Xác định chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------------------- --------------------

NGUYỄN THỊ LAN HOA

XÁC ðỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GEN
KHÁNG BỆNH XANH LÙN Ở CÂY BÔNG CỎ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
-------------------- --------------------

NGUYỄN THỊ LAN HOA

XÁC ðỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ LIÊN KẾT GEN
KHÁNG BỆNH XANH LÙN Ở CÂY BÔNG CỎ

Chuyên ngành

: Di truyền và Chọn giống cây trồng

Mã số

: 62 62 01 11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Nguyễn Thị Thanh Thủy
2. TS. Nguyễn Văn Giang

HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


i

LỜI CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận
án là do tơi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu ñã nêu trong
luận án là trung thực và chưa ñược ai cơng bố trên bất kỳ một cơng trình
nghiên cứu nào khác. Tơi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã ñược cám ơn,
các tài liệu trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lan Hoa

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii

LỜI CẢM ƠN
ðể hồn thành được luận án này, nghiên cứu sinh đã nhận được sự tận

tình giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân.
Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Tiến sỹ Nguyễn Thị
Thanh Thủy, Tiến sỹ Nguyễn Văn Giang những người thầy ñã tận tình dẫn
dắt, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu
khoa học và hoàn thành luận án.
Nghiên cứu sinh biết ơn những ý kiến đóng góp q báu của PGS. TS.
Nguyễn Hồng Minh cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Di truyền chọn Giống –
Khoa Nơng học cũng như sự giúp đỡ tận tình của các Thầy, Cơ cơng tác tại
Ban Quản lý ðào tạo – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội trong suốt q
trình học tập tại đây.
Tác giả xin chân thành cảm ơn các cán bộ, bạn bè ñồng nghiệp công tác
tại Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nơng nghiệp, Phịng Nghiên cứu
Cơng nghệ Sinh học – Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố và Bộ môn ða
dạng Sinh học Nông nghiệp – Trung Tâm Tài nguyên Thực vật ñã chia sẻ kinh
nghiệm, giúp ñỡ ñộng viên trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Nghiên cứu sinh xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh ðạo Trung
tâm Tài nguyên Thực vật, Ban Lãnh ðạo Viện Di truyền Nông nghiệp, Ban
Lãnh ðạo Viện nghiên cứu Bơng và PTNN Nha Hố đã tạo điều kiện học tập
và giúp đỡ tận tình trong q trình thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng, tác giả xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khích lệ
trong suốt q trình học tập và hồn thành luận án
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lan Hoa
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii

MỤC LỤC
Lời cam ñoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục các chữ viết tắt

vi

Danh mục các bảng

vii

Danh mục các hình

ix

MỞ ðẦU

1

1

Tính cấp thiết của ñề tài

1

2

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

3

Mục tiêu của đề tài

3

4

Những đóng góp mới của luận án

4

5

ðối tượng và phạm vi nghiên cứu

4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA

ðỀ TÀI
1.1

Cây bơng và nghiên cứu đa dạng di truyền

5
5

1.1.1

Nguồn gốc, xuất xứ và phân loại nguồn gen bông (Gossypium L.)

5

1.1.2

ða dạng về kích thước, thành phần và trình tự genome cây bơng

7

1.1.3

Nghiên cứu đa dạng di truyền ở cây bơng sử dụng chỉ thỉ phân tử

13

1.1.4

ða dạng nguồn gen cây bông

19

1.2

Những nghiên cứu về bệnh xanh lùn hại bông

20

1.2.1

Bệnh xanh lùn hại bông và lịch sử phát hiện

20

1.2.2

Triệu chứng và tác hại của bệnh xanh lùn

23

1.2.3

Nguyên nhân gây bệnh

25

1.2.4

Nghiên cứu về tính kháng bệnh xanh lùn hại bơng

29

1.2.5

Chọn tạo giống kháng bệnh xanh lùn

31

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv

1.3

Nghiên cứu lập bản ñồ di truyền và tiềm năng ứng dụng trong
cải tiến giống ở cây bông (Gossypium L.)

33

1.3.1

Nghiên cứu lập bản đồ di tuyền ở cây bơng

33

1.3.2

Nghiên cứu lập bản đồ các gen chính và QTL ở bơng

39

1.3.3

Tiềm năng ứng dụng những thành tựu nghiên cứu hệ gen
bông trong cải tiến di truyền cây trồng kháng bệnh

1.4

41

Những nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản ñồ phân
tử trong nước

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

45
47

2.1

Vật liệu nghiên cứu

47

2.2

Nội dung nghiên cứu

49

2.3

Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

50

2.3.1

Thời gian nghiên cứu

50

2.3.2

ðịa ñiểm nghiên cứu

50

Phương pháp nghiên cứu

51

2.4
2.4.1

Phương pháp ñánh giá ña dạng di truyền của các giống bông
cỏ sử dụng các chỉ thị SSR

51

2.4.2

Phương pháp tạo lập quần thể lập bản ñồ

55

2.4.3

Phương pháp phân tích di truyền gen kháng bệnh xanh lùn
thơng qua kiểu hình tính kháng của các quần thể

2.4.4

56

Phương pháp lập bản ñồ gen kháng bệnh xanh lùn và xác
ñịnh chỉ thị liên kết dựa trên quần thể phân ly F2

58

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

62

3.1
3.1.1

ðánh giá nguồn vật liệu tạo quần thể lập bản ñồ

62

ðánh giá một số chỉ tiêu đặc điểm hình thái của các nguồn
gen bông cỏ vật liệu

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

62


v

3.1.2

ðánh giá tính kháng bệnh xanh lùn ở một số dịng/giống
bơng cỏ vật liệu

3.1.3

Xác định đa hình di truyền, xác định khoảng cách di truyền
của các dịng/giống bơng cỏ trong tập đồn bằng chỉ thị SSR

3.2
3.2.1

Tạo lập quần thể lập bản đồ

3.2.2

Phân tích di truyền tính kháng bệnh xanh lùn dựa trên tính

kháng nhiễm của các quần thể F1, F2, BC1F1

3.3.1

Nghiên cứu xây dựng bản ñồ liên kết ở cây bơng cỏ

3.3.3
3.4

79
79
80
87

Khảo sát đa hình di truyền của hai dịng/giống bố mẹ của
quần thể lập bản ñồ

3.3.2

68

Nghiên cứu ñặc ñiểm di truyền tính kháng bệnh xanh lùn thơng
qua đánh giá kiểu hình tính kháng của các quần thể phân li

3.3

65

87

Nghiên cứu lập bản đồ di truyền của cây bơng cỏ sử dụng chỉ
thị SSR và quần thể phân ly F2

91

So sánh bản ñồ di truyền

97

Xác ñịnh chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh xanh
lùn ở cây bơng cỏ

3.4.1

Lập bản đồ liên kết gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ

3.4.2

Ứng dụng các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bệnh
xanh lùn ñể chọn lọc cá thể kháng bệnh ở BC1F1

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ

104
104
108
114

1

Kết luận

114

2

ðề nghị

115

Danh mục các cơng trình đã cơng bố

116

Tài liệu tham khảo

117

Phụ lục

140

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
ARN

AFLP
A,C,G,T
BSA
bp
CAPS
cM
CRM
cs.
CTAB
EST
ISSR
H
MAS
NBS-LRR
LG
RIL
PIC
PCR
QTLs
RAPD
RFLP
RGAs
SFR
SSRs
SNP

Acid Deoxyribo Nucleic
Acid Ribonucleic
Amplified Fragment Length
Polymorphism

Adenine, Cytosine,
Guanine, Thyamine
Bulked Segregant Analysis
Base pair
Cleaved Amplified
Polymorphic Sequences
Centimorgan
Comprehensive reference map

Axít Deoxyribonucleic
Axít ribonucleic
ða hình chiều dài đoạn phân cắt được
nhân bội
Phân tích phân ly nhóm
Cặp bazơ
ða hình các phân đoạn nhân bản ñược
cắt giới hạn
ðơn vị khoảng cách bản ñồ di truyền
Bản đồ tham khảo
Cộng sự

Cetyltrimethylammonium
bromide
Expressed Sequence Tag

ðoạn trình tự biểu hiện (là một đoạn
trình tự ngắn của một chuỗi cDNA)
Inter-Simple Sequence Repeat Trình tự xen giữa các SSR
Observerd Heterogeneity
Hệ số dị hợp

Marker Assisted Selection
Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
Nucleotide binding site –
Vị trí liên kết nucleotit tại những Vùng
leucine rich repeat
lặp lại giàu leucine
Linkage group
Nhóm liên kết
Recombinant inbred lines
Dịng thuần tái hợp
Polymorphism Information
Hệ số ña dạng gen
Content
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Quantitative trait loci
Những locut tính trạng số lượng
ða hình ADN được nhân bội ngẫu nhiên
Randomly amplified
polymorphic DNA
Restriction fragment length ða hình chiều dài đoạn phân cắt giới
polymorphisms
hạn
Resistance gene analog
Những yếu tố tương tự gen kháng
Super Fine Resolution
ðộ phân giải cao
Simple sequence repeats
Những trình tự lặp lại đơn giản
ða hình một nucleotit

Single nucleotide
polymorphisms

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT

Tên bảng

Trang

2.1

Danh sách các dịng/giống bơng cỏ nghiên cứu

47

2.2

Thành phần ñệm chiết

51

2.3

Thành phần ñệm rửa I

51

2.4

Thành phần đệm rửa II

52

2.5

Thành phần hóa chất của gel Polyacrylamide

53

2.6

Bố trí thời vụ cho các thí nghiệm đồng ruộng

55

2.7

Các cấp độ kháng, nhiễm bệnh xanh lùn

57

3.1

Các chỉ tiêu hình thái chính của các giống bơng cỏ, Ninh Thuận

năm 2009

3.2

63

Kết quả đánh giá lây nhiễm bệnh xanh lùn ở các dịng/giống
bơng cỏ

67

3.3

ða hình các locut SSR ở 31 giống bơng cỏ

69

3.4

Ma trận tương đồng/khoảng cách di truyền của các giống bơng
nghiên cứu theo Nei (1978)

3.5

75

Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ làm vật liệu lai
tạo quần thể

78

3.6

Danh sách các quần thể phân li sử dụng trong nghiên cứu

80

3.7

Kết quả ñánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh xanh lùn của các thế hệ của
quần thể

3.8

Phân ly kiểu hình tính kháng bệnh xanh lùn ở các thế hệ của các
cặp lai

3.9
3.10

82
84

Kết quả khảo sát đánh giá đa hình các chỉ thị SSR giữa giống
B10 và dịng KXL002

89

ðặc điểm các nhóm liên kết trong bản đồ di truyền

97

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


viii

3.11

So sánh phân ly kiểu gen và kiểu hình tính kháng bệnh xanh lùn của
quần thể BC1F1(B10xKXL002)xB10

3.12

Phân tích đồng phân ly giữa chỉ thị NAU1169 và gen kháng Kxl trên
NST số 10 của quần thể BC1F1(B10xKXL002)xB10

3.13

110
112

Phân tích đồng phân ly giữa chỉ thị BNL3646 và gen kháng Kxl trên
NST số 10 của quần thể BC1F1(KXL002xB10)xB10

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

112

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

Tên hình

Trang

2.1

Sơ đồ các bước triển khai thực hiện đề tài

2.2

Quy trình xác định nhóm liên kết genome và khoảng cách di
truyền giữa các chỉ thị SSR

2.3

50
59

Quy trình xác định vị trí gen kháng trên bản đồ nhiễm sắc thể và
các chỉ thị liên kết với gen kháng

60

2.4

Quy trình kiểm tra sự có mặt của gen kháng ở các cá thể BC1F1

61

3.1

Ảnh rệp bông gây hại trên cây bơng luồi D16-2

66

3.2

Thí nghiệm đánh giá bệnh của các dịng/giống bơng trong nhà lưới

68

3.3

Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu
với một số cặp mồi nhóm BNL trên gel agarose SFR 3,5%

3.4

Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số giống bông nghiên cứu với
một số cặp mồi nhóm NAU, TM và STV trên gel agarose 3,5%

3.5

72
73

Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của các giống bông nghiên
cứu theo khoảng cách di truyền

76

3.6

Sơ ñồ lai tạo quần thể

79

3.7

Các cấp ñánh giá bệnh xanh lùn ở cây bơng cỏ

81

3.8

Phân ly kiểu hình kháng/nhiễm bệnh xanh lùn ở quần thể F2
(B10xKXL002)

3.9

Kết quả ñánh giá đa hình giữa hai giống bơng B10 (BC75) và
KXL002 bằng chỉ thị SSR trên gel agarose SFR 3,5%

3.10

90

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi
BNL3395 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị ñồng trội/1 locut)

3.11

85

92

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi
BNL2656 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị đồng trội/nhiều locut)

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

92


x

3.12

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi
BNL3090 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị SSR trội khuếch
ñại 1 locut)

3.13

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi

BNL2921 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị ñồng trội)

3.14

100

Ảnh ñiện di sản phẩm PCR của các mồi BNL3359, BNL4053 với
các cá thể của quần thể F2 (B10 x KXL002)

3.21

99

So sánh vị trí chỉ thị SSR trên các nhóm liên kết LGA6, LGA11
với bản ñồ liên kết trên hệ gen A

3.20

98

So sánh vị trí chỉ thị SSR trên các nhóm liên kết LGA2 với bản
ñồ liên kết trên hệ gen A

3.19

96

So sánh vị trí chỉ thị SSR trên các nhóm liên kết 12a, b với bản
ñồ liên kết trên hệ gen A (G.arboreum) của Ma (2008) [112]

3.18

94

Bản đồ di truyền các nhóm liên kết ở cây bông cỏ (G. arboreum)
xây dựng từ quần thể F2 (B10xKXL002)

3.17

94

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi
TMD03 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị ñồng trội)

3.16

93

Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của quần thể F2 với cặp mồi
BNL3261 trên gel agarose SFR 3,5% (chỉ thị ñồng trội)

3.15

93

101

So sánh vị trí chỉ thị SSR BNL 3359 và BNL2569 trên các nhóm
liên kết LGA6, LGA7 với bản đồ liên kết trên hệ gen A của Ma
và cs (2008)

3.22

Vị trí gen kháng bệnh trên nhiễm sắc thể số 10 ñược xác ñịnh với
các chỉ thị SSR liên kết

3.23

106

Phân tích kiểu gen một số cá thể của quần thể BC1F1 với chỉ thị
NAU1169 trên gel agarose SFR 3,5%

3.24

103

109

Phân tích kiểu gen một số cá thể của quần thể BC1F1 với chỉ thị
BNL3646 trên gel Polyacrylamide 8%

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

109


1

MỞ ðẦU

1

Tính cấp thiết của đề tài
Bơng vải là một cây trồng lấy sợi tự nhiên và lấy dầu hàng ñầu thế giới,

ñược trồng tập trung tại nhiều khu vực ở hơn 80 nước, chiếm 2,5% diện tích
canh tác hàng năm tính trên tồn cầu và đạt sản lượng trên 25 triệu tấn
(Natural fibers website, 2009). Tuy nhiên, ngành trồng bơng ở các nước ln
phải đối mặt với nhiều loại bệnh dịch hại bông (Fang và cs., 2010; Connell
và cs., 1998).
Trong các loại bệnh hại bông, bệnh xanh lùn (cotton blue disease CBD) là loại bệnh gây hại chính ở cây bơng vải (Gossypium L.) và được lan
truyền bằng vector truyền bệnh là rệp bơng Aphis gossypii. Bệnh đã từng gây
thiệt hại kinh tế nghiêm trọng ở hầu hết các nước trồng bơng trên thế giới
trong đó có cả Việt Nam (Connell và cs., 1998; Lê Quang Quyền và cs.,
2007). Bệnh gây hại thường xuyên từ nửa cuối thập kỷ 60 của thế kỷ trước
với trên 25-30% diện tích trồng bông ở một số vùng và làm giảm 3-6% tổng
sản lượng bông (Watkins, 1981). Thiệt hại do dịch bệnh này ñã lên tới 80%
ñược ghi nhận ở nhiều bang của Bra-xin, Cộng hòa Trung Phi, Ác-hen-ti-na
… (Diste Fano và cs., 2010; Fang và cs., 2010; Silva và cs., 2008).
Ở nước ta, bệnh xanh lùn ñược ghi nhận lần ñầu tiên tại Nha Hố, Ninh
Thuận vào năm 1984-1985 và nhanh chóng lan rộng ra các tỉnh trồng bông cả
nước, làm giảm 10-15% năng suất bơng trung bình cả năm, có khi lên ñến 30%
(Lê Quang Quyền và cs., 2007). Cho tới nay, bệnh xanh lùn luôn là loại bệnh
gây hại nghiêm trọng nhất trên cây bơng vải (Nguyễn Thị Thanh Bình, 1997;
Nguyen và cs., 2002) và là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng lớn
cho việc mở rộng diện tích và nâng cao năng suất của ngành bông Việt Nam.
Hiện nay, các giống bơng tứ bội đang trồng phổ biến ở các vùng trồng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

1

2

bơng ở nước ta đều nhiễm bệnh xanh lùn, các giống kháng nhập nội khi ñược
khảo sát tại Nha Hố cũng đều nhiễm bệnh (Viện nghiên cứu Bơng và PTNN
Nha Hố, 2007). Con ñường lan truyền của bệnh trong tự nhiên qua côn trùng
môi giới là rệp bông (Aphis gossypii) rất khó phịng trừ và gây tổn hại mơi
trường (Nguyễn Thị Thanh Bình, 1999). Sử dụng thuốc hóa học để phịng trừ
bệnh sẽ gây ơ nhiễm mơi trường và là nguyên nhân tiềm tàng dẫn ñến sự bùng
phát của các dịch bệnh khác (Trần Thế Lâm, 2007).
Việc sử dụng giống kháng là lựa chọn tối ưu nhất trong công tác quản
lý bệnh cũng như giải quyết các vấn ñề liên quan đến mơi trường. Nguồn gen
kháng bền vững nhất là nguồn gen ñược chọn lọc từ các giống kháng tại ñịa
phương. Do vậy, nghiên cứu phát hiện nguồn gen kháng là cơng việc được
quan tâm khơng chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia khác.
Với sự phát triển nhanh chóng của cơng nghệ chỉ thị phân tử, nhiều
locut gen kháng sâu, bệnh, chống chịu với các ñiều kiện bất lợi của mơi
trường và các locut quy định tính trạng về năng suất, chất lượng ñã ñược ñịnh
vị trên bản đồ genome của cây bơng vải (Gossypium L.). Trong số các chỉ thị
phân tử, chỉ thị SSR là một thế hệ chỉ thị mới, thân thiện với người sử dụng và
số lượng SSR có mặt trong hệ gen bơng ñủ lớn ñể sử dụng hiệu quả trong
chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Rahman và cs., 2008; Zhang và cs.,
2008). Tuy nhiên, ñối với bệnh xanh lùn ở bơng, cho đến nay vẫn cịn rất ít
các cơng trình nghiên cứu về di truyền tính kháng bệnh, cũng như lập bản đồ
phân tử gen kháng phục vụ cho cơng tác chọn tạo giống bơng vải kháng bệnh.
Mặc dù đa phần các giống bơng đang được trồng lấy sợi trên thế giới là
bông tứ bội, nhưng trong các ngân hàng gen cây bông, bông cỏ lưỡng bội
Châu Á G. arboreum ñược ñánh giá là nguồn gen vật liệu mang nhiều ñặc
tính kháng sâu bệnh, chống chịu với ñiều kiện bất thuận (Ma và cs., 2008;

Adams và Palmer, 2003a). Trong ngân hàng cây bông ở nước ta, giống bông
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

2


3

cỏ Nghệ An là giống ñịa phương ñã ñược ñánh giá sơ bộ có khả năng kháng
được bệnh xanh lùn ở Việt Nam (ðặng Minh Tâm, 2006). Vì thế, cơng tác
ñánh giá chi tiết, nghiên cứu xác ñịnh cơ sở di truyền, lập bản đồ định vị gen
kháng này góp phần thúc đẩy cơng tác khai thác, sử dụng các nguồn gen này
trong các chương trình chọn giống bơng kháng bệnh xanh lùn ở nước ta.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất bông, nhằm cung cấp thêm cơ sở
khoa học trợ giúp cho công tác chọn tạo giống bơng kháng bệnh, chúng tơi đã
tiến hành đề tài “Xác ñịnh chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh xanh lùn
ở cây bông cỏ”.
2

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
Việc ñánh giá ña dạng di truyền, thiết lập bản ñồ gen kháng và xác ñịnh

chỉ thị gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ Nghệ An là một kết quả mới
trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen cây bơng nói chung và di truyền tính kháng
bệnh xanh lùn nói riêng ở giống bơng cỏ.
Việc xác ñịnh di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị phân tử SSR liên
kết với gen kháng bệnh xanh lùn ở giống bơng cỏ Nghệ An khơng chỉ nhằm
xác định nguồn gen mà còn mở ra khả năng khai thác ứng dụng trong chọn
tạo giống bông kháng bệnh xanh lùn ở nước ta.
3

Mục tiêu của ñề tài
ðề tài “Xác ñịnh chỉ thị phân tử liên kết gen kháng bệnh xanh lùn ở cây

bơng cỏ" được chúng tơi thực hiện nhằm tìm hiểu cơ sở di truyền tính kháng
bệnh xanh lùn ở cây bông ở mức phân tử, cung cấp cơ sở khoa học cho công
tác chọn tạo giống kháng bệnh nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, góp phần
tăng hiệu quả của cơng tác phịng trừ bệnh trong sản xuất bông ở nước ta.
Những mục tiêu cụ thể của ñề tài như sau:
- Xác ñịnh ñược di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở cây bơng cỏ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

3


4

- Xác ñịnh ñược chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng bệnh xanh
lùn ở cây bông cỏ.
4

Những ñóng góp mới của luận án
- Lần ñầu tiên ở Việt Nam, ñề tài ñã thiết lập ñược bản ñồ di truyền

gồm 14 nhóm liên kết tương ứng với 13 nhiễm sắc thể trên hệ gen A ở cây
bông cỏ Châu Á G. arboreum dựa trên chỉ thị phân tử SSR.
- ðây là cơng trình đầu tiên ở nước ta xác định được vị trí gen kháng
bệnh xanh lùn trên bản đồ di truyền ở dịng bơng cỏ địa phương KXL002 có
nguồn gốc thu thập tại Nghệ An.

- ðây cũng là cơng trình đầu tiên xác định được các chỉ thị SSR liên kết
với gen kháng bệnh xanh lùn trên cây bơng cỏ, trong đó có 2 chỉ thị liên kết ở
hai phía của gen kháng có thể sử dụng trong chọn tạo giống kháng bệnh xanh
lùn với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử.
5

ðối tượng và phạm vi nghiên cứu
- ðối tượng nghiên cứu gồm:
+ Các dịng/giống bơng cỏ có nguồn gốc thu thập từ tập đồn giống

bơng có nguồn gốc địa lý và các đặc điểm nơng sinh học, khả năng chống
chịu khác nhau.
+ Các cặp mồi SSR ñã ñược ñịnh vị trên khắp hệ gen cây bơng được
chọn lọc từ các bản đồ di truyền của các lồi bơng đã được cơng bố.
+ Bệnh xanh lùn hại bơng, liên quan đến cơn trùng mơi giới truyền
bệnh là rệp bơng.
- ðề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm, hệ thống nhà lưới, nhà
kính của Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội và Viện nghiên cứu Bông &
PTNN Nha Hố, Ninh Thuận.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

4


5

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI
1.1

Cây bơng và nghiên cứu đa dạng di truyền

1.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ và phân loại nguồn gen bơng (Gossypium L.)
Cây bơng là cây trồng lâu năm được trồng như cây trồng hàng năm.
Cây bông thuộc họ Malvaceae, chi Gossypium. Chi Gossypium có nhiều lồi,
rất đa dạng và ñược phân loài dựa trên phân bố ñịa lý, ñặc ñiểm hình thái và
các nghiên cứu giải phẫu tế bào học (Abdullaev, 2010; Xu và cs., 2004;
Fryxell, 1984).
Các loài khác nhau của chi Gossypium được tìm thấy ở nhiều vùng ñiều
kiện khí hậu nhiệt ñới và á nhiệt ñới. Hiện nay, chi bơng đã được phát hiện có
hơn 49 lồi (Wendel và cs., 2010).
Căn cứ vào những khác biệt kiểu hình và phân bố địa lý, Fryxell (1984)
đã chia các lồi trong chi bơng thành 4 chi phụ và 8 nhóm bơng. ða dạng
trong chi bơng khơng chỉ biểu hiện phong phú về hình thái và phân bố địa lý
tồn cầu, mà cịn đa dạng về tiến hóa của nhiễm sắc thể cây bông. Nghiên cứu
về tế bào học cho thấy, cho đến nay 49 lồi bơng được chia làm hai mức bội
thể với cách thức di truyền phức tạp: các lồi lưỡng bội có số nhiễm sắc thể
2n=26, các lồi bơng tứ bội có số nhiễm sắc thể 2n=52 (Flagel và Wendel,
2010; Wendel và cs., 1995).
Dựa vào cách thức bắt cặp trong kỳ giảm phân và kích thước nhiễm sắc
thể, nhóm bơng nhị bội được chia làm 8 kiểu hệ gen A, B, C, D, E, F, G hoặc
K (Frelichowski và cs., 2006; Fryxell, 1992).
Mặc dù chia làm 8 kiểu hệ gen, các lồi bơng nhị bội vẫn được chia 3
nhóm bơng chính với phân bố khắp các châu lục:
- Nhóm hệ gen A, bao gồm cả kiểu hệ gen B, E và F ñược phân biệt với
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

5

6

các nhóm bơng khác bởi cách thức bắt cặp và kích thước nhiễm sắc thể, và
đặc điểm sinh sản khi lai giữa các lồi (Wendel, 2010). Nhóm bơng này được
tìm thấy trong tự nhiên tại Châu Phi và Châu Á.
- Nhóm D-hệ gen có nguồn gốc xuất xứ tại Châu Mỹ.
- Nhóm bơng nhị bội thứ 3 gồm các lồi bơng có kiểu hệ gen C, G và K
được tìm thấy ở Châu Úc (Wendel và Cronn, 2003).
Trong mỗi loài, phân loại dưới lồi trong từng nhóm bơng nhị bội lại
ñược phân chia dựa trên các ñặc ñiểm tương ñồng hay khác biệt giữa các hệ
gen, ví dụ như G. herbaceum L. (A1) và Gossypium arboreum (A2) (Zhang
và cs., 2008). G.arboreum ñược phân biệt với G. herbaceaum bởi một vị trí
hốn vị trên nhiễm sắc thể số 1 và số 3; và ñược phân biệt với G. hirsutum bởi
3 vị trí hốn vị giữa nhiễm sắc thể số 1 và 3; 2 và 3; 4 và 5 (Guo và cs., 2007).
Tuy nhiên, bơng trồng trọt để lấy sợi chỉ có 4 loài: bao gồm hai dạng
nhị bội hệ gen A (2n=2x=26) là G. herbaceum (A1); G. arboreum (A2) và hai
dạng song lưỡng bội khác nguồn AD (2n=4x=52) là G. hirsutum (AD1) và
G.barbadense (AD2) (Guo và cs., 2007; Iqbal và cs., 2001; Mei và cs., 2004).
Lồi bơng cỏ (G. arboreum L.) ñược trồng chủ yếu ở Ấn ðộ, Pakistan,
loài G. herbaceum chỉ được trồng ở vùng khơ hạn của Châu Phi và Châu Á.
Lồi bơng hải đảo (G. barbadense) có chất lượng xơ bơng tốt nhất được trồng
ở Liên Xơ (cũ), Xu ðăng, Peru, Ấn ðộ… cung cấp khoảng 8% sản lượng sợi
trên thế giới. Bơng luồi (G. hirsutum) có chất lượng xơ kém hơn bơng hải
đảo, nhưng cho năng suất cao hơn và ñược trồng rộng rãi khắp nơi trên thế
giới, đóng góp khoảng 90% sản lượng bơng trên thế giới. Lồi bơng cỏ
G.arboreum có khả năng chống chịu sâu bệnh tốt nhất (Trần Thế Lâm, 2007)
và ñược ñánh giá là cung cấp nguồn gen kháng sâu bệnh và ñộ bền xơ cho các
chương trình chọn tạo giống bơng (Abdullaev, 2010).
Nghiên cứu hệ gen cho thấy, trong các lồi bơng lưỡng bội tổ tiên A và D,

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6


7

chỉ có các lồi bơng có hệ gen A là cho sợi (spinable) cịn các lồi lưỡng bội tổ
tiên có hệ gen D thì khơng. Vì thế, chiến lược nghiên cứu về cây bơng hướng
đến các đối tượng hệ gen bông lưỡng bội A (G. herbaceum và G.arboreum) và
D (G. raimonni) cũng như là hệ gen tứ bội AD1 và AD2 của G. hirsutum và G.
babadense nhằm giải ñáp nhiều câu hỏi quan trọng còn tồn tại về xuất xứ phân
lồi, tiến hóa hệ gen, cách thức kết hợp của hai hệ gen, các cơ chế di truyền …
chi phối biểu hiện tính trạng ở bơng tứ bội (Chen và cs., 2007).
1.1.2 ða dạng về kích thước, thành phần và trình tự genome cây bơng
Cây bơng có hệ gen lớn và phức tạp, là mơ hình điển hình để nghiên
cứu ña bội thể và các cơ chế di truyền bởi các trình tự lặp giữa các hệ gen
trong cùng một nhân.
Chiến lược hiệu quả ñể nắm bắt ñược sự ña dạng trong hệ gen tồn tại
giữa các lồi bơng là nghiên cứu xác định những khác biệt lớn về kích thước
hệ gen và sự sắp xếp tổ chức của các hệ gen lưỡng bội A và D hình thành nên
bơng tứ bội ngày nay (Chen và cs., 2007).
1.1.2.1 ða dạng về kích thước hệ gen cây bơng
Cơ sở phân tích hệ gen và cây phát sinh ñược thiết lập từ nhiều bộ dữ
liệu phân tử (Seelanan và cs., 1997; Senchina và cs., 2003; Small và cs.,
1999) cho thấy chi bông Gossypium L. đã trải qua q trình phân chia rất
nhanh chóng ngay sau khi phát sinh từ các dạng tổ tiên ban đầu, dẫn đến
nhiều lồi mới trong cùng một cây phả hệ đa dạng về kích thước và kiểu dạng
nhiễm sắc thể (các nhóm hệ gen, từ A đến G và K) (Cronn, 2002).
Mặc dù Gossypium là một chi tương đối trẻ có xuất xứ gần đây (~ 5-10

triệu năm) và tất cả các lồi bơng lưỡng bội đều có cùng số lượng bộ nhiễm
sắc thể cơ bản (x=13; 2x=26), tuy nhiên biến động về kích thước hệ gen lớn
gần gấp 3 lần khi so sánh giữa các loài trong chi (Hendrix và Stewart, 2005).
Kích thước hệ gen của cây bơng biến động tùy theo lồi: kích thước đơn bội nhỏ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

7


8

nhất được ghi nhận ở hệ gen D của lồi G. raimondii Ulbrich, ñạt khoảng 885
Mb. Hệ gen ñơn bội của G. arboreum có kích thước khoảng 1,7 Gb và G.
hirsutum có kích thước gần 2,5 Gb. Mặc dù cơ chế tạo nên biến động về kích
thước hệ gen ở bơng vẫn chưa được làm rõ, nhưng kết quả của nhiều cơng trình
nghiên cứu đã đi đến thống nhất rằng ngun nhân dẫn đến những biến động về
kích thước hệ gen là do biến động về thành phần và trình tự ADN (Hendrix và
Stewart, 2005; Wendel và cs., 2010; Hawkins, 2010).
1.1.2.2 ða dạng về thành phần ADN của hệ gen cây bơng
Hiện nay, ước tính thành phần ADN nhân đã ñược báo cáo ñối với 24
loài Gossypium ñại diện cho tám trong số chín nhóm gen (tính cả nhóm E) với
nhiều phương pháp khác nhau. Nghiên cứu chuẩn hóa phương pháp xác định
thành phần hệ gen bơng của Hedrix và Steward (2005) ñã ước lượng về biến
ñộng thành phần ADN hệ gen trong chi bông là gấp hơn 3 lần (giữa hệ gen D
của G. thurberi và K của G. nobile). Thành phần của hệ gen A lớn hơn gần gấp
đơi so với hệ gen D (2C= 3,5 pg và 1,8 pg) nhưng lại nhỏ gần một nửa so với
hệ gen K (2C= 3,5 pg và 5,6 pg). Những biến ñộng về thành phần ADN nhân
như vậy vẫn phù hợp trong phạm vi biến động ngành cây hạt kín khác.
Nghiên cứu về biến động thành phần ADN trong lồi ở G. hirsutum và
G. arboreum cũng ñược xác ñịnh dựa trên phân tích nhiều nguồn gen ở mỗi

lồi. ða dạng thành phần ADN trong lồi ở cả hai lồi đều thấp, cao nhất chỉ
ở mức 6% (G. hirsutum) và 4% (G. arboreum) (Hendrix và Stewart, 2005).
Những khác biệt về kích thước và thành phần này tiếp tục duy trì trong các
dạng lưỡng bội và ña bội tự nhiên (AD) cho ñến nay (Hendrix và Stewart,
2005; Senchina và cs., 2003; Wendel và cs., 2010).
Mặc dù có sự biến động gấp 3 lần về kích thước hệ gen trong các lồi
bơng lưỡng bội, mức ñộ bảo thủ của trật tự các gen là rất đáng kể khi so sánh
giữa các nhóm bơng lưỡng bội và ña bội (Desai và cs., 2006; Rong và cs.,
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

8


9

2004; Brubaker và cs.,1999). ðiều này cho thấy nghiên cứu thông tin giải mã
di truyền từ các thể bông lưỡng bội có thể được suy luận trực tiếp cho các lồi
bơng song lưỡng bội khác nguồn (Chen và cs., 2007). Vì thế những nghiên cứu
để lập bản đồ các tính trạng quan trọng và giải mã trình tự từng hệ gen bông
lưỡng bội A (G. herbaceum và G. arboreum), D (G.raimondii) sẽ giúp ích rất
nhiều trong cơng tác định hướng chọn giống để cải tiến các tính trạng của cây
bơng tứ bội, lồi chiếm gần 90% diện tích trồng bơng trên tồn thế giới.
1.1.2.3 ða dạng về trình tự ADN của hệ gen cây bơng
Cho đến nay, phần lớn các kết quả nghiên cứu đều đi đến thống nhất
rằng chính sự khác biệt về số lượng các trình tự ADN khơng mã hóa
(noncoding DNA) đã chi phối biến động về kích thước hệ gen cây bơng. Ở
thực vật nói chung, sự mở rộng của hệ gen phần lớn là do: ña bội hóa, sự
khuyếch ñại các yếu tố nhảy (TE) (Wendel, 20020); cộng với những quá trình
như tăng số lượng các yếu tố gen giả (pseudogene),(Zhang, 2011) tăng kích
thước vùng intron (Deutsch và Long, 1999; Vinogradov, 1999), và sự kết hợp

của các đoạn từ genome mạch vịng tế bào chất (organeller) vào gen nhân
(Adams và Palmer, 2003; Shahmuradov và cs., 2003). Sự kết hợp của từng
yếu tố này sẽ gây nên biến ñổi phức tạp và cồng kềnh của hệ gen. Cách duy
nhất để tìm hiểu sự phát triển của hệ gen phức tạp là ñi từ những hệ gen nhỏ
hơn trong cây phân loài (Leitch, 1998; Wendel và cs., 2002).
Hệ gen bơng có tới 30-60% vùng gen có chứa các trình tự lặp, và có
nhiều vùng tương đồng tồn tại giữa hệ gen At và Dt ở các thể ña bội ñược
phát hiện (Husein và cs., 2007). Trình tự lặp vi vệ tinh ñược nhiều tác giả sử
dụng trong nghiên cứu đa dạng giữa các lồi bơng. Nghiên cứu của Zhao và
cs. (1998) đã khảo sát hơn 100 trình tự lặp phổ biến nhất ở hệ gen bông tứ bội
và kết quả cho thấy có 4 kiểu lặp phổ biến ở hệ gen D, nhưng rất hiếm hoặc
không xuất hiện trên hệ gen A.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

9


10

Syed và cs. (2001) đã phân tích sự khác biệt giữa các trình tự lặp vi vệ
tinh (microsatellite) ở hệ gen A và D lưỡng bội và hệ gen AD song lưỡng bội,
và ñã kết luận rằng trong số 107 locut SSR nghiên cứu, 30-50% có cùng kích
thước alen ở cả 3 loại hệ gen, nhưng hơn một nửa số locut đó có trình tự đa
dạng (ngắn hoặc dài hơn) ở các thể tứ bội. Phân tích trình tự vi vệ tinh nghiên
cứu trên các lồi bơng của Hirut và cs. (2007) cho thấy đa dạng trình tự giữa
các lồi có hệ gen A là do sự thêm hay bớt các trình tự lặp hai nucleotit. Mặc
dù vậy, biến động về trình tự khác ngồi trình tự lặp đơi cũng ñược ghi nhận
giữa hệ gen A và hệ gen AD. Biến động về trình tự này được tác giả giải thích
là do có sự đa dạng giữa hệ gen A cịn tồn tại cho đến nay và tổ tiên của hệ
gen phụ A hiện đã khơng cịn tồn tại của các lồi bơng trồng trọt. Tuy nhiên,

các tác giả cho rằng cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn để làm sáng tỏ kết luận
này (Hirut và cs., 2007). Nhóm tác giả cũng đã phân tích các trình tự của các
locut SSR và phát hiện khơng chỉ số lượng các trình tự lặp 2 nucleotit mà cả
các trình tự xen kẽ các trình tự lặp (sequence flanking the repeat) cũng tạo nên
sự đa dạng về kích thước các alen. Vì thế, nhóm tác giả đã cho rằng sau khi đa
bội hóa, các alen vi vệ tinh có thể đã tiến hóa nhanh chóng ở dạng song lưỡng
bội bằng cách giảm hoặc tăng các trình tự lặp hai nucleotit. Hai nhóm tác giả
Zhao và cs. (1998) và Zhang và cs. (2003) cũng đã kết luận trước đó rằng
trong q trình đa bội hóa, 52 nhiễm sắc thể ở các dạng tứ bội ñã phân tách
nhanh chóng từ các hệ gen tổ tiên của chúng, ñặc biệt ñối với dạng hệ gen phụ
D. Nghiên cứu của Liu và cs. (2006) cũng thu ñược kết quả tương tự về biến
thiên của các trình tự lặp SSR. Kết quả nghiên cứu đa dạng các trình tự lặp
giữa các hệ gen khơng chỉ có ý nghĩa trong phân tích tiến hóa, mà cịn có ý
nghĩa quan trọng trong ứng dụng phát triển loại chỉ thị SSR ñể ứng dụng
trong nghiên cứu giữa các hệ gen, ña dạng di truyền, thiết kế mồi và ứng dụng
trong chọn giống…

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

10


11

Cho ñến nay, ña phần các chỉ thị SSR loại BNL ñều ñược thiết kế dựa
trên hệ gen tứ bội (Liu và cs., 2006). Liu và cs. (2000b) ñã ñưa ra tính tốn
rằng nhiệt độ gắn mồi giữa chỉ thị và mẫu có thể ảnh hưởng và cho kết quả
khác nhau giữa mẫu ADN của bông tứ bội và các hệ gen lưỡng bội khác nhau.
Tỷ lệ khuyếch ñại thu được ở các lồi bơng khác nhau tương đối cao khi
sử dụng các chỉ thị ñược thiết kế từ các loài lưỡng bội (An và cs., 2008; Zhang

và cs., 2007; Wang và cs., 2006; Park và cs., 2005). ðiều này chứng thực khả
năng ứng dụng các chỉ thị giữa các lồi bơng.
Các trình tự EST (expressed sequence tag) được lấy từ hệ gen lồi G.
arboreum để khuyếch đại trên hệ gen G. hirsutum cho tỷ lệ 33% các cặp mồi
EST cho sản phẩm khuyếch đại từ các vùng khơng lặp (single copy loci) (Chee
và cs., 2004). Allen và cs. (2009) cũng thu ñược kết quả tương tự, 38% tỷ lệ EST
có nguồn gốc G. Arboreum khuyếch đại thành cơng trên hệ gen G. hirsutum.
1.1.2.4 Nghiên cứu ña dạng giữa các phần gen lặp trong hệ gen cây bơng
Ở lồi có thể đa bội như cây bơng, những nghiên cứu về sự tương đồng
trình tự giữa các hệ gen như: so sánh giữa các hệ gen, nghiên cứu các phần lặp
của hệ gen, tiến hóa sau khi lặp gen, đã góp phần bổ sung các ñặc ñiểm biểu
hiện tương ñồng giữa các hệ gen phụ trong bông tứ bội (Chaudhary và cs.,
2009; Flagel và cs., 2008). Khảo sát các gen lặp (duplicated) có thể cho biết về
tiến hóa phân tử (Cronn và cs., 1999), kiểu và mức ña dạng nucleotit (Small và
cs., 1999), biểu hiện gen câm ở thể ña bội (Adams và cs., 2003).
Nghiên cứu về so sánh các trình tự và kích thước các vùng gen tương đồng
(vùng gen lặp tại một vị trí locut) giữa At và Dt ñã ghi nhận một số kết quả bước
ñầu. Các kết quả nghiên cứu cho thấy mức ñộ bảo thủ và ña dạng của các thành
phần của gen ñược ghi nhận khác nhau ñối với từng vùng gen nằm trên các vùng
nhiễm sắc thể khác nhau (Allen và cs., 2009; Wendel và cs., 2010; Grover và cs.,
2007; Small và cs., 1999).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

11


12

Căn cứ vào biến ñộng của hơn 200.000 nucleotit (với khoảng 40.000
nu/hệ gen), kết quả nghiên cứu của Wendel & Cronn (2003) cho thấy các thể

đa bội ở bơng có tỷ lệ thay thế nucleotit ở mức trung bình. Tuy khơng xác
định được sự khác biệt đáng kể giữa các gen ñược nghiên cứu trên hệ gen At
và Dt trong bơng đa bội, nghiên cứu này cho thấy tổng số các biến ñộng về
thay thế nu ở hệ gen ña bội (At và Dt) cao hơn khoảng 20% so với hệ gen
lưỡng bội tương ứng.
Những phân tích so sánh trình tự ñược tiến hành với 48 vùng gen ñã
củng cố thêm cho những phân tích trước đó về tiến hóa gen lặp ở bông song
lưỡng bội (Cronn và cs., 1999), nghiên cứu ñã chỉ ra rằng các nhiễm sắc thể
tương đồng trong các thể bơng đa bội tiến hóa độc lập với nhau trong nhân
song lưỡng bội. Và các tác giả cũng ñã ủng hộ giả thuyết cho rằng tương tác
của các vùng lặp (single copy duplicated) giữa các hệ gen là khơng phổ biến ở
các thể bơng đa bội. Kết luận tương tự cũng thu ñược khi nghiên cứu về 242
cặp gen lặp ở cây Arabidopsis cổ ñại (Senchina và cs., 2003).
Mức ñộ tương ñồng cao cũng ñược ghi nhận giữa các vùng exon của cả
hai hệ gen A và D (Allen và cs., 2009). Nhóm tác giả đã thực hiện phân tích
đa hình nucleotit (SNP) và đa dạng các Indel của 270 locut tương đồng đa
hình (single-copy polymorphic loci) ở hơn 20 dịng/giống bơng trong đó có 2
lồi ña bội là G.arboreum và G. raimonii và các dòng tứ bội G. hirsutum và
G.barbadense. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy hệ gen A và D ở cả các
lồi lưỡng bội và đa bội đều giữ những đặc ñiểm khác biệt riêng (distinct) với
nhau trên những ñoạn tương ñồng giữa hai hệ gen (paralog). Từ kết quả
nghiên cứu này, Allen và cs. (2009) cũng ñưa ra khuyến cáo: tại các vùng
genome phát hiện có đa dạng di truyền, cần phải xây dựng các phương pháp
ñể xác ñịnh liệu có đa dạng alen và có đa dạng giữa các vùng genome tương
đồng hay khơng (Allen và cs., 2009).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

12

13

1.1.2.5 ða dạng trình tự giữa các vùng khơng lặp
ða dạng trình tự giữa các vùng khơng lặp lại trong từng lồi bơng cũng đã
được ghi nhận cho dù cịn rất hạn chế về số lượng nghiên cứu. ða dạng trong
lồi đối với G. hirsutum và G. barbadense biến động từ 1-3 SNP/983bp (tương
ñương với tỷ lệ 0,1-0,3%) (Small và cs., 1999). Với rất ít cơng trình được cơng
bố về tần suất xuất hiện SNP ở bông và với số lượng lấy mẫu nghiên cứu khác
nhau, trong loài G. hirsutum, tần suất xuất hiện SNP biến ñộng ñược ghi nhận là
0/1.000bp ở vùng gen AdhA, 1/5.000bp cho ñến 1/947bp ở gen Myb và các
vùng gen liên quan (An và cs., 2008; An và cs., 2007; Hsu và cs., 2008). Tuy
nhiên, tần suất SNP thu ñược ở G.arboreum và G. hirsutum thấp hơn hai lần so
với các lồi khác, được ghi nhận lần lượt: 1/2.546bp và 1/2.474 (tương ñương
với 0,04%) khi nghiên cứu trên hơn 570 locut đơn. G. barbadense có tỷ lệ đa
dạng trong lồi lớn nhất với tần suất xuất hiện SNP 1/1381 và 28% locut cho đa
hình. G.hirsutum ñạt tần suất xuất hiện indel lớn nhất trong khi các lồi tổ tiên
lưỡng bội lại có tỷ lệ này thấp nhất (Allen và cs., 2009).
1.1.3 Nghiên cứu ña dạng di truyền ở cây bông sử dụng chỉ thỉ phân tử
Một trong những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống là phân
tích đa dạng di truyền. Trong phân loại học, những chỉ thị phân tử phản ánh
những biến dị di truyền về trình tự ở cả những vùng mã hóa và khơng mã hóa.
Bên cạnh đó, sử dụng các chỉ thị trong xác ñịnh khoảng cách giữa các nền di
truyền cây bông là một ứng dụng hữu ích trong chọn giống MAS, một hướng
ñi hiệu quả trong chọn giống bơng lấy sợi có định hướng hiện nay (Kalivas và
cs., 2011). Vì vậy, nhiều cơng trình sử dụng chỉ thị phân tử ñể nghiên cứu ña
dạng di truyền ñã ñược thực hiện ñể làm sáng tỏ những ñiều còn vướng mắc,
củng cố thêm chứng cứ cho phân loại học giúp cho cơng tác bảo tồn, tìm vật
liệu chọn giống thích hợp và phát triển các chương trình chọn giống cây bông
(Canadida và cs., 2006).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận án tiến sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

13