Tóm tắt luận án: Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư.

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Hồ Hoàng Nhân

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƯỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
Mã số: 62720402
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Hà Nội, năm 2019


Cơng trình được hồn thành tại:

-

Trường Đại học Dược Hà Nội

-

Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế

-

Viện Dược, Đại học Tartu, Estonia

-

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công

Trường Dược, Trường Đại học Yeungnam, Hàn Quốc

nghệ Việt Nam.
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
GS. TS. Chul Soon Yong
Phản biện 1:........................................................................................
.............................................................................................................
Phản biện 2:........................................................................................
.............................................................................................................
Phản biện 3:........................................................................................
.............................................................................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường
họp tại: .................................................................................................
Vào hồi ............. giờ..............ngày...........tháng..........năm..........
Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam
Thư viện Trường ĐH Dược Hà Nội


DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ
1. Hoang Nhan Ho, Tuan Hiep Tran, Trong Bien Tran, Chul
Soon Yong, Chien Ngoc Nguyen (2015), “Optimization and
Characterization of Artesunate-Loaded Chitosan-Decorated
Poly

(D,L-lactide-co-glycolide)

Acid

Nanoparticles”,

Journal of Nanomaterials, Article ID 674175, DOI:
10.1155/2015/674175
2. Hồ Hoàng Nhân, Hoàng Thị Hương, Phạm Văn Minh,
Nguyễn Ngọc Chiến (2016), “Nghiên cứu bào chế tiểu phân
nano artesunat-PLGA PEG hóa”, Tạp chí Nghiên cứu dược
và thông tin thuốc, số 4+5, tr.19-23.
3. Hoang Nhan Ho, Ivo Laidmäe, Karin Kogermann, Andres
Lust, Andres Meos, Chien Ngoc Nguyen & Jyrki Heinämäki
(2017), “Development of electrosprayed artesunate-loaded
core–shell nanoparticles”, Drug Development and Industrial
Pharmacy,

43(7),

pp

1134-1142,

DOI:

10.1080/03639045.2017.1300163
4. Hồ Hoàng Nhân, Nguyễn Ngọc Chiến (2018), “Khảo sát
một số yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng bột đông khơ chứa
tiểu phân nano artesunat”, Tạp chí Dược học, 58 (501), tr. 79, 32.

MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán
tổng hợp từ Artemisia annua L., gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy
ART có tác dụng ức chế nhiều dịng tế bào ung thư. Nhằm làm tăng
sinh khả dụng và tác dụng ức chế tế bào ung thư của ART, công
nghệ nano đã và đang được nghiên cứu. Trong đó, tiểu phân nano
(viết tắt là TP nano) polyme cũng đã cho thấy kết quả đầy hứa hẹn về
hướng điều trị bệnh ung thư. Việc kết hợp acid poly (lactic-coglycolic) (PLGA) có khả năng kiểm sốt và duy trì giải phóng dược
chất, độc tính thấp, phân hủy sinh học với các polyme thân nước như
chitosan (CS) hay polyethylen glycol (PEG) có thể được sử dụng
nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các TP nano như tăng cường sự
bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự
tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian
tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội đưa thuốc đến các khối u đích và
điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất, giảm độc tính.
Mục tiêu của luận án
1.

Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế của tiểu phân

nano artesunat ở quy mơ phịng thí nghiệm;
2.

Xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế bột đông khô

pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mơ phịng thí nghiệm;

3.

Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột

đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;
4.

Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in

vivo của tiểu phân nano artesunat.
Những đóng góp mới của luận án
Đến thời điểm hiện tại, chưa tìm thấy công bố nào về bào chế và
1


đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của bột
đông khô pha tiêm chứa TP nano ART 20 mg sử dụng đồng thời
PLGA và PLGA-PEG ở Việt Nam, do đó kết quả nghiên cứu của
luận án có thể được xem là những đóng góp mới đối với lĩnh vực
cơng nghệ bào chế dược phẩm trong nước, cụ thể như sau:

- Nghiên cứu đã xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế TP
nano ART sử dụng PLGA bao CS hoặc bao PEG bằng phương pháp
nhũ hóa – bốc hơi dung mơi, đặc biệt bằng phương pháp phun điện
trường ở quy mơ phịng thí nghiệm.

- Nghiên cứu đã xây dựng được cơng thức và quy trình bào chế bột
đơng khơ pha tiêm chứa TP nano ART hàm lượng 20 mg sử dụng
PLGA và PLGA-PEG ở quy mơ phịng thí nghiệm. Đồng thời đã
đánh giá được tác dụng ức chế ung thư trên tế bào và trên chuột. TP

nano ART bào chế đã được chứng tỏ tác dụng ức chế một số dòng tế
bào ung thư vượt trội so với ART nguyên liệu và khả năng ức chế tốt
sự phát triển khối u in vivo trên chuột gây khối u bằng tế bào ung thư
phổi chuột (Lewis Lung Cancer – LLC). Những nghiên cứu này lần
đầu được thực hiện tại Việt Nam.
Cấu trúc luận án
Luận án gồm 148 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục
với bố cục gồm: Đặt vấn đề (1 trang); Tổng quan (31 trang); Đối
tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu (24 trang); Kết quả
nghiên cứu (56 trang); Bàn luận (34 trang); Kết luận và Kiến nghị (2
trang). Luận án có danh mục các cơng trình đã cơng bố (1 trang), 28
bảng, 49 hình, 177 tài liệu tham khảo (6 tài liệu tiếng Việt và 171 tài
liệu tiếng Anh), 9 phụ lục.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về artesunat
CH3
H

H3C
O

H

O

O

H

O
3
CH
OCOCH2 CH2 COOH

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART
- Công thức phân tử: C19H28O8

1.2. Tiểu phân nano
polyme
1.2.1.

Đặc điểm

TP nano polyme là các tiểu phân có kích thước nano sử dụng
polyme làm giá mang dược chất, có cấu trúc dạng siêu vi nang hay
siêu vi cầu. Các polyme sử dụng bào chế TP nano polyme gồm các
polyme tự nhiên hay tổng hợp. Trong đó có cả các loại phân hủy sinh
học, tương hợp với cơ thể sống, ví dụ như PLGA là một trong những
polyme tổng hợp được sử dụng phổ biến do có khả năng kiểm sốt
và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học
với nhiều mơ và tế bào.
1.2.2.

Một số phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Dựa vào quy trình bào chế có thể phân chia các phương pháp
bào chế TP nano polyme thành 2 nhóm:

-

Nhóm các phương pháp kết tủa

-

Nhóm các phương pháp nhũ hóa

Trong đó, có thể liệt kê các phương pháp bao gồm: Kết tủa do
thay đổi dung mơi, nhũ hóa và bốc hơi dung mơi, gel ion hóa, muối
hóa, sử dụng dung môi siêu tới hạn, phun sấy, phun điện trường...
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano
PLGA bằng chitosan hoặc PEG
Việc kết hợp với CS hay PEG có thể được tiến hành bằng phương


pháp hấp phụ hay gắn kết hóa học.
1.2.4. Phương pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân
nano
Bao gồm: đánh giá KTTP, PDI, thế zeta, hình thái cấu trúc nano,
đánh giá các tương tác lý hóa, trạng thái kết tinh, hiệu suất nano hóa
(EE) và khả năng nạp thuốc (LC), khả năng giải phóng dược chất in
vitro.
1.2.5.

Phương pháp đưa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm

Có thể dùng dưới hai dạng thuốc tiêm hỗn dịch và thuốc tiêm
đơng khơ, ngồi ra cịn có thể bào chế dưới dạng bột phun sấy.
1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng
hóa bề mặt bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa

Đã có một số các nghiên cứu ngoài nước sử dụng TP nano PLGA
được chức năng hóa bề mặt bằng CS hay PEG, trong khi đó, chưa
tìm thấy một cơng bố nào liên quan đến hướng nghiên cứu này trong
nước. Đồng thời, đến thời điểm hiện tại chưa có cơng bố nào ở ngồi
nước cũng như trong nước sử dụng CS hay PEG để thay đổi đặc tính
của TP nano PLGA chứa dược chất là ART.
1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thư
1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế
hệ mang thuốc nano
Gồm có: Cấu trúc bất thường của lớp lót nội mạc của các mạch
máu đi qua khối u; pH ngoại bào của khối u thấp hơn; Các kháng
nguyên đặc hiệu của khối u.
1.3.2.
nano
1.3.2.1.

Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư của tiểu phân
Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Đánh giá tác dụng kháng ung thư của hỗn dịch nano sau khi pha
trong môi trường phân tán trên các dòng tế bào ung thư sau các


khoảng thời gian bằng các kỹ thuật trypan blue, MTT (3-(4, 5dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromid), phân tích
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting),....
1.3.2.2. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo
 Mơ hình ghép dị lồi (Xenograft model)
Sử dụng các dòng tế bào ung thư ở người cấy ghép trên chuột
thiếu hụt miễn dịch (hay chuột “nude” như BALB/c nude).


Mơ hình ghép đồng lồi (Allograft hay syngeneic model)

Sử dụng các dòng tế bào ung thư ở chuột cấy ghép trên chuột
có hệ miễn dịch bình thường như chuột BALB/c.
1.3.3.
thư

Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung

Hiện đã có một số chế phẩm sử dụng cơng nghệ nano trên thị
trường như Abraxane (Paclitaxel gắn albumin/100 mg/TP nano
polyme), Doxil/Caelyx (Doxorubicin HCl PEG hóa/20mg/10 ml
hoặc 50mg/25ml/Liposome),...
1.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư của
tiểu phân nano chứa dẫn chất của artemisinin
Qua tổng quan tài liệu cho thấy hiện tại ở Việt Nam, việc áp
dụng các loại thuốc có kích thước nano của dẫn chất của artemisinin,
đặc biệt là của ART nói riêng vẫn cịn hạn chế.
Vì vậy, đề tài định hướng tạo ra các TP nano polyme
ART/PLGA và thay đổi đặc tính bề mặt TP nano thu được bằng các
polyme thân nước. Tiếp theo, đưa TP nano polyme vào dạng thuốc
tiêm, đồng thời đánh giá hiệu quả chống một số dòng tế bào ung thư
in vitro và in vivo của TP nano ART bào chế được.


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.

Nguyên liệu

Nguyên liệu, hóa chất, tá dược sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn DĐVN IV, BP, USP, tinh khiết phân tích hoặc HPLC.
2.1.2.
2.1.2.1.

Tế bào và động vật thí nghiệm
Tế bào thí nghiệm

Gồm: Tế bào ung thư vú người MCF-7, tế bào ung thư phổi người
A549, tế bào ung thư phổi chuột LLC.
2.1.2.2.

Động vật thí nghiệm

Chuột thuần chủng dịng BALB/c khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí
nghiệm, khơng phân biệt giống, khơng mắc bệnh, 8-9 tuần tuổi, có
khối lượng 25-29 g.
2.1.3.

Thiết bị nghiên cứu

Các dụng cụ, thiết bị được sử dụng đều đạt yêu cầu cho bào chế,
kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng dược lý.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Trường Đại học Dược Hà Nội; Trường Đại học Y Dược, Đại học
Huế; Trường Dược, Trường Đại học Yeungnam, Hàn Quốc; Viện
Dược, Đại học Tartu, Estonia; Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm khoa học và công nghệ Việt Nam.

2.3. Nội dung nghiên cứu
Bao gồm các nội dung để thực hiện được các mục tiêu của luận án.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.

Bào chế tiểu phân nano artesunat

2.4.1.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và
chitosan bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung mơi và hấp phụ
vật lý
Bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung mơi rồi hấp phụ vật lý


CS. Tiến hành tinh chế hỗn dịch thu được bằng ống ly tâm màng.
2.4.1.2. Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và
chitosan bằng phương pháp phun điện trường
Các TP nano dạng lõi-vỏ (core-shell) với PLGA ở bên trong cịn
CS ở lớp vỏ bên ngồi được bào chế bằng cách sử dụng hệ thống
phun điện trường kép tự động ESR200RD (Hàn Quốc).
2.4.1.3. Bào chế tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và PEG
bằng phương pháp nhũ hóa – bốc hơi dung mơi
Bằng phương pháp nhũ hóa bốc hơi dung môi và tiến hành tinh
chế hỗn dịch nano thu được bằng ống ly tâm màng hoặc cột lọc tiếp
tuyến.
2.4.1.4.

Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa cơng thức

a. Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được thiết kế thường quy hoặc
dựa vào mơ hình thích hợp nhờ phần mềm MODDE 8.0.

b. Phân tích và tối ưu hóa: bằng phương trình đa thức bậc hai và tối
ưu hóa cơng thức bằng phương pháp phân tích mặt đáp.
2.4.2.

Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat

KTTP, hệ số đa phân tán (PDI), thế zeta được xác định bằng thiết
bị Zetasizer ZS90. Đánh giá hình thái qua ảnh kính hiển vi điện tử
quét (SEM)/kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phổ nhiễu xạ tia
X (XRD), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(1H-NMR), hàm lượng ART, hiệu suất nano hóa và khả năng nạp
thuốc, khả năng giải phóng dược chất in vitro.
2.4.3. Bào chế bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat
2.4.3.1.

Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng của cơng thức và quy trình đơng
khơ trên máy đông khô Christ Alpha 1-LD.


2.4.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat 20 mg
Bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART được bào chế vô khuẩn
với các thông số cơng thức và quy trình bào chế bột đơng khơ tốt
nhất.
2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu
phân nano artesunat
Đánh giá về tính chất của bánh sau khi đơng khơ, tính chất của

bánh sau khi phân tán lại, KTTP, PDI, hình thái TP, pH của hỗn dịch
sau khi pha lại, độ đồng đều khối lượng, EE, định lượng, hàm ẩm,
tạp chất liên quan, độ vô khuẩn, tồn dư dung môi diclorometan
(DCM), phổ XRD, phổ IR, phân tích nhiệt vi sai (DSC), khả năng
giải phóng dược chất in vitro.
2.4.5.

Theo dõi độ ổn định

2.4.5.1. Theo dõi độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu
phân nano artesunat
Sản phẩm được đựng trong lọ thủy tinh không màu, đậy nút cao
su và nắp nhôm, bảo quản trong 1 năm ở điều kiện 5 ± 3oC và điều
kiện thực (trong phịng thí nghiệm với nhiệt độ 15-35oC, độ ẩm 5090%).
2.4.5.2. Theo dõi độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano
artesunat sau khi pha lại
Phân tán trong nước cất hai lần để tạo hỗn dịch nano ART, bảo
quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực trong vòng 4 giờ.
2.4.6.
vivo
2.4.6.1.

Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in
Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Đánh giá khả năng thấm vào tế bào, đánh giá độc tính tế bào theo
phương pháp MTT hoặc phương pháp nhuộm bằng Sulforhodamine


B (SRB), và đánh giá biến đổi hình thái nhân tế bào.

2.4.6.2.
a.

Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vivo

Gây u cho chuột bằng dòng tế bào LLC

b. Xác định khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat trên mơ hình chuột bị gây u bằng dịng tế
bào LLC.
Đường tiêm tĩnh mạch đuôi (i.v.): 18 chuột được chia làm 3 lơ (6
chuột/lơ): Nhóm 1 (Bệnh lý i.v.): tiêm nước muối sinh lý; Nhóm 2
(Bột đơng khơ chứa TP nano ART, ký hiệu Nano 60 mg/kg i.v.);
Nhóm 3 (Bột pha tiêm ART, ký hiệu NL 60 mg/kg i.v.): tất cả các
nhóm tiêm 2 ngày/1 lần. Thời gian tiêm trong 14 ngày.
Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và đo kích thước khối
u sơ cấp tại vị trí tiêm 5-7 ngày/lần để xác định khả năng ức chế khối
u của TP nano ART.
Thể tích khối u được tính theo cơng thức: V = a x b 2/2 (V : thể
tích khối u; a, b: chiều dài và đường kính khối u).
2.4.7.

Phương pháp xử lý số liệu

Phân tích thống kê như 1 chiều ANOVA (Tukey post-hoc test),
kiểm định t-student, hay kiểm định phù hợp. Mỗi thí nghiệm được
tiến hành 3 lần. Mức ý nghĩa là 0,05.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat
3.1.1. Bào chế tiểu phân nano A T PLGA-CS bằng phương pháp

nhũ hóa bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý
Tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 được cơng thức tối ưu
với tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) là 0,4, pH của dung dịch CS là 3,2, và
nhiệt độ thí nghiệm là 21,5oC. TP nano ART tối ưu có KTTP 193,1±
1,0 nm và PDI 0,221 ± 0,015, thế zeta +36,2 ± 1,0 mV, EE và LC lần


lượt là 77,10 ± 1,00% và 19,10 ± 0,90%.
3.1.2. Bào chế tiểu phân nano A T PLGA-CS bằng phương pháp
phun điện trường
Kích thước, hình thái của TP nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS được
đánh giá thơng qua các hình ảnh SEM của công thức FM1- FM16.
Các TP nano đại diện cho công thức FM15 thể hiện là công thức tốt
nhất so với các cơng thức khác (Hình 3.8). KTTP của TP nano
ART/PLGA-CS công thức FM15 là 303,0 ± 93,2 nm. EE và LC lần
lượt là 80,50 ± 2,30%, 5,60 ± 0,20%, thế zeta 19,9 ± 0,4 mV.
Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano
ART/PLGA-CS đại diện cho các cơng
thức FM13-FM16
Ngồi việc bao bằng CS, nghiên cứu đồng
thời cũng tiến hành cải thiện đặc tính bề mặt
của TP nano PLGA bằng cách bao PEG.
3.1.3.
Bào chế tiểu phân nano A T PLGA-PEG
Tiến hành tối ưu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0 thu được công
thức tối ưu với tỉ lệ Tween 80 là 1,85%, tỷ lệ DC/polyme là 46%, tỷ
lệ pha dầu/nước là 15%, và tỷ lệ PLGA-PEG là 55%. TP nano ART
tối ưu có KTTP 176,5 ± 2,4 nm và PDI 0,189 ± 0,002, thế zeta -22,8
± 0,2 mV, EE và LC lần lượt là 92,50 ± 0,80, 28,00 ± 0,20. Tinh chế
hỗn dịch bằng cột lọc tiếp tuyến thay cho ống ly tâm màng.

3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano
artesunat
3.2.1.

Đối với tiểu phân nano A T PLGA-CS

3.2.1.1. Bằng phương pháp nhũ hóa - bốc hơi dung môi và hấp phụ
vật lý


TP nano tối ưu có hình cầu, kích thước tiểu phân trong khoảng
190 nm. Phổ IR và thế zeta dương chứng tỏ sự có mặt của CS trên bề
mặt của TP nano PLGA.

Hình 3.16. Hình ảnh TEM

Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng

của TP nano ART/PLGA-CS

dược chất từ TP nano ART/PLGA và

ART/PLGA-CS (n=3)
Khả năng giải phóng của ART từ TP nano ART/PLGA-CS tối ưu
trong môi trường đệm phosphat pH 6,8 được thể hiện qua hình 3.18.
Tốc độ giải phóng dược chất từ hệ ART/PLGA-CS chậm hơn từ hệ
ART/PLGA. Đồ thị giải phóng ART từ TP nano có 2 giai đoạn:
nhanh ban đầu và theo sau bởi giai đoạn chậm.
3.2.1.2.

Bằng phương pháp phun điện trường

Phân tích phổ X-ray chứng tỏ ART và CS tồn tại ở trạng thái vơ
định hình trong TP nano. Tương tự, phổ IR gợi ý rằng có thể khơng
có tương tác giữa các thành phần trong cơng thức, góp phần xác nhận
sự có mặt của CS trên bề mặt của TP nano.
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải
phóng dược chất từ bột ART và TP
nano PLGA-CS (công thức FM15,
ký hiệu NPs) (n= 3)
Với bột ART, hơn 90% ART được
hòa tan trong 6 giờ, ngược lại với TP
nano ART/PLGA-CS chỉ xấp xỉ 50% hàm lượng thuốc được giải


phóng và đặc trưng bởi giai đoạn giải phóng nhanh ban đầu và theo
sau bởi giai đoạn giải phóng chậm liên tục. Phương trình KorsmeyerPeppas mơ tả tốt nhất động học giải phóng của dược chất từ nano
ART/PLGA-CS do có giá trị AIC nhỏ nhất.
3.2.2.

Đối với tiểu phân nano A T PLGA-PEG

TP nano có hình cầu thơng qua hình ảnh SEM, KTTP nhỏ.
Phổ XRD chứng tỏ ART tồn tại ở trạng thái vơ định hình hay ở
dạng phân tán phân tử trong TP nano. Phổ IR chứng tỏ khơng có
tương tác giữa ART và các thành phần trong công thức. Phổ 1HNMR của TP nano trong CDCl3 và D2O chứng tỏ sự tồn tại của chuỗi
PEG bên ngoài TP nano PLGA-PEG. Sự giải phóng của ART được
chia làm 2 pha: pha giải phóng nhanh (giải phóng ồ ạt) trong các giờ
đầu và pha giải phóng chậm về sau. Sự giải phóng dược chất ở TP
nano ART/PLGA-PEG nhanh và nhiều hơn ở TP nano ART/PLGA.

Do có giá trị AIC nhỏ nhất, nên mơ hình Korsmeyer-Peppas mơ tả
gần nhất động học giải phóng của TP nano ART/PLGA-PEG.
Như vậy, nghiên cứu đã bào chế TP nano ART/PLGA bằng CS
hoặc PEG bằng phương pháp nhũ hóa – bốc hơi dung mơi hoặc phun
điện trường. Tuy nhiên, do có EE và LC lớn, KTTP nhỏ, q trình
bao là sự gắn kết hóa học, sự đơn giản của quy trình và thiết bị cũng
như khả năng nghiên cứu trong điều kiện tiếp theo ở Việt Nam nên
TP nano ART sử dụng PLGA-PEG được lựa chọn để bào chế bột
đông khô.
3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat
3.3.1.

Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat

Đã xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đơng khơ
chứa nano ART với các thông số như saccarose với nồng độ 10%,


thể tích đơng khơ là 10 ml, thời gian đơng khô với thời gian sấy sơ
cấp là 48 giờ và thời gian sấy thứ cấp là 5 giờ.
3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat 20 mg
Bột đông khô pha tiêm được bào chế trong điều kiện vơ khuẩn
với quy trình đơng khơ tốt nhất được rút ra từ nghiên cứu ở mục
3.3.1.
3.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đơng khơ pha tiêm
chứa tiểu phân nano artesunat
3.4.1. Một số đặc tính của bột đơng khơ pha tiêm chứa tiểu phân
nano artesunat

Hình 3.30. Hình ảnh bột
đông khô pha tiêm trước (A)
và sau khi phân tán lại (B)
Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART

Chỉ tiêu đánh giá
Tính chất của bánh thuốc trước phân tán
lại
Thời gian phân tán
Tính chất của bánh sau khi phân tán lại
KTTP (nm)
PDI
Thế zeta (mV)
Độ đồng đều khối lượng (%)
Độ ẩm (%)
EE (%)
pH của hỗn dịch sau khi pha lại
Hàm lượng (%)
Độ vô khuẩn
Tồn dư dung môi DCM

Kết quả
Bánh màu trắng, xốp, mịn
Dưới 1 phút
Hỗn dịch màu trắng đục,
không lắng cặn, đồng nhất
199,0 ± 2,4
0,124 ± 0,007
-18,1 ± 0,7
Chênh lệch so với TB <

10%
1,314 ± 0,051
96,25 ± 1,32
3,770 ± 0,030
101,81 ± 0,96%
Đạt
<10 ppm


3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano A T PLGA-PEG sau đơng
khơ
TP nano sau đơng khơ có dạng hình cầu.

Hình 3.31. Hình ảnh SEM của TP nano
ART/PLGA-PEG sau đơng khơ

Hình 3.32. Phố XRD của ART, PLGA,
PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp
vật lý (PM_S) và bột đông khô chứa TP
nano ART/PLGA-PEG (NPs_S)

3.4.3.
Phổ nhiễu xạ
tia X
Phổ XRD chứng tỏ ART và saccarose đã chuyển sang trạng thái
vơ định hình trong bột đơng khơ chứa TP nano.
3.4.4.

Phân tích phổ hồng ngoại

Phổ IR chứng tỏ khơng có tương tác giữa ART và các thành phần
trong cơng thức.
3.4.5.

Phân tích nhiệt vi sai

Giản đồ nhiệt vi sai cho thấy sự thay đổi hiệu ứng nhiệt của ART,
saccarose và các thành phần khác trong cơng thức. Qua đó, chứng tỏ
có sự thay đổi trạng thái vật lý của ART cũng như của saccarose.
3.4.6.

Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro
Hình 3.35. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải
phóng dược chất từ bột đông khô
pha tiêm chứa TP nano ART sau
khi phân tán lại trong môi trường
đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4


Khơng có sự khác biệt về tỷ lệ giải


phóng dược chất giữa hai mơi trường (p > 0,05). Q trình giải
phóng dược chất với 2 giai đoạn: nhanh ban đầu, chậm tiếp theo.
3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông
khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat
Bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART ở dạng bánh màu
trắng, tạo hỗn dịch màu trắng đục, đồng nhất sau khi phân tán lại,

KTTP < 220 nm, PDI < 0,300, độ đồng đều khối lượng ± 10,0%,
phần trăm dược chất giải phóng theo thời gian (qua màng thẩm tích
10kDa, pH 7,4) dưới 15% sau 1 giờ, 15-25% sau 2 giờ, 25-35% sau
4 giờ, tỉ lệ ART nano hóa khơng ít hơn 90%, hàm ẩm khơng q 3%,
định tính có mặt ART, đạt tạp chất liên quan, hàm lượng ART từ 90110% so với lượng ghi trên nhãn, đảm bảo vô khuẩn, tồn dư dung
môi DCM không quá 60 ppm.
3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat
Sau 12 tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC, bột đông khô pha
tiêm chứa TP nano ART vẫn đảm bảo về các chỉ tiêu như ban đầu.
Tuy nhiên, khi bảo quản ở điều kiện thực (15-35oC, độ ẩm 50-90%),
sau 6 tháng, bánh không cịn xốp, bị co vón lại. Sau 3 tháng ở điều
kiện thực, KTTP của TP nano khá lớn là 674,6 ± 24,2 nm, PDI 0,198
± 0,067, đồng thời mẫu bắt đầu xuất hiện các đỉnh kết tinh của
saccarose.
3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau
khi phân tán lại
Sau khi bảo quản 4 giờ ở hai điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực
(15-35oC, độ ẩm 50-90%), hỗn dịch nano sau khi phân tán lại trong


nước cất vẫn đảm bảo các chỉ tiêu trong giới hạn quy định.
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và
tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat
3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro của tiểu
phân nano artesunat
Trước khi đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo, cả hai TP nano
ART sử dụng PLGA bao CS hay PEG bào chế bằng phương pháp
nhũ hóa – bốc hơi dung mơi đều được sử dụng để đánh giá tác dụng
ức chế tế bào ung thư in vitro nhằm có cái nhìn bao quát hơn về tác

dụng ức chế khối u của TP nano ART.
3.6.1.1.
a.

Đối với tiểu phân nano artesunat sử dụng PLGA và CS

Đánh giá khả năng thấm vào tế bào

TP nano PLGA-CS giúp cải thiện khả năng thấm vào tế bào so
với TP nano PLGA khơng bao gói.
b.

Đánh giá độc tính tế bào in vitro

TP nano bao CS cho kết quả độc tính cao hơn đối với các tế bào
MCF-7 và A549 so với TP nano ART/PLGA (p<0,05).
c.

Đánh giá biến đổi hình thái nhân tế bào

Cường độ huỳnh quang ở tế bào khi ủ với TP nano PLGA-CS cao
hơn khi ủ với TP nano PLGA và nguyên liệu.
3.6.1.2.

Đối với tiểu phân nano ART sử dụng PLGA và PEG

Mẫu TP nano ART thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của
dòng tế bào ung thư LLC tốt hơn mẫu ART nguyên liệu.
3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân
nano artesunat

3.6.2.1.

Sự thay đổi khối lượng chuột thí nghiệm

Sự thay đổi về khối lượng chuột là khơng có sự sai khác về mặt
thống kê (p> 0,05).


3.6.2.2.
khối u

Sự phát triển của
Hình 3.43. Sự phát triển của
khối u ở chuột sử dụng
đường tiêm tĩnh mạch đuôi
TP

nano

mg/kg/ngày,

ART
tiêm

liều

60

i.v.,

2

ngày/lần đã thể hiện khả năng
ức chế khối u tố hơn so với
nhóm đối chứng bệnh lý và nhóm ART nguyên liệu liều 60mg/kg,
tiêm i.v, 2 ngày/lần ở mức có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Việc sử
dụng ART nguyên liệu liều 60mg/kg/ngày (đường tiêm i.v., 2
ngày/lần) mặc dù đã làm giảm kích thước khối u so với nhóm đối
chứng bệnh lý, tuy nhiên, chỉ thể hiện sự sai khác về thể tích khối u ở
ngày 20 của thí nghiệm này (p<0,05).
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat
4.1.1.

Đối với trường hợp sử dụng PLGA và chitosan

4.1.1.1. Bào chế bằng phương pháp nhũ hóa - bốc hơi dung mơi và
hấp phụ vật lý
Đầu tiên nano ART/PLGA được bào chế bằng phương pháp nhũ
hóa và bốc hơi dung mơi, sau đó CS được gắn lên bề mặt tiểu phân
có sẵn bằng phương pháp hấp phụ vật lý. Do vậy, tỷ lệ CS/PLGA
(kl/kl), pH dung dịch CS và nhiệt độ của quá trình hấp phụ là một
trong những yếu tố quan trọng quyết định đến đặc tính của nano như
KTTP và PDI, thế zeta, hiệu suất nano hóa,...
4.1.1.2.

Bào chế bằng phương pháp phun điện trường

Trong nghiên cứu này, việc lựa chọn dung mơi thích hợp cho
cơng thức phun điện trường kép đặc biệt được chú trọng. Thông số

quy trình quan trọng trong quá trình phun điện trường là khoảng cách
giữa đầu kim phun và đĩa thu mẫu. Điện thế là một yếu tố quy trình
quan trọng khác có ảnh hưởng đến q trình phun điện trường bởi vì
điện thế cao là cần thiết để đảm bảo điện trường đủ cao để hình thành
hình chóp nón Taylor (Taylor cone), và/hoặc để vượt qua giới hạn
Rayleigh. Một yếu tố then chốt tiếp theo của quá trình phun điện
trường là tốc độ phun, đặc biệt trong hệ thống phun điện trường kép.
Một thông số quan trọng khác là nồng độ polyme cũng đã được báo
cáo là một yếu tố then chốt trong quá trình phun điện trường kép ảnh
hưởng đến hình thái của các nano (như sự hình thành các sợi nano).
4.1.2.

Đối với trường hợp sử dụng PLGA và PEG

Phương pháp nhũ hóa và bốc hơi dung mơi đã được sử dụng để
bào chế TP nano ART/PLGA-PEG. Tỷ lệ PLGA-PEG, tỷ lệ dược
chất và polyme, tỷ lệ Tween 80, tỷ lệ pha dầu và pha nước là một
trong những yếu tố quan trọng quyết định đến đặc tính của TP nano
như KTTP và PDI, hiệu suất nano hóa, khả năng nạp thuốc.
Hàm lượng PEG trong công thức tối ưu là 6,74%, phù hợp với
hàm lượng PEG được cho là có hiệu quả tốt trong việc giảm khả
năng bị nhận diện bởi đại thực bào và tăng khả năng tuần hoàn của
TP nano. Kết quả thẩm định lại mơ hình tối ưu cho thấy chỉ có sự sai
khác nhỏ hơn 5%, chứng tỏ phần mềm dự đốn tương đối chính xác.
4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat
Nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại và
phổ biến hiện nay trong nghiên cứu về TP nano để đánh giá một số
đặc tính lý hóa của tiểu phân.

Như vậy, nghiên cứu đã bào chế nano ART sử dụng PLGA được
bao bằng CS hoặc PEG với các đặc tính lý hóa như đã đề cập ở trên.
Thông qua so sánh một số đặc điểm của các công thức bao CS hoặc


PEG thì với EE và LC lớn, KTTP nhỏ nhất là 176,5 ± 2,4 nm, quá
trình bao là sự gắn kết hóa học, sự đơn giản của quy trình và thiết bị
cũng như khả năng nghiên cứu trong điều kiện tiếp theo ở Việt Nam
nên trong phần bào chế bột đông khô pha tiêm chứa nano ART tiếp
theo, công thức và quy trình bào chế nano ART sử dụng PLGA-PEG
đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.
4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
Về lựa chọn tá dược tạo bánh, saccarose có tác dụng bảo vệ TP
nano trong q trình đơng khơ. Các yếu tố như thể tích hay nồng độ
của các TP nano, loại chất mang,... sẽ ảnh hưởng đến nồng độ đường
saccarose tối ưu.
Việc kết hợp với các tá dược này đã làm tăng KTTP so với mẫu
chỉ sử dụng saccarose, đặc biệt khi sử dụng các tá dược này ở nồng
độ lớn. Thể tích của hỗn dịch đơng khơ ảnh hưởng đến hình thức tính
chất của bánh đơng khơ. Các mẫu có thể tích lớn, u cầu thời gian
đơng khơ dài hơn.
Quá trình sấy thứ cấp 5 giờ là cần thiết để làm giảm hàm ẩm còn
lại trong mẫu đến giá trị yêu cầu, đồng thời giúp sản phẩm ổn định
trong quá trình bảo quản.
Với việc hạn chế về thiết bị đơng khơ, do đó trong nghiên cứu
này, quy mơ bào chế mới chỉ dừng lại ở quy mơ phịng thí nghiệm
với khoảng 6 lọ với thể tích mỗi lọ là 10 ml chứa 20 mg ART cho
mỗi lần đông khô. Ngồi ra, do khơng có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ
của giá đỡ, cũng như khơng có chức năng điều chỉnh độ chân không
của buồng đông khô, nên việc khảo sát để nâng hàm lượng dược chất

trong mỗi lọ đông khơ, tối ưu hóa hơn nữa quy trình và chất lượng
sản phẩm đơng khơ vẫn cịn gặp nhiều hạn chế.


Bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART là sản phẩm có các
thành phần khơng thể thực hiện phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt.
Do đó, kỹ thuật pha chế vô khuẩn đã được ứng dụng để bào chế dạng
thuốc này. Ngồi ra, trên thiết bị đơng khơ Christ Alpha 1-2 LD, bộ
phận đóng nút cơ học đã giúp tạo được độ chân không trong lọ bột
đông khô giúp hạn chế sự tiếp xúc của sản phẩm với ẩm và khí oxy
từ đó giúp tăng cường độ ổn định của sản phẩm trong quá trình bảo
quản.
4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đơng khơ
Tiểu phân thu được sau khi phân tán lại có KTTP khoảng 200 nm,
có kích thước phù hợp với đường tiêm i.v. trên mơ hình thử nghiệm
in vivo giúp tiểu phân có thể đi đến vị trí các khối u thơng qua hiệu
ứng tăng thấm và lưu giữ (EPR).
Hàm ẩm còn lại trong mẫu thấp dưới 3% sau q trình đơng khơ
được xác định bằng phương pháp chuẩn độ nước Karl Fischer. Các
phổ XRD, phổ DSC đã được sử dụng để phân tích trạng thái kết tinh
cũng như các hiệu ứng nhiệt của các thành phần trong cơng thức, góp
phần chứng tỏ trạng thái vơ định hình của ART và saccarose.
Q trình giải phóng dược chất từ bột đơng khơ có phần chậm
hơn và giảm được sự giải phóng ồ ạt ban đầu. Điều này có thể là do
sự có mặt của đường saccarose trong công thức bột đông khô đã tạo
ra các liên kết hydro với các nhóm phân cực trên bề mặt của nano,
làm tắc các lỗ xốp trên bề mặt của nano từ đó dẫn đến làm giảm khả
năng giải phóng dược chất.
Nghiên cứu đã tiến hành đánh giá độ vô khuẩn của mẫu bột đông
khô sau pha chế bằng phương pháp cấy trực tiếp. Đây là phương

pháp dùng khá phổ biến trong phép thử vô khuẩn của các TP nano.
Quy trình bào chế bột đơng khơ pha tiêm chứa TP nano đã đảm bảo