CÔNG NGHỆ NUÔI cấy mô tế bào THỰC vật CHỦ đề cảm ỨNG RA HOA IN VITRO TRÊN cây HOA HỒNG

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----------------------------------------------------------CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

CHỦ ĐỀ
CẢM ỨNG RA HOA IN VITRO TRÊN
CÂY HOA HỒNG

Giảng viên hướng dẫn: Nơng Thị Huệ
Nhóm thực hiện: Nhóm 03


DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM
STT

Họ & Tên

Mã sinh viên

Lớp

1

Phạm Thành Đức

637215

K63CNSHC

2

Nguyễn Hương Giang

637218

K63CNSHC

3

Vũ Hương Giang

637217

K63CNSHC

4

Nguyễn Thu Hiền

637220

K63CNSHC

5

Nguyễn Văn Hịa

637225

K63CNSHC

6

Đào Đình Hoàng

637224

K63CNSHC


8. Tài liệu tham khảo

2.
2. Nuôi
Nuôi cấy
cấy
mô
mô thực
thực vật
vật

7. Ứng dụng

6. Chất
khoáng vi
lượng
5. Chất điều tiết sinh
trưởng ở thực vật

1. Đặt vấn đề

Cảm ứng
ra hoa in
vitro

3. Lịch sử
hình thành

4. Cơ sở kỹ thuật


1. Đặt vấn đề

Trong lĩnh vực hoa cây cảnh, nuôi cấy in vitro đã
khẳng định vai trị khơng thể thay thế và đem lại
hiệu quả kinh tế to lớn.

Rất nhiều lồi hoa và cây cảnh đã được ni cấy in
vitro thành công nhưng hầu hết các nghiên cứu mới
chỉ dừng lại ở mức vi nhân giống mà chưa được
khai thác về khía cạnh điều khiển ra hoa in vitro.


Trong các nghiên cứu về sinh lý thực vật được
xem là rất quan trọng với mục đích tìm ra
ngun lý, cơ chế của tự nhiên để có sự lựa
chọn phù hợp khi tác động lên thực vật với
những mục tiêu xác định.
“ Cơ chế của sự nở hoa ở thực vật” được xem
xét ở góc độ in vitro các nhà nghiên cứu đã
tìm ra nhiều phát sinh hình thái ở thực vật,

tránh sự tác động của các chất được sản sinh
in vivo từ lá và rễ.


1. Đặt vấn đề
Để phục vụ nhu cầu thưởng thức, thưởng ngoạn
hoa đa dạng, ngày nay, ngoài các phương thức
trồng hoa trên giá thể truyền thống là đất thì
phương thức trồng hoa trong môi trường nhân
tạo đang rất được quan tâm.
Hiện nay ở Việt Nam đã có những hiểu biết bước
đầu về cơ chế hình thành hoa in vitro.
Tuy nhiên, vai trò của các yếu tố tham gia điều khiển
quá trình ra hoa in vitro ở cây trồng như quang chu kỳ,
nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng cũng như thành
phần đa, vi lượng trong môi trường nuôi cấy cần được
tiếp tục nghiên cứu và làm rõ.


1. Đặt vần đề
Hoa hồng là một trong những loài hoa phổ biến
nhất thế giới bởi màu sắc đa dạng, hình dáng đẹp
và hương thơm quyến rũ.
Hoa hồng được trồng khắp mọi nơi làm hoa cắt
và hoa trồng chậu đem lại giá trị kinh tế cao.
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định được
ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng và các yếu
tố vi lượng đến quá trình ra hoa ở một số giống hoa
hồng thương mại, tạo cơ sở cho việc phát triển các quy
trình kỹ thuật chủ động điều khiển ra hoa in vitro trên

cây hoa hồng.


2. Nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung
cho tất cả các loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn
sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo,
trong điều kiện vô trùng.
Bao gồm:
Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành
Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn
chưa thụ tinh.
Ni cây phơi: phơi non và phôi trưởng thành.
Nuôi cấy mô sẹo (callus).
Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
Nuôi cấy Protoplast: nuôi cấy phần bên trong của tế bào
thực vật sau khi tách vỏ, cịn gọi là ni cấy tế bào trần.


2. Nuôi cấy mô thực vật

Các nghiên cứu về sự nở hoa trong ống nghiệm
thường được tiến hành theo một trong ba hướng sau
Bao gồm:
Ni cấy thực vật hồn chỉnh (Cây in vitro có đầy
đủ rễ, thân, lá).
Ni cấy mơ dạng chồi và cụm chồi.
Nuôi cấy các bộ phận của thực vật chưa có đỉnh
sinh trưởng (Mơ sẹo, mơ lá, rễ, cơ quan hoa, tế
bào trần...).

3
1938
1939

Lịch sử hình thành
1902

1922

1934

1941

1948

1955

1957

Năm
1922,
nhà
khoa
họchọc
Mỹđược
lặp lại
thí
Nhà khoa học Haberlandt

Học
lầnthuyết
đầuKotte
tiên
hiệnđưa
đại về
tế bào
cơng
Skoog
và
Miller
cơng bố các kết quả
Nhà
khoa
học
phát
hiện
vai
trị
của
nghiệm
của
Haberland
với
đỉnhScleiden
sinh
trưởng
tách
các
thuyết

của
bố do
hai
và
nhà
Schwann
khoa
học
M.J.
(nhà
Nămgiả
1934,
giaiSkoog
đoạnScleiden
thứ
hai
trong
lịch
sử
ni
cấy
mơ
thực
vật.của
Steward
xác
nhận
tác
dụng
nghiên

cứu
về ảnh hưởng của tỷ lệ
một thực
hợp nghiệm.
chất có táctừdụng
kích
thích
phân
đầu
rễ
lồi
cây
họ
hồ
Trong
mơi
trường
vào
nghiên
cứu
thực
vật)
vàthảo.
T.
Schwann
(nhà
nước
dừa
trên
mơ

sẹo
cà
rốt.
Sau
Năm
1941,
nhà
khoa
học
Overbeck
kinetin/auxin
đối
với
sự
hình
thành
mơ
Gautheret
tiến
hành
các
nghiên
cứu
và
thành
cơng
ni
cấy
mơ
bào,

và
đặt
tên
là
Kinetin.
Sau
này,
các
nhà
White
nhà
khoa
học
Mỹ,
ni
cấy
thành
cơng
lỏng
có
chứa
dinh
dưỡng
khống
và
đường
Haberlandt cho rằng:
cónghiên
thể tạocứu
cá động

thể
hồn
vật)
đề thích
xuất:“Mọi
cơ thểsinh
đó
nhiều
chất
kích
thích
chứng
minh
tác
dụng
kích
sẹo
cây
thuốc
lá.
Khi
giảm
thấpnhận
tỷ lệ
phânhọc
sinh
(tượng
tầng)
một
số

thân
gỗ.
Gautheret
xác
khoa
nghiên
cứu
tỉ
mỉ
hơn
vai
trị
của
trên
cây
cà
chua
với
mơi
trường
lỏng
chứa
dinh
Went
&
Thimann
phát
hiện
chất
điều

rễ
sinh
trưởng
rất mạnh
thành
chỉnh từ việc ni
cấyglucose,
tế
sinh
bào.
vậtđầu
phức
tạp
đều
gồm
nhiều
đơn tạo
vịauxin
nhỏ
là
trưởng
nhân
tạo
thuộc
nhóm
sinh
trưởng
của
nước
dừa

trong
kinetin/auxin,
mơnấm
sẹo
có xu
hướng
tác dụng
của
chất
kíchtrưởng
thích
sinh
trưởng
trên
mơ
sẹo
của
IAA vàtạo
Kinetin
vàdưỡng
xếp
vào
nhóm
cytokinin.
Đây
là
khống,
đường
và
dịch

chiết
men
và
hồ
sinh
(hormon)
đầu
tiên
một
hệ
rễ
bao
gồm
cả
rễ
phụ.
Tuy
vậy,hợp
sinh
Tuy
nhiên,
Haberlandt
các
đã
tế
bào
khơng
hợp
thành.
thành

Các
tế
bào
đã
phân
hóa
đã
được
nghiên
cứu
và
tổng
ni
cấy
phơi
từ
mẫu
cây
họ
cà.
rễ.khởi
Ngược
lại men
nếu tỷ
lệ hỗn
kinetin/auxin
nhómtiền
3 vitamin
do thế
White

xưởng.
Cùng
với
Nobercourt
những
đề
kỹ
thuật
lập
mơi
thể
thay
nước
chiết
nấm
bằng
acid-B-indolacetic
(1AA).
trưởng
củaxác
mẫu
tồn
tại
một
thời
sau đó
cơng
trongcóviệc
ni
cấy

đềutếcho
mang
bào
thực
các
thơng
vật
do
tin
có
trong
tếgian,
bào đầu
thành
cơng.
tăng
lên,
mơ
(1939),
Gautheret
thành
cơng
trong
việcsẹo
duyphát
trì sinh chồi.
trưởng của
trường
ni
cấy

cho
nhiều
lồi
thực
vật.
hợp
ba
loại
vitamin
nhóm
B.
chậm
dần
và
ngừng
lại,
mặc
dù
táccógiả
những
hạn
chế
về
phương
tiên
và
tiện
là
những
kỹ

thuật,
đơn
vị
độc
lập,
từ
đó
thể đã
Carlos
O.
Miller
M.J.
T.
Schwann
Scleiden
Frederick
Campion
Steward
Kotte
Haberlandt
K. Skoog
mơ sẹo cà rốt trên mơi trương rắn có chứa thạchFolke
agar.
chuyển
qua
mơi
trường
mới.
kiến thức khoa học thờixây
bấydựng

giờ. lại tồn bộ cơ thể“.


3
1958

Lịch sử hình thành
1960

1966

1967
1968

1971
1972

1977

1980
1992

Now

Hiện nay, Năm
ni 1960
cấy mơ
tế bào
thực
vậtcơng

đang
ở giai
đoạn
thứ
4,
Morelddax
thành
trong
nhân
Năm
1977
Viện
Sinh
học
phát
triển
Năm 1971, Takebe tái sinh thành cơng
ni cấy mơ
được
dụng
khá
phổ
biếndung
trong
nhân
giốngcơng
cây
giống
in ứng
vitro

lồi
lantrần.
Cymbidium
từhợp
mẫu
Max
Planck
thành
cây thuốc
lá
từ
tế
bào
Kerint
và
Sterward
tạosự
trồng, chọn
tạo
giống,
tạo
đột
biến,
tạo
khối,
sản
Năm
1966,
1967Guha
1968,

và
lần
cộng
lượt
Nichko
thành
là đỉnh
sinh
haitrưởng.
loại
tể sinh
bào
soma
củaxuất
cây các
cà
Từni
nămcấy
1980
đến
1992
có
nhiều
thành
cơng
Năm
1972,
Carlson
và
cộng

sự
lần
đầu
được
phơi
và
cây
hồn
hợp chất thứ
cấp
cótrong
hoạt
tính
sinh
học....
các
ứng
dụng
về ni
cơng
Nakato
và
ni
cộng
cây
sự
tạo
tạogen
cây
được

đơn
cây
bội
Nhà
khoa
học
Cooking
lần
đầu
tiên
dùng
chua
và
cây
khoai
tây,
đánh
dấu
mới
trong
lĩnh
vực
cơng
nghệ
thực
vật.
tiên
thực
hiện
lai

tế
bào
soma
hai
lồi
chỉnh
từ
tế
bào
thượng
cấy mơ tế enzyme
bào thực
vật từ
nói
riêng
vàbước
cơng
nghệ
tế bào
thựcsửvậtchọn
nói
ở cà
đơn
bội
độc
dược
bao
từ
phấn
bao

hoa
phấn.
thuốc
phân
hủy
thành
tế
bào
và lá.
tạo
ratếlịch
số
một
ngoặt
trong
khác
nhau,
tạo
được
cây
từ
dung
hợp
tầngcơng
cây càcụrốt.
chung đang
trở
thành
cógiống
hiệu

quả
trong
việc
tạo ra sản
lượng
lớn
tế
bào
trần
trên
nhiều
loại
cây
tạo
cây
trồng.
bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana
phẩm đặc trồng
thù phục
vụ con người.
khác
glauca
vànhau.
N langsdorfi.
Viện Sinh học phát triển Max



4. Cơ sở kỹ thuật
4.1. Tính tồn năng của tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng
mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả
năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng
rẽ đã phân hóa đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền
cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp điều kiện
thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể
hồn chỉnh.
Đó là tính tồn năng của tế bào.


4. Cơ sở kỹ thuật
4.2. Sự phân hóa tế bào
Sự phân hóa tế bào là q trình tế bào trải qua quá
trình thay đổi về cấu trúc, hình dạng để thực hiện
chức năng đặc thù nhất định.
Ví dụ: Mơ dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mơ bì làm
nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô
dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng.
Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:
Tế bào phơi sinh → Tế bào phân hóa có chức năng
riêng biệt.


5. Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Một khi thực vật đạt được độ tuổi nở hoa, các yếu tố
môi trường như nhiệt độ ánh sáng và chất dinh dưỡng
có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành và biệt

hóa chồi hoa.
Những ảnh hưởng này được thực vật cảm nhận gián
tiếp thơng qua các chất có tác dụng kích thích hoặc ức
chế sự nở hoa trong cơ thể chúng.
Năm 1937, Chailakhyan đã đưa ra giả thuyết hormon
chuyên biệt cho sự nở hoa, nhưng đến nay vẫn chưa
tổng hợp được chất này.


5. Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Tuy nhiên, qua nhiều nghiên cứu cho thấy sự nở hoa
dường như là kết quả của sự tương tác giữa các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật như cytokinin, auxin,
GA, ethylene, acid abscisic (ABA) và những chất khác
đã biết hoặc chưa biết.
Điều này càng thể hiện rõ hơn qua các nghiên cứu
khảo sát sự nở hoa trong ống nghiệm và vai trò của các
chất điều hịa sinh trưởng có vị trí quan trọng.


5. Chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những
hormon liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay
đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong ni cấy mơ.
BA hay 6-benzyladenin là cytokinin nhân tạo.
TDZ hay Thidiazuron có tác dụng như cytokinin nhưng
không là dẫn xuất của adenine. Ở nồng độ thấp, TDZ cảm
ứng tái sinh chồi trực tiếp. Ở nồng độ cao, TDZ cảm ứng

hình thành mơ sẹo và những cấu trúc bất thường. Ở nồng độ
quá cao, TDZ cảm ứng hình thành mơ sẹo và phơi sinh
dưỡng từ mô sẹo.
Bổ sung BA, TDZ vào môi trường ni cấy có tác dụng
kích thích sự ra hoa in vitro như cây hoa hồng (Wang et al.,
2002; Kantamaht et al., 2010).


6. Chất khống vi lượng

•

Các ngun tố khống vi lượng được sử dụng ở nồng độ
thấp hơn 30mg/lít mơi trường, các nguyên tố thường sử
dụng là Fe, B, Mn, I, Mo, Zn, Ni, Co.

•

Các ngun tố này đóng vai trị quan trọng trong hoạt động
của enzyme.


6. Chất khoáng vi lượng
Tên nguyên tố vi
lượng
Manga (Mn)

Dạng sử dụng

Nồng độ M

MnSO4.H2O

15-100

Bo(Bo)

H3BO3

6-100

Kẽm (Zn)

Zn(SO4).H2O

15-30

Đồng (Cu)

CuSO4.5H2O

0.04-0.08

Molypden (Mo)

(NH4)6Mo7o24.4H2O
NaMoO4.2H2O

0.007-1.0
0.1-0.4

Coban (Co)

CoCl2.6H2O

2.5-20

Iot (I)
KI
Bảng 1. Chất khống vi lượng thường dùng trong ni cấy mơ


• AgNO3 và CoCl2 là hai chất có
khả năng điều khiển q trình sinh
trưởng, phát triển của chồi thơng
qua tác động vào q trình trao
đổi ethylene (Biddington, 1992).
• Bổ sung hai hợp chất này vào mơi
trường ni cấy có thể phát sinh
cơ quan, cảm ứng ra hoa sớm
thông qua ức chế hoạt động của
ethylene.

Hình 1. Bài báo
nghiên cứu của tác
giả Pua EC, Chi GL.


• AgNO3

• AgNO3 ức chế hoạt động
của ethylene (Beyer EM
1976a).

Hình 2. Bài báo
nghiên của Beyer EM
(1976a).


• CoCl2

• CoCl2 ức chế tổng
hợp ethylene (Lau
and Yang, 1976).

Hình 3. Bài báo nghiên
cứu Lau OL, Yang SF
(1976).


7.1.
7.1. Mục
Mục tiêu
tiêu và
và yêu
yêu cầu
cầu

7. Ứng dụng

7.2.
7.2. Vật
Vật liệu
liệu và
và phương
phương pháp
pháp
7.3.
7.3. Ảnh
Ảnh hưởng
hưởng của
của chất
chất điều
điều tiết
tiết
sinh
sinh trưởng
trưởng và
và chất
chất khoáng
khoáng vi
vi
lượng
lượng đến
đến sự
sự ra
ra hoa
hoa in
in vitro
vitro ởở cây

cây
hoa
hoa hồng
hồng


7.1. Mục tiêu và yêu cầu
 Mục tiêu
• Xác định được ảnh hưởng để điều khiển sự ra hoa in vitro
tạo mơi trường tối ưu để có được tỷ lệ ra hoa cao.
• Thúc đẩy q trình chọn tạo các giống hoa mới cũng như
làm đa dạng hóa sản phẩm và đáp ứng nhu cầu về chơi và
thưởng thức hoa.
• Xác định nguyên lý, cơ chế nở hoa ở thực vật trong điều
kiện in vitro.
 Yêu cầu
Hoàn thiện nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh
trưởng và chất khoáng vi lượng trên cây hoa hồng.


7.2. Vật liệu và phương pháp
 Vật liệu nghiên cứu: Nghiên cứu sử dụng đoạn thân bánh
tẻ chứa mầm ngủ ba giống hoa hồng vàng, hồng đỏ và
hồng trắng thu thập tại Mê Linh - Vĩnh Phúc.
 Phương pháp nghiên cứu
• Đoạn thân bánh tẻ mang mắt ngủ (khơng q già cũng
không quá non), không sâu bệnh, sinh trưởng tốt được rửa
sạch dưới vịi nước, ngâm trong xà phịng lỗng 15 phút,
rồi rửa lại dưới vòi nước chảy đến khi sạch xà phịng.
• Sau đó, trong tủ cấy vơ trùng, mẫu được ngâm trong cồn

70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng trước khi
được khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút
và cuối cùng được rửa bằng nước cất vô trùng từ 3-5 lần.