CÁC PHƯƠNG PHÁP hóa lý TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC p3

KHOA DƯỢC
BỘ MƠN HĨA PHÂN TÍCH – KIỂM NGHIỆM

CHƯƠNG 3
CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
(Tiếp theo)
(2 giờ)
Giảng viên: Phan Thị Thu Trang
Email:
Điện thoại: 0702396147


NỘI DUNG
Quang phổ phân tử

Quang phổ hấp thụ UV-VIS
Quang phổ hồng ngoại

Sắc ký lỏng hiệu năng cao


2 – Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquic
Chromatography – HPLC)


NỘI DUNG
1

• Thơng số đặc trưng

2

• Hệ thống máy HPLC

3
4
5

• Các kỹ thuật HPLC
• Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC
• Các phương pháp định lượng HPLC


2.3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

4

3

Trao đổi ion


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Pha tĩnh

Sắc ký lỏng- lỏng (LLC): lớp

Sắc ký pha liên kết (BPC):

mỏng pha lỏng hữu cơ bao

được liên kết hóa học với

trên bề mặt của các tiểu phân

chất mang. Các nhóm chức

chất mang

hữu cơ liên kết với bề mặt

Nhược điểm: bị rửa trơi dần

của các tiểu phân silica qua

theo dịng pha động → hiệu

các nhóm silanol

lực cột bị giảm dần trong quá

trình sử dụng.


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Pha tĩnh

Một số pha liên kết thường dùng


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Pha động
❖ Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp của
2, 3 hay 4 thành phần. Người ta có thể thay đổi độ
phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của
các thành phần dung môi trong hỗn hợp.
❖ Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi

trong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giải
gradient hoặc chương trình hóa dung mơi.


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh

người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha
thuận và sắc ký pha đảo)


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký pha thuận (Nomal Phase Chromatography)
và Sắc ký pha đảo (Reversed-Phase Chromatography)

Link xem:
/>?v=MLoitPJQH3g


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký pha thuận (Nomal Phase Chromatography)
và Sắc ký pha đảo (Reversed-Phase Chromatography)
Thông số

Sắc ký pha thuận

Sắc ký pha đảo

Pha tĩnh

Phân cực

Khơng phân cực

Pha động

Ít phân cực đến phân cực
trung bình

Phân cực trung bình
đến phân cực mạnh

Chất ít phân cực ra trước

Chất phân cực ra
trước

Thứ tự rứa giải


2.3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

4

3

Trao đổi ion


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (LSC)
❖ Là kỹ thuật phát triển sớm nhất và được dùng phổ

biến.
❖ Chất cần phân tích bị giữ trên bề mặt pha tĩnh (chất

hấp phụ) và bị dung môi đẩy ra (phản hấp phụ).
❖ Pha tĩnh có thể là silicagel, nhôm oxyd ...
❖ Pha động thường là những dung mơi ít hoặc khơng
phân cực. Khi rửa giải, các chất không phân cực sẽ ra
trước, các chất càng phân cực càng ra chậm.


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao (LSC)

Pha tĩnh

Chất tan hấp
phụ trên bề
mặt pha tĩnh
Chất tan

Adsorption chromatography


2.3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

4

3

Trao đổi ion


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký trao đổi ion (IEC)
❖ Phân tách các thành phần ion hóa tan trong

nước, có phân tử lượng nhỏ hơn 1500.
Pha tĩnh là các nhựa trao đổi ion dưới dạng bột

mịn (hợp chất hữu cơ cao phân tử có chứa nhóm
chức có khả năng trao đổi): Nhựa có nhóm hoạt
động mang điện tích âm, dùng để tách các chất
base. Nhựa có nhóm hoạt động tích điện dương để
phân tách các chất có nhóm mang điện âm.


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký trao đổi ion (IEC)


2.3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

4

3

Trao đổi ion

2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký rây phân tử (SEC)
❖ Phân tách các chất có phân tử lượng (MW) >2000.

Pha tĩnh là những hạt xốp của silicagel hay polyme.
Khi sắc ký, các phân tử của các chất phân tích được lọc

theo cỡ của khối lượng phân tử: Các phân tử có MW q
lớn, chạy nhanh qua cột, chúng khơng bị lưu giữ; Các phân
tử có MW nhỏ hơn thì bị lưu giữ trên cột. Khi rửa giải
chúng sẽ lần lượt ra khỏi cột với thời gian lưu tăng theo
chiều giảm của khối lượng phân tử.


2.3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký rây phân tử (SEC)


2.4. Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC
Muốn chọn một kỹ thuật sắc ký thích hợp để phân
tách một hỗn hợp, phải dựa vào các đặc tính lý, hóa
học của các chất thành phần:
+ Tính tan: tan hay khơng tan trong nước.

+ Phân tử lượng (MW).
+ Tính phân cực: ion hóa hay khơng ion hóa.


2.4. Hướng dẫn chọn kỹ thuật HPLC

MW > 2000

MW < 2000
Không tan/
nước

Sắc ký rây phân tử
+Mẫu thử tan/nước → dung môi là nước.
+Mẫu tan/DMHC → DMHC làm pha động.
Pha tĩnh: Sephadex (dextran), pha động H2O
Pha tĩnh: Styragel, pha động hữu cơ.
Tan/ít tan/ nước

Độ tan phụ thuộc pH
Độ tan khơng phụ thuộc pH

Sắc ký phân bố pha thuận

Sắc ký trao đổi ion hoặc
phân bố pha đảo
Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký phân bố pha đảo


2.5. Các phương pháp định lượng HPLC
Nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic.
1

Phương pháp chuẩn ngoại

2

Phương pháp chuẩn nội

3

Phương pháp thêm chuẩn

4

Phương pháp chuẩn hóa diện tích


2.5. Các phương pháp định lượng HPLC
Phương pháp chuẩn ngoại

❑ Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định

lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện.

❑ So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu
thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu
chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu
thử.


2.5. Các phương pháp định lượng HPLC
Phương pháp chuẩn ngoại

Chuẩn hóa 1 điểm

Nồng độ xấp xỉ nhau
CX : nồng độ mẫu thử
CS : nồng độ chất chuẩn
SX (HX): diện tích (chiều cao)
của pic mẫu thử
SS (HS): diện tích (chiều cao)
của pic mẫu chuẩn