Phân lập agrobacterium rhizogenes và nghiên cứu ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp vinca ankaloid của rễ tơ cây dừa cạn (cantharanthus roseus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NHƯ NHỨT

PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU
ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NHƯ NHỨT

PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes VÀ NGHIÊN CỨU
ẢNH HƯỞNG LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus)

Ngành: Sinh học
Mã số ngành: 62 42 30 15
Phản biện 1: PGS. TS. Dương Tấn Nhựt
Phản biện 2: PGS.TS. Lê Thị Thủy Tiên
Phản biện 3: TS. Phan Tường Lộc
Phản biện độc lập 1: PGS. TS. Dương Tấn Nhựt

Phản biện độc lập 2: TS. Phan Tường Lộc
NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS. BÙI VĂN LỆ

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi dưới sự giám sát và
hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Bùi Văn Lệ. Các kết quả thu được trong luận án
là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất cứ cơng trình nào.
Tác giả luận án

Nguyễn Như Nhứt

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gởi lởi cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS. TS. Bùi Văn Lệ, thầy là người
hướng dẫn khoa học duy nhất để tơi hồn thành luận án này. Xin cảm ơn thầy đã
luôn dõi theo để hỗ trợ và hướng dẫn tơi tận tình trong suốt những năm qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn ông Trần Văn Thanh, Chủ tịch Hội đồng Thành
viên Công ty TNHH Gia Tường đã đầu kinh phí, cho tơi sự tự do cũng như luôn ủng
hộ tôi theo đuổi con đường mà tôi đã chọn.
Tôi cũng xin được cảm ơn:
Các thầy cơ Chun ngành Hóa Sinh đã dành thời gian và công sức để truyền
đạt cho tôi kiến thức chuyên ngành trong khóa học.
Các thầy cơ PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu, PGS. TS. Phạm Thị Ánh Hồng,
PGS. TS. Nguyễn Đức Lượng, PGS. TS. Nguyễn Tiến Thắng, PGS. TS. Ngô Đại

Nghiệp, TS. Nguyễn Quốc Bình, TS. Hồng Quốc Khánh và TS. Lê Phi Nga là
thành viên Hội đồng đánh giá đề cương và các chuyên đề đã có những ý kiến đóng
góp quan trọng để tơi hồn thiện luận án.
PGS. TS. Phan Thị Phượng Trang, PGS. TS. Quách Ngô Diễm Phương, NCS.
Bùi Thế Vinh, NCS. Vũ Thị Bạch Phượng và các thành viên phịng thí nghiệm của
Chi nhánh Cơng ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương đã giúp đỡ tơi trong thời
gian thực hiện luận án.

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan ....................................................................................................... i i
Lời cảm ơn .......................................................................................................... ii ii
Mục lục ............................................................................................................ iiiiii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ............................................................... vii
vi
Danh mục các bảng ............................................................................................. xix
Danh mục các hình ảnh, đồ thị ............................................................................ xiv
xii
Chương mở đầu ................................................................................................. 1 1
Chương 1 – Tổng quan ..................................................................................... 5 5
1.1. Giới thiệu sơ lược về Agrobacterium rhizogenes ...................................... 6 6
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................... 6 6
1.1.2. Tình hình phân loại ........................................................................... 7 7
1.1.3. Phân bố và hình thái ......................................................................... 8 8
1.1.4. Sinh lý và biến dưỡng ....................................................................... 9 9
1.1.5. Khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật ........................................ 1010
1.2. Giới thiệu sơ lược về cây Dừa cạn ............................................................ 1313

1.2.1. Nguồn gốc, hình thái và phân bố ...................................................... 1313
1.2.2. Vinca alkaloid ................................................................................... 1414
1.3. Sơ lược về rễ tơ ........................................................................................... 1717
1.3.1. Kỹ thuật cảm ứng tạo rễ tơ ............................................................... 1717
1.3.2. Thiết lập quy trình ni cấy rễ tơ ..................................................... 1818
1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng A. rhizogenes trong khai thác rễ
tơ Dừa cạn ................................................................................................. 2121
Chương 2 – Vật liệu và phương pháp ............................................................. 2626
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 2727
2.2. Vật liệu ........................................................................................................ 2727
2.2.1. Mẫu đất dùng để phân lập Agrobacterium rhizogenes ..................... 2727
2.2.2. Các chủng vi sinh vật ....................................................................... 2727
2.2.3. Vật liệu thực vật ............................................................................... 2727
2.2.4. Các hóa chất, dụng cụ và thiết bị ...................................................... 2828
2.2.5. Môi trường MG-Te dùng để phân lập chọn lọc Agrobacterium ....... 2929
2.2.6. Các mơi trường dùng kiểm tra đặc tính sinh hóa, nuôi cấy và
bảo quản A. rhizogenes .................................................................... 3030
2.2.7. Các môi trường nuôi cấy mô thực vật .............................................. 3030
2.3. Phương pháp ............................................................................................... 3030
2.3.1. Phương pháp phân lập chọn lọc Agrobacterium .............................. 3030

iii


2.3.2. Các phương pháp kiểm tra các đặc tính hình thái và sinh hóa
của A. rhizogenes .............................................................................
2.3.3. Phương pháp ni cấy tăng sinh A. rhizogenes ................................
2.3.4. Phương pháp nhận diện A. rhizogenes bằng kiểm tra bệnh học........
2.3.5. Phương pháp gây nhiễm cảm ứng rễ tơ trên cây Dừa cạn in
vitro ..................................................................................................

2.3.6. Phương pháp chuẩn bị dịng rễ tơ và ni cấy trên môi trường
thạch ................................................................................................
2.3.7. Phương pháp nuôi cấy rễ tơ trên môi trường lỏng ...........................
2.3.8. Phương pháp tách chiết alkaloid tổng số ..........................................
2.3.9. Phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích các Vinca alkaloid ........
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................
2.4.1. Tóm tắt nội dung thí nghiệm ............................................................
2.4.2. Phân lập thu nhận A. rhizogenes ......................................................
2.4.3. Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ cây Dừa cạn ........
2.4.4. Chọn lọc điều kiện nuôi cấy và bảo quản rễ tơ cây Dừa cạn ...........
2.4.5. Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn trên môi
trường lỏng ......................................................................................
2.4.5.1. Sàng lọc dịng rễ tơ ...............................................................
2.4.5.2. Nghiên cứu ni cấy tăng sinh khối rễ tơ .............................
2.4.5.3. Xác định động học tăng trưởng sinh khối của các dòng
rễ tơ chọn lọc ........................................................................
2.4.6. Đánh giả khả năng sinh tổng hợp alkaloid của cây Dừa cạn in
vivo được xâm nhiễm với A. rhizogenes và rễ tơ .............................
2.5. Phương pháp phân tích số liệu ..................................................................
Chương 3 – Kết quả và thảo luận ....................................................................
3.1. Phân lập Agrobacterium rhizogenes ..........................................................
3.1.1. Thu thập mẫu đất để phân lập Agrobacterium rhizogenes ...............
3.1.2. Phân lập chọn lọc Agrobacterium ....................................................
3.1.3. Nhận diện A. rhizogenes bằng các xét nghiệm sinh hóa ..................
3.1.4. Nhận diện A. rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ bằng
xét nghiệm bệnh học ........................................................................
3.1.4.1. Khả năng xâm nhiễm gây triệu chứng rễ tơ trên cây họ
đậu in vivo .............................................................................
3.1.4.2. Khả năng xâm nhiễm gây triệu chứng rễ tơ trên cây
Dừa cạn in vivo .....................................................................

3.1.5. Nhận diện A. rhizogenes bằng kỹ thuật sinh học phân tử ................

iv

3030
3131
3131
3232
3333
3333
3434
3434
3535
3535
3636
3737
3838
3939
3939
4040
4141
4242
4242
4343
4444
4444
4444
4646
4747
4848

5050
5050


3.1.6. Một số đặc điểm tăng trưởng của các chủng A. rhizogenes đã
thu nhận được .................................................................................. 5252
3.2. Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ chuyển gen cây Dừa cạn in vitro ................ 5353
3.2.1. Sàng lọc chủng A. rhizogenes ........................................................... 5353
3.2.2. Xác định điều kiện thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ .......................... 5656
3.2.2.1. Ảnh hưởng của loại mô ........................................................ 5757
3.2.2.2. Ảnh hưởng của các hợp chất phenol .................................... 5757
3.2.2.3. Ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn, thời gian ngâm
mẫu và thời gian ủ cảm ứng ................................................. 6060
3.2.2.4. Ảnh hưởng của ánh sáng trong gian đoạn ủ cảm ứng và
ủ loại nhiễm vi khuẩn ........................................................... 6363
3.2.2.5. Ảnh hưởng của mơi trường khống cơ bản, nguồn và
nồng độ của nguồn đường .................................................... 6565
3.2.3. Đề xuất quy trình cảm ứng tạo rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn ............. 6868
3.3. Điều kiện nuôi cấy và bảo quản rễ tơ Dừa cạn trên môi trường
thạch ........................................................................................................... 6969
3.4. Nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ Dừa cạn ..................................................... 7373
3.4.1. Sàng lọc dòng rễ tơ ........................................................................... 7373
3.4.2. Chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh rễ tơ ..................................... 7777
3.4.3. Đường cong tăng trưởng của các dòng rễ tơ .................................... 8282
3.5. Khả năng sinh tổng hợp alkaloid của rễ tơ và của cây Dừa cạn in
vivo được gây nhiễm với A. rhizogenes ................................................... 8383
3.5.1. Ảnh hưởng của A. rhizogenes trên sự phát triển của cây Dừa
cạn in vivo ........................................................................................ 8383
3.5.2. Khả năng sinh tổng hợp alkaloid của cây Dừa cạn in vivo được
gây nhiễm với A. rhizogenes ........................................................... 8585

3.5.3. Khả năng sinh tổng hợp alkaloid của rễ tơ Dừa cạn ........................ 9090
3.5.4. So sánh khả năng sinh tổng hợp alkaloid của rễ tơ với rễ cây
Dừa cạn in vivo và tiềm năng ứng dụng trong sản xuất alkaloid
93
Chương 4 – Kết luận và đề nghị ...................................................................... 9797
4.1. Kết luận .................................................................................................... 9898
4.2. Đề nghị
.................................................................................................... 9999
Các công trình có liên quan .............................................................................. 100
100
Tài liệu tham khảo ............................................................................................ 102
102
Phụ lục

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ajm

: Ajmalicine

B5

: Gamborg’B5

Cat

: Catharanthine

DHa

: Đất vùng rễ dưa hấu

DLe

: Đất vùng rễ dưa leo

DP

: Development of disease - Tỷ lệ cây biểu hiện bệnh

DWf

: Final dry weight - Trọng lượng khô tại thời điểm phân tích

DXP

: Deoxyxylulose Phosphate

ĐBa

: Đất vùng rễ đậu bắp

ĐĐe

: Đất vùng rễ đậu đen

ĐĐu

: Đất vùng rễ đậu đũa

ĐNa

: Đất vùng rễ đậu nành

ĐPh

: Đất vùng rễ đậu phộng

ĐQu

: Đất vùng rễ đậu que

ĐXa

: Đất vùng rễ đậu xanh

E4P

: Erthrose-4-phosphate

Ep

: Effect of phenol - Phần trăm thay đổi của tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ

FGI

: Fresh growth index - Chỉ số tăng trưởng trọng lượng tươi

Fru

: Fructose

FWf

: Final fresh weight - Trọng lượng rễ tươi cuối (khi phân tích)

FWi

: Initial fresh weight - Trọng lượng rễ tươi ban đầu (rễ nguồn)

Glu

: Glucose

HRd

: Development of hairy root - Tỷ lệ số dòng rễ tơ phát triển rễ mới

vi


I

: Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ

IJSEM

: The International Journal of Systematic & Evolutionary
Microbiology – Tạp chí Quốc tế Vi sinh học hệ thống và tiến hóa

Lua

: Đất vùng rễ lúa nước

MAC

: MacConkey Agar

malkaloid

: Hàm lượng alkaloid tổng số

MG

: Mannitol Glutamate broth

MS

: Murashige & Skoog

ORCA2

: Octadecanoid-Responsive Catharanthus AP2-domain proteins

ORF

: Open Reading Frame

PGA

: Potato glucose agar

plasmid Ri

: Root inducing plasmid - Plasmid cảm ứng tạo rễ tơ

rol

: Root oncogene locus

SH

: Schenk & Hildebrandt

Suc

: Sucrose

TIA

: Terpenoid Indole Alkaloid

T-DNA

: Transfer deoxyribonucleic acid – DNA được chuyển

TL/R-DNA

: Left/Right Transfer DNA - DNA trái/phải được chuyển

TSA

: Trypticase Soy Agar

TSI

: Triple Sugar Iron Agar

VBL

: Vinblastine

VCR

: Vincristine

Vin

: Vindoline

vir

: vùng gen gây nhiễm

W

: White

vii


Yalkaloid

: Yeild of alkaloid - Năng suất alkaloid tổng số

Ydb

: Yeild of dry biomass - Năng suất sinh khối khô

YEMA

: Yeast Extract Mannitol Agar

YMB

: Yeast Extract Mannitol Broth

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt một số sự kiện quan trọng trong lịch sử nghiên cứu A.
rhizogenes .......................................................................................... 6i
Bảng 1.2. Một số ứng dụng biểu hiện vượt mức các gen trong rễ tơ Dừa
cạn ...................................................................................................... 22
22

Bảng 3.1. Tổng hợp số lượng các loại mẫu dùng để phân lập ............................ 44
44
Bảng 3.2. Số dòng khuẩn lạc thu được trên mơi trường MG-Te ........................ 46
46
Bảng 3.3 Các đặc điểm hình thái và sinh hóa học nhận diện 34 dịng khuẩn
lạc có đặc điểm tương tự với A. rhizogenes ....................................... 47
47
Bảng 3.4. Kết quả so sánh bắt cặp đoạn gen 16s rDNA trên ngân hàng dữ
liệu NCBI và nhận diện gen rolABC ở 13 dòng vi khuẩn ................ 52
52
Bảng 3.5. Bảng tổng hợp nguồn gốc và một số điều kiện tăng trưởng của
13 chủng A. rhizogenes đã thu nhận được có khả năng chuyển
gen cảm ứng rễ tơ trên cây Dừa cạn .................................................. 52
52
Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ trên bốn giống Dừa cạn được cảm ứng
bằng các chủng A. rhizogenes ............................................................ 54
54
Bảng 3.7. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ trên các loại mô khác nhau ..................... 57
57
Bảng 3.8. Mức độ ảnh hưởng của các phenol khác nhau lên tỷ lệ mẫu hình
thành rễ tơ .......................................................................................... 58
58
Bảng 3.9. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi huyền phù vi khuẩn được bổ
sung các nồng độ khác nhau phenol được chọn lọc .......................... 59
59
Bảng 3.10. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi bổ sung phenol vào huyền phù
vi khuẩn và môi trường ủ cảm ứng .................................................. 60
60
Bảng 3.11. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi mật độ tế bào vi khuẩn
61

Bảng 3.12. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi thời gian ngâm mẫu .......... 62
62
Bảng 3.13. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi thời gian ủ cảm ứng .......... 63
63
Bảng 3.14. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi cường độ ánh sáng
trong giai đoạn ủ cảm ứng ............................................................... 64
64
Bảng 3.15. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi cường độ ánh sáng
trong giai đoạn ủ loại nhiễm vi khuẩn ............................................. 65
65
Bảng 3.16. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi mơi trường khống cơ
bản để ni cấy mẫu ........................................................................ 66
66
Bảng 3.17. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi nguồn đường trong
môi trường để nuôi cấy mẫu ............................................................ 67
67
ix


Bảng 3.18. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ tơ khi thay đổi nồng độ đường trong
môi trường để nuôi cấy mẫu ............................................................ 67
67
Bảng 3.19. Tóm tắt các yếu tố thích hợp được đề xuất khi cảm ứng tạo rễ
tơ trên bốn giống Dừa cạn VIN002, VIN005, VIN072 và
VIN077 ............................................................................................ 68
68
Bảng 3.20. Tỷ lệ dòng rễ tơ phát triển trên các mơi trường thạch khác nhau
70
Bảng 3.21. Tỷ lệ dịng rễ tơ phát triển trên các môi trường thạch ở các
cường độ chiếu sáng khác nhau ....................................................... 70

70
Bảng 3.22. Tỷ lệ dòng rễ tơ mang gen rol sau 12 tháng cấy chuyền bảo
quản liên tục trên môi trường thạch ................................................. 72
72
Bảng 3.23. Chỉ số tăng trưởng trung bình và khả năng sinh tổng hợp
alkaloid trung bình của bốn nhóm dịng rễ tơ từ bốn giống Dừa
cạn .................................................................................................... 74
74
Bảng 3.24. Chỉ số tăng trưởng của các dịng rễ tơ trên các mơi trường lỏng
78
Bảng 3.25. Năng suất sinh khối khô của các dịng rễ tơ trên các mơi
trường lỏng ...................................................................................... 78
78
Bảng 3.26. Chỉ số tăng trưởng của các dòng rễ tơ ở mơi trường có pH ban
đầu khác nhau .................................................................................. 79
79
Bảng 3.27. Năng suất sinh khối khơ của các dịng rễ tơ ở mơi trường có
pH ban đầu khác nhau ..................................................................... 79
79
Bảng 3.28. Chỉ số tăng trưởng của các dòng rễ tơ ở mơi trường có nguồn
carbon khác nhau ............................................................................. 80
80
Bảng 3.29. Năng suất sinh khối khơ của các dịng rễ tơ ở mơi trường có
nguồn carbon khác nhau .................................................................. 80
80
Bảng 3.30. Chỉ số tăng trưởng của các dòng rễ tơ ở mơi trường có nồng độ
sucrose khác nhau ............................................................................ 81
81
Bảng 3.31. Năng suất sinh khối khơ của các dịng rễ tơ ở mơi trường có
nồng độ sucrose khác nhau .............................................................. 82

82
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của A. rhizogenes trên chiều cao của cây Dừa cạn
in vivo .............................................................................................. 83
83
Bảng 3.33. Ảnh hưởng của A rhizogenes trên trọng lượng tươi của cây
Dừa cạn in vivo ................................................................................ 84
84
Bảng 3.34. Ảnh hưởng của A. rhizogenes trên trọng lượng khô của cây
Dừa cạn in vivo ................................................................................ 84
84
Bảng 3.35. Hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn in vivo được gây
nhiễm với A. rhizogenes .................................................................. 85
85

x


Bảng 3.36. Hàm lượng alkaloid thành phần của cây Dừa cạn VIN002 in
vivo được gây nhiễm với A. rhizogenes C18 ................................... 86
86
Bảng 3.37. Hàm lượng alkaloid thành phần của cây Dừa cạn VIN005 in
vivo được gây nhiễm với A. rhizogenes C18 ................................... 87
87
Bảng 3.38. Hàm lượng alkaloid thành phần của cây Dừa cạn VIN072 in
vivo được gây nhiễm với A. rhizogenes C18 ................................... 87
87
Bảng 3.39. Hàm lượng alkaloid thành phần của cây Dừa cạn VIN077 in
vivo được gây nhiễm với A. rhizogenes C26 ................................... 87
87
Bảng 3.40. So sánh khả năng sinh tổng hợp các alkaloid trong lá và rễ cây

Dừa cạn bị A. rhizogenes xâm nhiễm so với đối chứng sau 90
ngày gieo hạt .................................................................................... 88
88
Bảng 3.41. Hàm lượng alkaloid tổng số trong các dòng rễ tơ ............................ 90
90
Bảng 3.42. So sánh hàm lượng các alkaloid trong bốn dòng rễ tơ chọn lọc
91
Bảng 3.43. So sánh khả năng sinh tổng hợp các alkaloid trong rễ tơ và rễ
đối chứng in vivo ............................................................................. 92
92
Bảng 3.44. So sánh hàm lượng alkaloid tổng số trong rễ tơ và trong rễ cây
in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes với rễ cây
đối chứng ......................................................................................... 94
94
Bảng 3.45. So sánh đặc điểm, điều kiện nuôi cấy và khả năng sinh tổng
hợp Vinca alkaloid của các dòng rễ tơ chọn lọc .............................. 95
95

xi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Sự sắp xếp của các gen chức năng chính trên T-DNA của
plasmid Ri .......................................................................................... 12
12 i
Hình 1.2. Sơ đồ Ishikawa thể hiện những sự thay đổi có thể có khi chuyển
gen bằng Agrobacterium .................................................................... 13
13
Hình 1.3. Một số giống Dừa cạn và quá trình phát triển của quả ....................... 14

14
Hình 1.4. Con đường và vị trí sinh tổng hợp Vinca alkaloid ở cây Dừa cạn
16
Hình 1.5. Các chiến lược chung trong nghiên cứu khai thác rễ tơ ..................... 19
19
Hình 2.1. Cây Dừa cạn in vitro 8 tuần tuổi ........................................................ 28
28
Hình 2.2. Sơ đồ tóm tắt q trình nghiên cứu .................................................... 35
35
Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt các bước phân lập và nhận diện A. rhizogenes ............ 36
36
Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình đánh giá và chọn lọc điều kiện cảm ứng
tạo rễ tơ trên cây Dừa cạn .................................................................. 37
37
Hình 3.1. Ba dạng khuẩn lạc khác nhau đặc trưng của Agrobacterium trên
mơi trường MG-Te ............................................................................ 45
45
Hình 3.2. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên cây đậu đen in vivo sau 14
ngày được xâm nhiễm bằng dòng vi khuẩn C02 đã phân lập
được ................................................................................................... 49
49
Hình 3.3. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên cây đậu đen in vivo sau 2
tuần được xâm nhiễm bằng 14 dòng vi khuẩn đã phân lập được ...... 49
49
Hình 3.4. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên cây đậu đen và cây đậu
phộng in vivo sau khi được gây nhiễm mười bốn ngày với dịng
vi khuẩn C18 ...................................................................................... 49
49
Hình 3.5. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên bốn giống Dừa cạn in vivo
khi được xâm nhiễm bằng dòng C18 đã phân lập được sau 3

tuần gây nhiễm ................................................................................... 50
50
Hình 3.6. Kết quả phân tích PCR xác nhận sự hiện diện các gen rolABC
trong plasmid của mười ba dòng vi khuẩn đã sàng lọc được ............ 51
51
Hình 3.7. Rễ tơ sau 3 tuần gây nhiễm ................................................................ 55
55
Hình 3.8. Sự hiện diện của gen rolB được chuyển từ A. rhizogenes vào rễ
tơ ........................................................................................................ 55
55
Hình 3.9. Rễ thường và rễ tơ được chuyển gen bằng A. rhizogenes dưới
kính hiển vi soi nổi ............................................................................ 56
56

xii


Hình 3.10. Sự phát triển của rễ tơ giống Dừa cạn VIN002 trên môi trường
thạch B5 ở các nhiệt độ ni cấy khác nhau ................................... 71
71
Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các gen rolABC trong bộ gen của một
số dòng rễ tơ từ giống Dừa cạn VIN002 sau 12 tháng .................... 73
73
Hình 3.12. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các dòng rễ tơ từ giống Dừa
cạn VIN002 ..................................................................................... 75
75
Hình 3.13. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các dòng rễ tơ từ giống Dừa
cạn VIN005 ..................................................................................... 75

75
Hình 3.14. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các dịng rễ tơ từ giống Dừa
cạn VIN072 ..................................................................................... 75
75
Hình 3.15. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các dịng rễ tơ từ giống Dừa
cạn VIN077 ..................................................................................... 76
76
Hình 3.16. Khả năng phát triển của dòng rễ tơ VIN002-12 trên mơi trường
1/2B5 có nguồn carbon khác nhau .................................................. 81
81
Hình 3.17. Đồ thị đường cong tăng trưởng của các dòng rễ tơ chọn lọc
theo trọng lượng tươi và trọng lượng khô ....................................... 82
82
Hình 3.18. Các cây Dừa cạn in vivo bị xâm nhiễm bởi A. rhizogenes ............... 84
84

xiii


CHƯƠNG MỞ ĐẦU

-1-


Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) có khả năng tổng hợp nhiều hợp chất thứ
cấp có giá trị, trong đó có hơn 50 alkaloid nhóm indole như vindoline, vincamine,
ajamlicine, serpentine, catharanthine, vinblastine và vincristine… được dùng trong
y dược.[140] Tuy nhiên, không may mắn là các hợp chất này hiện diện với hàm lượng

rất thấp trong cây có kiểu hình hoang dại.[109] Cũng chính vì hiện diện với hàm
lượng rất thấp nên sản phẩm tinh khiết của các hợp chất này rất đắt đỏ.[141] Sản xuất
các hợp chất này bằng phương pháp tổng hợp hóa học khơng thích hợp vì đắt tiền
và có cấu trúc phức tạp cũng như hoạt tính sản phẩm không giống như sản phẩm từ
thực vật.[70, 109, 140] Chính vì vậy mà các nhà khoa học đã và đang nổ lực nghiên cứu
để tìm hiểu các con đường sinh tổng hợp chúng cũng như khai thác những kỹ thuật
khác nhau để có thể sản xuất cơng nghiệp. Số liệu các báo cáo về cây Dừa cạn trung
bình khoảng 80 ấn phẩm mỗi năm trong suốt ba thập kỷ 1985-2015.
Bất chấp các nổ lực trên, các nhà khoa học vẫn chưa tìm được kỹ thuật nào
thay thế được kỹ thuật canh tác truyền thống trên đồng ruộng. Cho đến nay, nhiều
nghiên cứu nhằm nâng cao sản lượng hợp chất ở cây Dừa cạn vẫn đang được tiến
hành trên kỹ thuật canh tác đồng ruộng.[56, 58, 63, 105] Các kỹ thuật nuôi cấy mô thực
vật như nuôi cấy sẹo và nuôi cấy huyền phù tế bào cũng đang được nghiên cứu, tuy
nhiên vẫn không đạt như mong đợi và vẫn đang được liên tục báo cáo.
Nuôi cấy rễ tơ được chuyển gen bằng Agrobacterium rhizogenes là kỹ thuật
đang được sử dụng phổ biến nhằm thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy sẹo và ni cấy
huyền phù cho nhiều lồi thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp.[31] Kỹ thuật này
cũng đã được áp dụng trên cây Dừa cạn cho các mục đích sản xuất chất thứ cấp từ
những năm 1980. Tuy nhiên không may mắn khi hầu hết các dịng rễ tơ cây Dừa
cạn có tốc độ tăng trưởng thấp.[98] Mặc dù vậy, cho đến nay các nghiên cứu khơng
ngừng được thực hiện nhằm tìm ra dịng rễ tơ có khả năng tổng hợp hợp chất đích
mong muốn. Cơ sở để các nhà khoa học tin tưởng tiếp tục nghiên cứu là do đặc
điểm chuyển gen của A. rhizogenes là quá trình chèn các gen trên plasmid Ri của nó

-2-


vào vị trí ngẫu nhiên trên bộ gen của tế bào thực vật dẫn đến các dòng rễ tơ thu
được sẽ có đặc điểm tăng trưởng khác nhau.[23] Cũng chính vì lý do đó mà việc
nghiên cứu sản xuất được nhiều dịng rễ tơ khác nhau và sau đó là sàng lọc được

dịng rễ tơ mong muốn gặp nhiều khó khăn và tốn nhiều thời gian. Mặt khác, cho
đến nay, hầu hết các nghiên cứu trên rễ tơ cây Dừa cạn vẫn còn hạn chế khi chỉ vận
dụng vài chủng A. rhizogenes nhất định. Trong khi đó, lồi vi khuẩn này phổ biến
rộng rãi trong đất.[83, 143] Do đó, việc khai thác các chủng A. rhizogenes hoang dại
được phân lập từ đất sẽ mang đến cơ hội sản xuất được nhiều dòng rễ tơ mới từ cây
Dừa cạn cũng như tiềm năng chọn lọc được dịng rễ tơ thích hợp cho các nghiên
cứu có liên quan.
Mục tiêu
Phân lập các chủng A. rhizogenes có trong tự nhiên, nghiên cứu cảm ứng tạo
rễ tơ Dừa cạn và đánh giá khả năng sinh tổng hợp Vinca alkaloid của cây Dừa cạn
thông qua gây nhiễm trực tiếp vi khuẩn này lên cây in vivo (như yếu tố ngoại sinh)
và của rễ tơ (như yếu tố nội sinh).
Ý nghĩa khoa học
Luận án nhằm ghi nhận sự hiện diện của A. rhizogenes trong đất vùng rễ của
một số cây trồng ở Việt Nam và khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ tơ của chúng
trên cây Dừa cạn cũng như ảnh hưởng của chúng lên khả năng sinh tổng alkaloid
của cây Dừa cạn và rễ tơ.
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án góp phần thu thập được A. rhizogenes bản địa làm công cụ cho các
nghiên cứu chuyển gen vào tế bào thực vật. Ngoài ra, kết quả của luận án giúp sản
xuất được nhiều dòng rễ tơ khác nhau từ cây Dừa cạn phục vụ cho các nghiên cứu
sau này hướng đến sản xuất Vinca alkaloid.

-3-


Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập A. rhizogenes từ mẫu đất vùng rễ một số cây trồng ở Việt Nam có
khả năng cảm ứng tạo rễ tơ Dừa cạn.
2. Sàng lọc chủng A. rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ cao ở cây Dừa

cạn và nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp để cảm ứng cho chủng vi khuẩn
đã chọn lọc.
3. Nghiên cứu chọn lọc một số điều kiện để bảo quản rễ tơ Dừa cạn.
4. Sàng lọc dịng rễ tơ có khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp alkaloid cao
và nghiên cứu chọn lọc điều kiện nuôi cấy tăng sinh khối rễ tơ trong môi trường
lỏng.
5. Khảo sát hàm lượng alkaloid tổng số và một số alkaloid có giá trị trong rễ tơ
và rễ cây in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes chọn lọc

-4-


Chƣơng 1
TỔNG QUAN

-5-


1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về Agrobacterium rhizogenes
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu
Từ những năm đầu của thế kỷ 20, người ta đã biết đến bệnh rễ tơ (hairy root
disease) trên thực vật do một loài vi khuẩn trong đất gây ra tại vị trí bị xâm nhiễm
và rễ này tăng sinh khơng giới hạn. Năm 1930, bằng các phân tích sinh hóa, Riker
và cộng sự lần đầu tiên đã phân lập và nhận diện vi khuẩn gây bệnh này là
Phytomonas rhizogenes. Sau đó, các nhà khoa học xếp lồi này vào giống
Agrobacterium với tên lồi là A. rhizogenes. Từ đó, các nghiên cứu trên A.
rhizogenes không ngừng được thực hiện nhằm làm sáng tỏ các vấn đề sinh hóa liên
quan đến hiện tượng bệnh rễ tơ. Kết quả thu được cũng tương tự các nghiên cứu
trên A. tumefaciens.[137]
Bảng 1.1. Tóm tắt một số sự kiện quan trọng trong lịch sử nghiên cứu A.

rhizogenes[32, 137]
Năm
Khám phá
1900

Lần đầu tiên bệnh rễ tơ được báo cáo

1930

Riker xác định tác nhân gây triệu chứng rễ tơ là Phytomonas rhizogenes

1942

Corn đã phân loại vi khuẩn này là Agrobacterium rhizogenes

1981

Rễ tơ được nuôi cấy in vitro; dãy vật chủ được mở rộng

1984

Nhận diện các T-DNA trái và phải (TL-DNA và TR-DNA)

1987

Nhận diện được các gen rolABC (root oncogene locus)
Xác định protein của rolB và rolC là các glucosidase trong quá trình tổng
hợp auxin và cytokinin tương ứng (những hợp chất có vai trị gián tiếp
trong tạo khối u)
Young và cộng sự đề nghị tên vi khuẩn này là Rhizobium rhizogenes

Nghiên cứu sâu vai trò của các gen gây khối u lên sự biến dưỡng chất thứ
cấp, sự phát triển của cây tái sinh và của rễ tơ; ứng dụng chèn gen mong
muốn vào tế bào thực vật cho các mục tiêu nghiên cứu khác nhau (sản
xuất hợp chất thứ cấp, các quá trình liên quan đến gen mục tiêu và xử lý
mơi trường…). Ngồi ra, các nghiên cứu nhằm phân loại vi khuẩn này vẫn
đang được tiến hành.

1991
2001
2002
đến
nay

-6-


Tương tự như A. tumefaciens, sau khi được xác định có khả năng chuyển gen
vào tế bào thực vật và rễ tơ mang gen của vi khuẩn này mang nhiều đặc tính khác
biệt so với rễ thơng thường, A. rhizogenes đã được quan tâm sử dụng như một công
cụ chuyển gen trong công nghệ sinh học thực vật.[137] Đồng thời, rễ tơ hình thành
cũng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong sản xuất hợp chất thứ
cấp từ nhiều lồi thực vật khác nhau.[32] Do đó, dãy vật chủ của A. rhizogenes cũng
gia tăng liên tục. Ở điều kiện tự nhiên thì A. rhizogenes có khả năng xâm nhiễm vào
79 loài thực vật khác nhau thuộc 55 giống với 27 họ. Trong nghiên cứu in vitro, loài
này có thể xâm nhiễm trên 450 lồi thực vật khác nhau.[112]
1.1.2. Tình hình phân loại
Vị trí phân loại của A. rhizogenes theo Conn (1942) là thuộc giới Bacteria,
ngành Proteobacteria, lớp Alpha-Proteobacteria, bộ Rhizobiales, họ Rhizobiaceae
và giống Agrobacterium. Kể từ 1981, A. rhizogenes là tên được dùng phổ biến để
gọi vi khuẩn này. Cách sắp xếp này hiện vẫn đang được thể hiện trong Danh sách

tên vi khuẩn đã được chấp thuận của Tạp chí Quốc tế về Vi sinh học hệ thống và
Tiến hóa (IJSEM) và Danh sách xác nhận của IJSEM. Song song đó, một nhóm các
nhà phân loại cũng chấp nhận loài này với tên gọi Rhizobium rhizogenes. Các tên
cịn lại chỉ mang tính lịch sử hoặc tên mới chỉ được chấp nhận nếu như không sử
dụng với một ngụ ý nào khác.[106, 112, 137]
Phân loại dưới loài của A. rhizogenes cũng phức tạp đáng kể.[137] Giống như A.
tumefaciens, rễ tơ mang gen của A. rhizogenes cũng có khả năng sản sinh ra các
opine (các dạng dẫn xuất của amino acid) mang tính đặc hiệu chủng vi khuẩn. Tuy
nhiên, số loại opine ở A. rhizogenes ít hơn ở A. tumefaciens. Dựa trên khả năng tổng
hợp các opine, người ta chia A. rhizogenes thành agropine (hoặc agropinic acid),
mannopine (hoặc mannopinic acid), cucumopine và mikimopine. Ngoài ra, nhiều
báo cáo cách phân loại theo các kiểm tra sinh hóa cũng được cơng bố vào những
năm đầu của thập niên 1980.[145,

152]

Theo đó, Agrobacterium được chia thành 3

nhóm biovar khác nhau. A. rhizogenes gồm những giống thuộc biovar 1 (chứa chủ

-7-


yếu là A. tumefaciens và A. radiobacter) và biovar 2 (cũng chứa A. tumefaciens và
A. radiobacter, nhưng chủ yếu là A. rhizogenes).
1.1.3. Phân bố và hình thái
Agrobacterium rhizogenes hiện diện phổ biến trong đất (chủ yếu ở vùng rễ),
có khả năng nhiễm vào vết thương trên cây tạo ra hội chứng rễ tơ và làm tăng sinh
rễ thứ cấp.[24, 119, 128] Gần đây, Murugesan và cộng sự (2010) đã phân lập được A.
rhizogenes từ nốt sần của nhiều cây họ đậu như đậu Hà Lan (Pisum sativum), cây

Điền Thanh (Sesbania rostrata), đậu Xanh Bốn Mùa (đậu Mười, đậu Muồng Ăn –
Vigna mungo), đậu Xanh (Vigna radita) và đậu Đen (Vigna unguiculata).[83] Titah
và cộng sự (2014) cũng đã phân lập được Rhizobium rhizogenes ở vùng rễ cây rau
mương đứng (Ludwigia octovalvis) phát triển trên vùng nhiễm arsenic.[134] Một số
báo cáo còn cho thấy chúng hiện diện trên thân lúa, thân cây mía đường[72], mẫu
bệnh khối u trên khoai tây[89], khối u trên cây mâm xơi (Rubus occidentalis)[62].
Ngồi ra, sự khám phá một dãy rộng các vật chủ in vitro khác của A. rhizogenes cho
thấy lồi vi khuẩn này cũng có khả năng tồn tại ở các quần thể vật chủ này[32].
Thường các loài Agrobacterium tồn tại chung với nhau trong cùng một hệ sinh
thái.[59]
Agrobacterium rhizogenes thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram âm,
chiều rộng khoảng 0,6 - 1,0 µm và chiều dài khoảng 1,5 - 3,0 µm. Agrobacterium có
vỏ nhầy, di động bằng roi (mỗi tế bào có 1 đến 6 roi xếp thành vịng trịn, khơng xếp
ở cực tế bào). Trên mơi trường có carbohydrate, khuẩn lạc có dạng nhầy điển hình,
nhiều chất nhờn do chúng tiết ra polysaccharide ngoại bào có cấu trúc (1→2)-βglucan. Khuẩn lạc A. rhizogenes có dạng lồi, trơn nhẵn, hình trịn và khơng chứa sắc
tố.[78, 83, 119, 146] Agrobacterium là nhóm vi khuẩn khơng tạo bào tử, kích thước bộ
gen 2,5 Mb (Megabase pair). Tế bào Agrobacterium đứng đơn lẻ hoặc kết đôi. Sự
phân loại sơ bộ các lồi trong giống Agrobacterium có thể được thực hiện bằng
cách xác định bệnh do chúng gây ra trên thực vật.[83, 137]

-8-


1.1.4. Sinh lý và biến dƣỡng
Agrobacterium là giống gồm những lồi khó phân biệt với các lồi trong giống
Rhizobium ngoại trừ khả năng gây bệnh cho cây trồng.[21] Các chủng A. rhizogenes
khác nhau có các đặc tính sinh hóa khác nhau như hàm lượng của polysaccharide
ngoại bào, glycogen, protein tổng số, lipid tổng số, các amino acid tự do.[83] Tỷ lệ
nucleotide G+C (guanine+cytosine) trong tế bào A. rhizogenes chiếm khoảng 57 63%.[119, 146] Trong tế bào A. rhizogenes, profile acid béo có sự hiện diện của các
acid béo C15:0 iso 3OH và khơng có chứa các acid béo C18:1 3OH và là đặc điểm

để phân biệt loài rhizogenes với tumefaciens và vitis.
Trong giống Agrobacterium, vài lồi có thể sử dụng NH4+ và NO3- làm nguồn
nitrogen, vài loài sử dụng amino acid và vài lồi có thể oxy hóa nitrate.[119,

146]

Chúng có thể biến dưỡng một dãy rộng các đường đơn, đường đôi, muối của các
acid hữu cơ và các acid không bay hơi được hình thành từ sự lên men glucose. Các
loài trong giống Agrobacterium sử dụng con đường Entner-Doudoroff để chuyển
hóa hexose thành pyruvate.[146] Các hợp chất trung gian trong chu trình TCA
(Tricarboxylic Acid Cycle) và vài amino acid có thể được Agrobacterium sử dụng
như nguồn carbon. Các giống A. rhizogenes không thể sử dụng nitrate nếu không bổ
sung biotin. Thậm chí, vài chủng cịn cần cả L-glutamic acid và biotin. Vài chủng A.
rhizogenes có khả năng cố định N2 từ khí quyển. Chúng có khả năng cảm ứng tạo
nốt sần hoặc khối u hoặc rễ tơ tùy thuộc vào lồi thực vật chủ.[10]
Mỗi giống Agrobacterium có khả năng tồn tại khác nhau với các kháng sinh
khác nhau.[130] Theo Masayuki (2003), chủng A. rhizogenes gây bệnh rễ tơ trên cây
dưa gan sống sót trong đất được nung đến 70 - 95oC, chết trong nước vơ trùng được
nun nóng đến 60oC.[75] Trong đất, khi độ ẩm đất 25% thì chủng này khó chết hơn
khi độ ẩm đất là 38 - 45%. Các giống A. rhizogenes khơng có khả năng kháng với
NaCl 2%. So với các lồi Agrobacterium khác thì A. rhizogenes không thể phát triển
ở nhiệt độ trên 30oC. Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng từ 25 đến 28oC.[119]

-9-


Giống như A. tumefaciens, A. rhizogenes cũng có khả năng tổng hợp và biến
dưỡng các opine.[137] Khả năng này đặc hiệu theo từng chủng vi khuẩn. Người ta tìm
thấy có bốn loại opine ở A. rhizogenes. Các opine ở A. rhizogenes có vai trị quan
trọng trong q trình chuyển gen của vi khuẩn này vào trong tế bào thực vật. Chúng

đóng vai trị như các tín hiệu cho sự tương tác giữa thực vật với vi khuẩn. Ngoài ra,
sự hiện diện của các opine trong môi trường nuôi cấy rễ tơ có ảnh hưởng khác nhau
lên sự tích lũy hợp chất thứ cấp.
Một trong những polysaccharide ngoại bào do A. rhizogenes tiết ra thuộc
nhóm 1,3-β-glucan, là một đại phân tử được hình thành từ các đơn phân là glucose
nối với nhau bằng các carbon ở vị trí số 1 và 3 trên vòng và được gọi là curdlan.
Curdlan được tiết ra sẽ tạo thành những hạt nhỏ như tinh bột xung quanh tế bào,
không tan trong nước cất nhưng tan trong dung dịch kiềm lỗng vì bị ion hóa các
liên kết hydrogen, tạo thành gel khi được đun nóng trên 54oC trong dung dịch NaCl.
Tính chất gel phụ thuộc vào nồng độ NaCl và nhiệt độ.[78]
Trên T-DNA của plasmid Ri của A. rhizogenes có mang các gen gây ra khối u.
Các gen này bản chất là các gen mã hóa cho các enzyme tổng hợp các hormone
thực vật, gồm auxin và cytokinin. Ngồi ra, T-DNA này cịn chứa các gen làm biến
đổi sự đáp ứng của tế bào thực vật đối với các hormone. Chính các gen này gây ra
sự tăng trưởng khơng kiểm sốt của tế bào chủ dẫn đến hình thành khối u.[116, 137]
1.1.5. Khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật
Trong số các loài vi khuẩn có khả năng chuyển gen vào thực vật thì A.
tumefaciens và A. rhizogenes được nghiên cứu nhiều nhất.[68] Các loài
Agrobacterium có thể gây nhiễm trên 90 họ thực vật hai lá mầm khác nhau, gồm
cây ăn quả có giá trị kinh tế, nho, cây trồng có quả hạch và cây cảnh.[83] A.
rhizogenes có khả năng chuyển plasmid mang gen có kích thước vài trăm kb từ vi
khuẩn vào trong tế bào thực vật.[92] Khi bị nhiễm bởi A. rhizogenes, tế bào có khả
năng tổng hợp auxin và/hoặc gia tăng sự nhạy cảm với auxin, từ đó đã kích thích sự
tạo thành rễ tại vị trí nhiễm.[24] Tế bào bị nhiễm A. rhizogenes sẽ gia tăng tính nhạy

- 10 -