm có giá trị từ 0,5- 1
Dm là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.
Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là:
H = 2λdp + 2γDm/u + (Kdf2/Ds + βdf2/Dm)u

(25)

Phương trình trên được viết tắt là:
H = A+B/u +Cu

(26)

Trong thực tế có thể tính

H

gần đúng

H= 3-4dp

Cu

Để xét cực tiểu chiều cao

thuyết lấy đạo hàm của phương

của đĩa lý
H min

Van Deemter ta có:
’

A

2

H = -B/u +C
Tại cực tiểu H’=0 => utư =

trình

B
u

utu

B
C

u , cm / s

Hình 7: Đường cong Van Deemter
III. BÀI TẬP

Bài 1:
Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các
hợp chất A,B và C. Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng. Các pic của các hợp chất B và C có dạng
đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59 phút. Chiều cao cột sắc ký bằng 28,3cm. .
1. Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C.
2. Tính giá trị trung bình T và σ của cột.
3. Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C.
12


4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml. Thể tích của pha động
bằng 17,6ml. Hãy tính hệ số phân bố B,C.
Giải:
1. Tính n và H:
+ Đối với pic B:
2

2

2

2

t 
 10, 60 
nB = 16  RB ÷ = 16 
÷ = 5733
 0,56 
 WB 
+ Đối với pic C

t 
 11, 08 
nC = 16  RC ÷ = 16 
÷ = 5643
 0,59 
 WC 
Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết.
+ Chiều cao đĩa lý thuyết:
H=

L 28,3
=
= 4,975.10−3 (cm)
n 5688

2. Tính σ và T:
Từ n =

σ2
⇒ σ = n.H 2 = 5688.(4,975.10−3 ) 2 = 0,375(cm)
2
H

σ .tRB 10, 6.0,375
=
= 0,141( phut )
L
28,3

Ta có: TB =

σ .tRC 11, 08.0,375
=
= 0,147( phut )
L
28,3

TC =
T=

0,141 + 0,147
= 0,144( phut )
2

3. Chỉ số lưu giữ của chất B,C:
Ta có:

RB =

tm 0,84
=
= 0, 079
t RB 10, 6

RC =

tm
0,84
=
= 0, 076

t RC 11, 08

4. Hệ số phân bố B,C:
Ta có: RB =

Vm
V (1 − RB ) 17, 6(1 − 0, 079)
⇒ kB = m
=
= 16, 68
Vm + k B .VS
RB .VS
0, 079.12,3

RC =

Vm
V (1 − RC ) 17, 6(1 − 0, 076)
⇒ kC = m
=
= 17, 40
Vm + kC .VS
RC .VS
0, 076.12,3

Bài 2
Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực nef và Hef của hệ sắc ký có tính chất sau: t RA = 280 s; t RB = 300 s;
WA = 14s; WB = 15s. Thời gian chết là tm=10s, cột có chiều dài là 3,2m.
13

Giải:
Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực nef là:
n=

k '2
; với k’ là tỷ số dung tích.
( k '+1) 2

t − t 
nef = 16  R M 
 W 

2

2

 280 
nA = 16 
÷ = 6400
 14 
2

 300 
nB = 16 
÷ = 6400
 15 
Từ đó ta có:
 t − t   280 − 10 
Đối với pic A: k ' =  R M  = 

 = 27;
 tM   10 
2

nef A

 27 
= 6400 
÷ = 5951, 07
 27 + 1 

t − t
Đối với pic B: k ' =  R M
 tM

  300 − 10 
=
 = 29;
  10 
2

 29 
nef B = 6400 
÷ = 5980, 4
 29 + 1 
Vậy,

nef = 5065, 7 ; H ef =

300

= 0, 053 .
5965, 7

Bài 3
Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào
(lúc đó của hợp chất Y khơng được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic của chất X có dạng
đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2cm.
1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột.
2. Tính H của cột.
3. Tính T và σ của cột.
4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X.
5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột
bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân bố X.
6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng 1,011.
Giải:
1. Số đĩa lý thuyết (n):
2

2

t 
 15.60 
n X = 16 RX  = 16
 = 22130
 24,2 
 WX 

14

2. Tính H:
Ta có n =

L
L
40,2
⇒H = =
= 1,82.10 −3 (cm)
H
n 22130

3. Tính σ và T:
Từ n =

σ2
⇒ σ = n.H 2 = 22130.(1,82.10− 3 ) 2 = 0,27(cm)
H2
σ .tR

Ta có: T =

L

=

15.0,27
= 0,101( phut )
40,2

4. Chỉ số lưu giữ của chất X:

Ta có:

R=

tm 1,32
=
= 0,088
tR
15

5. Hệ số phân bố X (kX):
Ta có: R =

Vm
V (1 − R ) 12,3(1 − 0,088)
⇒ kX = m
=
= 12,9
Vm + k .VS
R.VS
0,088.9,9

6. Tiêu chuẩn phân chia (Rs):
Ta có: RS =
với

n
1
(1 − ) =
4

α

22130
1
(1 −
) = 0,4
4
1,011

α là yếu tố phân chia.

Bài 4: Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây:
-

Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm.

-

Tốc độ dịng: 0,312 ml/phút.

-

Thể tích pha động (Vm): 1,40 ml.

-

Thể tích pha tĩnh (Vs): 0,168 ml.

Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện
sau:

Cấu tử
Khơng lưu giữ bởi cột
A
B
C
D
Hãy tính:

Thời gian lưu giữ,phút
1,2
4,7
8,8
12,5
13,8

Chiều rộng chân pic,phút
0,48
0,92
1,34
1,44

1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic,giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của
cột.
2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.
3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.
4. Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D.
Giải
t 2
1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) tính được số đĩa lý thuyết
w

15


A: n = 1534
B: n = 1463
C: n = 1392
D: n = 1469
ntb = 1500
H=

L 25, 2
=
= 0, 017cm
ntb 1500

σ2
⇒ σ = n.H 2 = 1500.(0, 017) 2 = 0, 66(cm)
2
H

n=

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.
Áp dụng công thức k ' X =

t R − tm
ta tính được hệ số chứa của từng cấu tử :
tm

k’A = 2,9 ; k’B = 6,3; k’C = 9,4 k’D = 10.

Từ công thức k ' X =

K X VS
ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử :
VM

KA = 24; KB = 53; KC = 78; KD = 87;
3. Độ phân giải RS, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.
Rs =

2∆t R
= 0,94
wC + wD

α=

K D 87
=
= 1,12
K C 78

4.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 đối với 2 cấu tử C,D;k’ và α
không thay đổi khi n và L tăng.
Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:
Rs ,1
Rs ,2

=

n1

n2

⇔

0,94
1500
=
⇒ n2 = 3800
1,50
n2

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:
L2 = H.n2 = 0,017. 3800 = 65 cm.
Bài 5:
Cho hệ sắc ký có tính chất sau: t RA = 280 s; t RB = 300 s; WA = 14s; WB = 15s. Cột có chiều dài là
3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính độ phân giải?
Giải:
t RA = 280.

400
= 350( s )
320
2

t RB = 300.
2

t 
 280 
nA = 16.  RA ÷ = 16 

÷ = 6400
W
14


 A

400
= 375( s)
320
2

2

t 
 300 
nB = 16.  RB ÷ = 16 
÷ = 6400
W
15


 B
16


2

400
t 

n = 16.  R ÷ = 6400.
= 8000
320
W
2

16.t 2R
 tR 
Ta có: n = 16.  ⇒ W =
n
W
16.(350) 2
WA =
= 15, 65( s)
8000
R=

16.(375) 2
WB =
= 16, 77( s)
8000

2. ( 375 − 350 )
= 1,54
15, 65 + 16, 77

Bài 6
Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa vào một lượng nào
đó của chất tan tương tự như metan,nó khơng được giữ bởi pha tĩnh. Trong cột mao quản có chiều dài 50m;
thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút. Hãy cho biết:

a. Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu?
b. Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu?
Giải
a. Ta có L = 50 m = 5000 cm.
TR = 71,5 s
Vậy tốc độ di chuyển của pha động là:
F=

L 5000
=
= 69,93cm / s
t R 71,5

b. Đối với n-heptadecan: tR= 12,6 phút = 756 s.
Vậy tốc độ di chuyển của dải là:
F=

5000
= 6, 61cm / s .
756

Bài 7
Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động khác nhau, cho các số
liệu sau:
Tốc độ (cm/s)

Số đĩa lý thuyết

0,5

150 000
120 000

Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó,cho
A=0.
Giải
TN1

H1 = 3000/150000 = 0,02 cm

TN2

H2 = 3000/120000 = 0,025 cm.

Ta có phương trình:
17


B
+ 0,5C
0,5
B
0, 025 = + C
1
0, 02 =

Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm2/s.
U tối ưu = (B/C)1/2 = 0,5 cm/s
Hmin = 2(B.C)1/2 = 0,02 cm.
Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là:

n=

3000
= 150000 .
0, 02

Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí. Dùng thước người
ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng
chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm. Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi
chất.
Giải
t 2
Sử dụng phương trình : n = 16( R ) tính được số đĩa lý thuyết
w
n(propan) = 2042
n(butan) = 2416
Chiều cao đĩa lý thuyết H =

L
ta được
n

H(propan) = 0,176 cm
H(butan) = 0,149 cm.
Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký
lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5
và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút. Hãy tính:
1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của
cột.
2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen. Cho biết

khí được sử dụng là khơng khí với tR(KK) = 1,2 phút (khơng khí được xem là cấu tử khơng bị lưu giữ
bởi cột).
3. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.
Giải
Ký hiệu A : metyl xiclohexan
B: metyl xiclohexen
C: toluen.
t 2
1. Sử dụng phương trình : n = 16( R ) tính được số đĩa lý thuyết
w
18


A: n = 2902
B: n = 3025
C: n =2645
ntb = 2900
H=

L
420
=
= 0, 015cm
ntb 2900

σ2
⇒ σ = n.H 2 = 2900.(0, 015) 2 = 0,81(cm)
H2

n=

2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen
Rs , A− B =

2∆t R
= 1,16
wA + wB

Rs , B −C =

2∆t R
= 2, 70
wA + wB

3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.
Vì Rs,A-B = 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu cầu 1,5.
Gọi n1,n2 là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:
Rs ,1
Rs ,2

=

n1
n2

⇔

1,16
2900
=

⇒ n2 = 4800
1,50
n2

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:
L2 = H.n2 = 0,015. 4800 = 73 cm.
Bài 10:
Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với tốc độ pha động khác
nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau:
Thí nghiệm
u (cm/s)
tR (s)
w (s)
1
10
300
20
2
20
250
16
3
30
150
10
Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó
Giải :
Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết ta cần
xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí
nghiệm :

Ta có : L=36 m = 3600 cm
2

TN 1:

 300 
n1 = 16
 = 3600
 20 

TN 2:

 250 
n2 = 16
 = 3906
 16 

2

H1 =

3600
= 1,00(cm)
3600

H2 =

3600
= 0,92(cm)
3906

19


2

 150 
n3 = 16
 = 3600
 10 

TN 3:

H3 =

3600
= 1,00(cm)
3600

Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau:
1,00 = A +

B
+ 10C (1)
10

0,92 = A +

B
+ 20C (2)

20

1,00 = A +

B
+ 30C (3)
30

Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được:
A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm2/s) và C = 0,016 (s)
Vận tốc tối ưu, Hmin và số đĩa lý thuyết được tính là :
utoiuu =

B
=
C

4,8
= 17,32(cm / s )
0,016

H min = A + 2 B.C = 0,36 + 2 4,8.0,016 = 0,914(cm)

n=

L
3600
=
= 3939
H

0,914

TÀI LIỆU THAM KHẢO.
1. Từ Vọng Nghi , Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu – Hố học phân tích –
Tập 2 –NXB Khoa học kỹ thuật.
2.TS-Nguyễn Đình Lâm- Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của sắc ký-Bài giảng.
3.TS- Nguyễn Bá Hoài Anh-Đại cương về sắc ký –Bài giảng.
4.KS-Phan Hiền Lương- Phương pháp sắc ký lỏng HPLC.

Chương 2. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.1. KHÁI NIỆM VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

20


Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng
yên, có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử
chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Quá trình sắc ký khác cơ bản với quá trình tách khác ở 2 điểm:
- Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, thậm chí hàng triệu lần).
- Pha động đi qua pha tĩnh.
1.2. VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi
là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển.
Ban đầu, phương pháp được thực hiện ở áp suất thường vì chất nhồi cột có kích thước lớn. Cơ chế tách là sắc ký hấp
phụ, sắc ký phân bố nhưng do tốc độ phát triển nhanh của phương pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng được
cải tiến, hiệu quả tách của cột ngày càng được nâng cao.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký lỏng
– lỏng, sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn.

Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hố cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của
ngành chế tạo máy phân tích và được sử dụng nhiều trong lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc
và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép định tính và định lượng).
1.3. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC
Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục
các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha
tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động. Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh
nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau.

Hình: Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký.
Như vậy có thể nói HPLC là một sắc ký cổ điển đi kèm với một detectơ nhạy để phát hiện chất phân tích sau
khi tách ra khỏi cột trong quá trình chạy sắc ký.
Với những tiến bộ kỹ thuật về cột tách và detectơ đã chuyển phương pháp phân tích này có một tốc độ nhanh
và chính xác nhờ hệ thống bơm cao áp khoảng 300 atm nhằm tạo dịng chảy với lưu lượng vài ml/phút. Vì vậy người
ta gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao.

21


Ưu điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích rất ít chỉ cần khoảng 20µL/1 lần phân tích và mẫu chỉ
cần hồ tan mà khơng cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy
do nhiệt độ trong q trình phân tích.
1.4. CÁC GIAI ĐOẠN CHẠY SẮC KÝ HPLC
* Giai đoạn tách:
- Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200 ÷ 500 atm). Vì vậy
phải chuyển tồn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hịa tan trong dung mơi làm pha động). Phương
pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều
kiện thường).
- Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách → chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt
pha tĩnh.

- Dùng bơm cao áp để bơm dung mơi rửa giải qua cột (có thể là dung mơi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để
rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách
ra khỏi nhau).
- Kỹ thuật chạy sắc ký:
+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi).
+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục). Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu
phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hồn tồn.
* Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích:
- Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ.
- Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong
đó chứa các thơng tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng…
+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này để phân tích định tính.
+ Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1
khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích.
1.5. CỘT TÁCH TRONG HPLC
Cột tách là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký, bao gồm các vấn đề: các loại cột tách, chất liệu làm
cột, kích thước cột, kích thước hạt nhồi, cách nạp cột,…
Hỗn hợp các chất tan có thể được tách hồn tồn ra khỏi nhau hay khơng được xác định bởi hiệu quả của cột
tách và bởi độ chọn lọc của hệ pha. Do vậy điều quan trọng là phải chế tạo được các cột tách có hiệu quả.
* Cột tách trong HPLC có 3 loại:
+ Cột thường.
+ Cột mao quản.
+ Cột kích thước nhỏ (cột micro).
* Chất liệu làm cột: là thép đặc biệt, nếu làm bằng thủy tinh thì phải bọc thép ở ngồi vì phép sắc ký này được
thực hiện ở áp suất rất cao.
* Kích thước cột:
Loại cột tách
Cột thường

Đường kính

Chiều dài

Tốc độ chảy

(mm)

(cm)

(mL/phút)

4,0 ÷ 4,6

15 ÷ 30

1÷2

22

Số đĩa lý thuyết
40.000 ÷ 60.000


Cột mao quản
4,0 ÷ 4,6
4 ÷ 13
2÷4
40.000 ÷ 60.000
Cột micro
1,0 ÷ 2,0

15 ÷ 100
0,03 ÷ 1
1.000.000
- Trong đó cột có đường kính 4.6mm được dùng nhiều nhất, chiếm 44,5%;cột đường kính 4,0 mm là 16,7%
- Cột mao quản có thời gian phân tích rất ngắn, dễ thay đổi tốc độ chảy từ cột quy ước sang cột mao quản.
Tuy nhiên có những bất tiện là phải trang bị thể tích cột phụ, thể tích cuvet của detector phải nhỏ, việc nhận và xử lý
tín hiệu phải nhanh.
- Cột micro tiết kiệm dung mơi pha động.
- Kích thước của cột phụ thuộc vào chất nhồi: hạt nhồi nhỏ thì kích thước cột nhỏ, hạt nhồi lớn thì kích thước
cột lớn sao cho đủ số đĩa lý thuyết để thực hiện phép tách hồn tồn.

Hình: Cột sắc ký.
* Kích thước hạt nhồi:
- Pha tĩnh trong sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể là chất rắn hoặc chất lỏng:
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào cột tạo thành chất nhồi hay cột sắc ký (các hạt chất nhồi trong pha tĩnh rắn cú d = 3 ữ 10
àm, ph bin nht hin nay l 3 ữ 7 àm).
+ Pha tnh lng thỡ được giữ trong cột sắc ký nhờ vào hạt chất mang trơ. Màng mỏng thường dùng là các loại dầu nh
silicon cú b dy d = 1ữ3 àm, loi pha tĩnh này có dung tích nhỏ hơn pha tĩnh rắn.
Như vậy tùy thuộc vào pha tĩnh mà ta có phương pháp sắc ký lỏng - lỏng (pha tĩnh lỏng) hoặc lỏng - rắn (pha
tĩnh rắn).
- Hạt chất nhồi có đường kính 30 µm thích hợp cho cột tách có đường kính trong 2 mm. Khi sử dụng chất
nhồi có đường kính nhỏ hơn 10 µm, đường kính trong cột tách khoảng 3 ÷ 4 mm sẽ cho hiệu suất tách và độ lặp lại
tốt. Như vậy kích thước hạt dùng trong HPLC nhỏ hơn so với sắc ký khí.
- Nhằm thu được các cột tách có hiệu quả các chất nhồi được đưa vào trong cột như là lớp đồng nhất và chặt
nhằm thu được sự ổn định. Ở đây một số yêu cầu đặt ra cho các chất nhồi là phân bố kích thước hạt chất nhồi cần phải
hẹp và các hạt cực nhỏ hoặc cực lớn phải không có, vì các hạt có kích thước lớn gây nhiễu loạn đáng kể sự đồng nhất
quá trình nhồi, trong khi đó các hạt quá nhỏ lại làm giảm sự thấm ướt...

23

Hình: Hạt nhồi trong HPLC.
* Cách nhồi cột:
- Trước khi nhồi, cột tách làm bằng thép không gỉ được làm sạch bằng HNO 3 50%, rửa bằng nước cất nhiều
lần, tráng bằng axeton, clorofom rồi lại bằng axeton và cuối cùng làm khơ bằng khí N 2 hoặc khơng khí nóng.
- Các phần gá lắp ở đầu và cuối cột tách với các bộ phận khác cũng rất quan trọng và làm thể tích chết ít nhất.
Ở các đầu cột tách phải sử dụng các màng lọc bằng thép không gỉ, thủy tinh xốp ép, teflon xốp. Bông thủy tinh thường
được dùng để ngăn các hạt nhỏ. Lỗ xốp của vật liệu làm ngăn phải nhỏ hơn kích thước các hạt nhồi ít nhất là 5 lần.
- Trong thực tế có 2 cách nhồi: nhồi khơ và nhồi ướt (huyền phù). Việc lựa chọn cách nhồi cột tách phụ thuộc
vào kích thước của chất nhồi:
+ Các chất nhồi có đường kính lớn hơn 20µm thường được nhồi khơ, từng phần nhỏ chất nhồi được thêm vào cột
(khoảng 0,5 ml hoặc ít hơn), vừa rót vừa gõ hoặc rung. Trong một số trường hợp có thể nối với bơm sắc ký và luyện
cột ở tốc độ dòng cao và áp suất cao trong 10 phút. Cột nhồi được coi là tốt (ng kớnh ht cht nhi 30ữ40 àm)
tc ra giải 3 cm/s và chiều cao đĩa lý thuyết của cột tách khoảng 1 mm.
+ Với kích thước hạt chất nhồi khoảng 10µm hoặc 5µm người ta hay sử dụng phương pháp nhồi ướt. Trong quá trình
nhồi cột, huyền phù phải bền vững, khơng có sự sa lắng. Huyền phù bền vững khi :
• Giữa các tiểu phân và chất lỏng huyền phù có tỷ trọng như nhau (phương pháp cân bằng tỉ trọng).
• Độ nhớt của mơi trường huyền phù lớn đến mức tốc độ sa lắng của các tiểu phân là cực tiểu (phương pháp độ nhớt
cao).
Các chất lỏng làm huyền phù thường được dùng là metanol, axeton, dẫn xuất halogen, đioxan... hay hỗn hợp
của chúng, các chất lỏng có độ nhớt cao như parafin, xiclohexano.
* Ngồi ra, người ta còn sử dụng cột bảo vệ đặt trước cột phân tích để giảm thiểu sự hấp phụ bất thuận nghịch
của chất tan đối với pha tĩnh và sự tắc nghẽn cột chính. Cột bảo vệ nói chung giống cột phân tích nhưng được chế tạo
từ những vật liệu rẻ hơn với ý nghĩa là cột chấp nhận hi sinh để bảo vệ tuổi thọ của cột phân tích.
1.6. CÁC LOẠI PHA TĨNH THƯỜNG DÙNG TRONG HPLC
1.6.1. Nguyên tắc chọn pha tĩnh trong HPLC
Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho:
- Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại phải được thiết lập nhanh.
- Pha tĩnh có dung lượng lớn để hấp phụ một lượng lớn chất phân tích.
- Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng.

24


1.6.2. Các loại pha tĩnh trong HPLC
* Pha tĩnh hấp phụ pha thường :
- Loại pha tĩnh này được chế tạo từ: silicagen, polime (polistiren…).
- Silicagen có cấu tạo đặc biệt, xốp, bề mặt gồ ghề, có những mao quản cho nên diện tích bề mặt của silicagen
lớn, trên bề mặt của nó cịn có các nhóm silanol cũng có thể tham gia các liên kết với chất phân tích. Silicagen có tính
axit, pH = 3 ÷ 5 nên hấp phụ tốt các chất có tính bazơ hơn là các hợp chất có tính axit. Vì những đặc tính trên mà
Silicagel thường được sử dụng để tách, phân li các hợp chất thuộc họ rượu, phenol, andehit, axit hữu cơ, lipit, amin,
….). Trên bề mặt của nó có chứa nhóm –OH là nhóm phân cực. Các nhóm –OH có thể tương tác rất mạnh với các
phân tử có chứa nhóm chức. Độ lớn của sự tương tác phụ thuộc vào kiểu và số các nhóm chức trong các phân tử chất
tan.

OH

O

Si

OH

O

Si

OH

O

OH
Si

Si

Khi gặp những hỗn hợp phức tạp thì ta hoạt hóa nhóm –OH bằng một số nhóm phân cực: -C 3H6CN, -(CH3)2O-CH2-CH(OH)-CH2(OH), -C3H6NH2… Nhóm này là những nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết hiđro với các phân
tử nước nên làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh.
- Sự lưu giữ của các chất tan trong các hệ xảy ra là do tương tác giữa các phân tử chất tan và các vị trí hoạt
động trên bề mặt của chất rắn. Vì các phân tử dung mơi có thể tương tác với các vị trí này, sự hấp phụ có thể coi như
là q trình cạnh tranh giữa các phân tử chất tan và các phân tử dung mơi trong sự tấn cơng các vị trí hấp phụ trên bề
mặt của chất rắn. Điều đó có nghĩa là các chất tan có mặt trong
pha lỏng đã thay thế một hoặc nhiều các phân tử dung môi từ bề mặt mà chính
nó bị hấp phụ.
- Như vậy loại pha tĩnh này thích hợp với việc tách các chất tan với các kiểu nhóm chức khác nhau hoặc số
các nhóm chức khác nhau và đối với việc tách các đồng phân, miễn là các chất tan không phân cực hoặc phân cực kém
bởi chúng phải hoà tan trong pha động ít phân cực.
* Pha tĩnh hấp phụ pha ngược :
- Pha tĩnh là những silicagen trung tính đã được ankyl hóa các nhóm -OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl (C 3,
C5, C8, C18 ..., thông dụng nhất là C18).

Vì vậy mà chất nhồi này có bề mặt khơng phân cực, nó thuộc loại chất nhồi kỵ nước tức là nước khơng làm
ảnh hưởng đến bề mặt của nó.
- Loại pha tĩnh này được sử dụng để tách các chất từ khơng phân cực đến phân cực. Vì vậy phạm vi sử dụng
đa dạng, phong phú hơn.
* Pha tĩnh hấp phụ trao đổi ion:

25