Lý thuyết tổng hợp Y Sinh Học Phân tử

MiMi nè :)

LÝ THUYẾT ÔN TẬP Y SINH HỌC PHÂN TỬ
 Học thuyết tế bào
- Có 3 nguyên lý:
+ Tất cả sv đều được cấu tạo từ: 1 or nhiều TB
+ TB: đơn vị cấu trúc của sự sống
+ TB: chỉ được sinh ra từ “sự phân chia” của TB đã tồn tại trước đó.
 Đặc điểm cơ bản của TB
- Kích thước: nhỏ bé (vài μm)
- Đa dạng: hình thái, chức năng
- Thành phần hóa học: giống nhau (DNA,RNA,Protein, H 2O,
C6H12O6,Na+,Mg2+,Ca2+...)
- Tiến hóa từ 1 tổ tiên chung
- Gen quy định: cấu trúc, chức năng, hoạt động
- Đa bào: vào chục - nhiều tỷ TB (người 100 tỷ TB)
- Xảy ra các quá trinh trao đổi chất: giúp TB sinh trưởng, phát triển, duy
trì, phục hồi. Gồm 2 quá trình:
+ Sự đồng hóa: các chất đơn giản kết hợp với nhau tạo thành chất phức
tạp => thu năng lượng. (đơn giản + đơn giản => phức tạp)
+ Sự dị hóa: phân giải các chất phức tạp tạo thành các chất đơn giản =>
giải phóng năng lượng. (chia phức tạp => đơn giản)
- Tính cảm ứng: Phản ứng lại với MT lý, hóa trực tiếp xung quanh.
- Khả năng sinh trưởng: Tăng kích thước, số lượng.
- Khả năng sinh sản: Vơ tính, hữu tính.
 Phân loại tế bào
- Dựa vào: cấu trúc và kích thước
1. Tế bào nhân sơ (Prokaryote): VK, Cổ khuẩn
- Hình thái: que, cầu, xoắn, chuỗi, khối
- Có roi di động
- KT: 1-10 μm

- TBC: bao bọc bởi Màng và vách TB
+ Chứa 65-90% nước, chất vô cơ, hữu cơ.
+ Phân bố gồm: Ribosome (tổng hợp Protein), enzyme, DNA Vi
khuẩn (DNA trần, dạng vòng, khu trú ở thể nhân - nucleoid), quá trình
trao đổi chất và năng lượng: Tổng hợp protein, q trình đường phân, hơ
hấp hiếu khi, quang hợp.
+ DNA dạng vòng khác, nhỏ hơn gọi là plasmid: chưa thông tin di
truyền, truyền từ VK này sang VK khác (tải nạp)
- Vách TB chứa peptidoglycan: polysaccharide liên kiết với nhau bởi
polypeptide ngắn. Vách TB => Kháng sinh
+ VK Gram dương: Vách đơn, peptidoglycan dày => tím đậm
+ VK Gram âm: Vách mỏng, peptidoglycans mỏng, không giữ màu
=> màu hồng


MiMi nè :)

- Màng TB: lipoprotein, bao bọc TBC, ngăn cách MT bên trong và ngoài
TB
2. Tế bào nhân thật (Eukaryote): ĐV,TV, tảo, nấm, ĐV nguyên sinh
- KT: 5-100 μm
- Cấu trúc: nhân rõ rệt, màng nhân bao bọc chất nhiễm sắc (DNA liên kết
histone)
- Màng TB:
+ Màng kép (2 lớp phospholipid) bao bọc TBC
+ Màng ngăn có chon lọc: cho oxi, chất dinh dưỡng, chất thải qua
màng.
+ Có protein gắn trên màng: gọi là thụ thể/kênh dẫn truyền.
- TBC:
+ Nằm giữa nhân, màng TB

+ Chứa nhiều bào quan, tp khác trong MT bán lỏng.
+ Là nới diễn ra hoạt đọng trao đổi chất
- Ty thể: diễn ra sự hô hấp TB và sinh tổng hợp ATP.
- Ribosome: sinh tổng hợp protein, nằm tự do trong TBC/gắn lưới nội
chất hạt, màng nhân.
- Lưới nội chất: mạng lưới các túi, ống có màng bao bọc, hoạt đơng trong
q trình tổng hợp màng, tổng hợp khác, quá trình trao đổi chất.
+ Mạng lưới nội chất hạt: bề mặt gắn nhiều riboxome, tổng hơp
protein để bài xuất ra khỏi TB. (insulin, hormone)
+ Mạng lưới nội chất trơn: gắn enzyme xúc tác tổng hợp hydrocacbon
và lipid cho TB (TB ruột non tổng hợp glycerid, TB gan chưa nhiều
enzyme phân giải chất độc)
- Bộ máy Golgi:
+ Hệ thống túi màng dẹt, xếp chồng nhau song song vòng cung, nối
nhau bằng các ống nối.
+ Là nơi tập trung, sửa đổi, phân loại, tiết các chất được tổng hợp
trong TB (protein,lipid)
- Lysosome: bào quan dạng túi, chứa hệ enzyme đậm đặc thủy phân đại
phân tử như protein, acid nucleic, lipid, hydrocacbon => đổi mơi stp TB,
tạo nguồn nguyên liệu sinh tổng hợp chất mới.
- Peroxisome: tồn tại Gan, thận ĐV có vú, nấm men, lá - hạt TV. Chuyển
hóa các chất sinh tổng hợp H2O2 (catalase)
- Trung thể: q trình phấn bào tạo thoi vơ sắc
- Lơng nhung: lấy các mấu lồi tăng diện tích bề mặt
- Nhân TB: hình cầu, d=5μm, chứa thơng tin duy truyền được mã hóa
trong phân tử DNA. Là trung tâm điều hành, định hướng, giám sát hoạt
đọng trao đổi chất trong quá trình sinh trưởng, sinh sản.
- Màng nhân: mang phospholipid kép, có lỗ, nối lưới nội chất.
- Nhân con/ hạch nhân: tham gia sinh sản ribosome, có thể có 1 hoặc
nhiều

MiMi nè :)

- Chất nhiễm sắc: hạt (DNA sơik + histone). TB phân chia, DNA xoán
cực đại => nhiễm sắc thể: dạng que, màu đậm.
3. So sánh TB nhân sơ và TB nhân thật
- Giống nhau: (4)
+ Màng TB là màng kép, chứa phospholipid
+ Thông tin di truyền được mã hóa trong DNA bởi các mã di truyền
giống nhau.
+ Quy trình tổng hợp RNA (phiên mã) và tổng hợp (dịch mã) tương
tự nhau.
+ Có ribosome là nơi tổng hợp protein.
- Khác nhau: (5)
NHÂN SƠ
NHÂN THẬT
1-10μm
5-100μm
Cấu tạo đơn giản, TBC chỉ chứa: Cấu tạo phức tạp, TBC phân vùng
ribosome, thể nhân
và chứa các bào quan: lưới nội
chất,ribosome,ty
thể,
golgi,
lysosome,...
Thông tin di truyền chứa trong Thông tin di truyền chứa trong
phân tử DNA trần, dạng vòng, nằm phân tử DNA sợi, liên kết với
trong TBC
protein histone tạo thành thể nhiễm

sắc, khu trú trong nhân.
Không có nhân
Có nhân với màng nhân
Chỉ có thể nhân là vùng TBC chứa
DNA
Phân bào đơn giản: trực phân
Phân bào phức tạp: nguyên phân,
giảm phân
 Cấu trúc DNA
- Đại diện phân tử chứ thông tin di truyền, nằm trong nhân.
- Gồm: 1 chuối xoắn kép
+ 2 mạch đơn nối với nhau bằng liên kết hydrogen.
+ 1 mạch đơn = 1 chuỗi các nucleotic.
+ 1 nucleotic: nhóm phosphate, đường ribose (pentose 5 carbon),
base (2 nhóm: purine và pyrimidine)
Nucleotic thuộc purine: A,G
Nucleotic thuộc Pyrimidine: T,C,U
+ Nucleotic trên mạch đơn liên kết nhau = liên kết phosphate
- Phân tử DNA: 2 mạch đơn gắn nhau = lk hydrogen giữa các base,
theo nguyên tắc bổ sung: A-T, G-C
+ Mỗi mạch đơn:
1 đầu 5’ phosphate tự do
1 đầu 3’ OH tự do


MiMi nè :)

 Định hướng 5’  3’
+ Hướng của 2 mạch: ngược nhau (2 mạch đối song song)
+ Đường kính: 20A

 Nhiễm sắc thể
- Trong TB Eukaryote, phân tử DNA  quấn quanh 8 histon 
nucleosome  chuỗi nucleosome  sợi nhiễm sắc chất (chromatin)
- d chuỗi: 20A ; d chromatin: 100 – 300 A
- Phân bào: chromatin xoắn cuộn  NST (NST ngắn hơn DNA
50.000 lần)
- DNA prokaryot: mang thơng tin mã hóa protein
- DNA eukaryote: mang trình tự mã hóa (exon) và khơng mã hóa
(intron)
+ Các trình tự lặp lại nhiều lần: 10-15% hệ gen, những trình tự
ngắn, khơng mã hóa, tập trung ở tâm động, đầu NST. Chức năng:
tham gia quá trình di chuyển trên thoi vơ sắc, bảo vệ đầu mút NST
trong q trình sao chéo DNA.
+ Các trình tự lặp lại trung bình: 25-40% hệ gen, đa dạng, kích
thước lớn, phân bố tồn bộ hệ gen. Là những trình tự khơng mã
hóa hoặc mã hóa cho rRNA, tRNA
+ Các trình tự duy nhất: Gen mã hóa cho protein, trình tự đặc biệt
cho từng gen.
- DNA có khản năng biến tính và hồi tính:
+ Biến tính: 2 sợi đơn DNA tách ra khi lk hydrro giữa các base bị
phá vỡ do hóa học hay vật lý.
+ Hồi tính: 2 sợi đơn DNA có thể bắt cặp lại với nhau theo nguyên
tắc bổ sung nếu giảm nhiệt độ hoặc nồng độ.
 Sinh tổng hợp DNA – Qúa trình nhân đơi DNA
- Qúa trình nhân đơi DNA: quá trình 1 phân tử DNA ban đầu được
nhân lên thành 2 phân tử DNA giống hệt nhau và giống phân tử
DNA ban đầu. Diễn ra trước khi phân bào.
- Gồm các bước: Mở đầu, kéo dài, kết thúc.
Mở đầu:
+ Q trình nhân đơi bắt đầu từ “Điểm khởi đầu sao chép OriC” giàu

A,T.
+ Enzyme DNA helicase: trượt trên chuỗi xoắn kép DNA → tháo
xoắn DNA → tách rời 2 mạch DNA → chạc ba nhân đôi.
+ Protein SSB: gắn vào mạch đơn → giữ 2 mạch thẳng sẵn sàng làm
khuôn mẫu để tổng hợp mạch DNA mới.
Kéo dài:
+ DNA primase: tổng hợp đoạn mồi: 3’-OH, kết thúc tại OriC.
+ 2 mạch đơn thành khuôn mẫu tổng hượp mạch mới nhờ: DNA
polymerase III → bán bảo tồn, độ chính xác cao.


MiMi nè :)

+ Mạch DNA mới được tổng hợp theo chiều 5’ - 3’: bằng cách kết
hợp nucleotic bổ trung theo trình tự trên mạch khn mẫu.
+ Mạch mới: được tổng hợp liên tục là mạch tới, mạch còn lại là
mạch chậm: được tổng hợp gián đoạn.
Kết thúc:
+ Đọan mồi RNA: được phân gải bởi RNAse H, thay thế bằng DNA
bới DNA polymerase I.
+ DNA ligase: nối okazaki trên mạch chậm → DNA hoàn chỉnh
- Các enzyme khác:
+ Topoisomease: ngăn cản hình thành xoắn cực đại ở đoạn DNA trước
chạc 3 sao chép.
+ Protein Sliding clamp: giữ DNA polumerase trên chuỗi DNA.
 So sánh Prokaryotes và Eukaryotes
GIỐNG NHAU
- 3 bước
- Cần RNA primer
- Bán bảo tồn

- Mạch DNA mới được tổng hợp theo hướng 5’ - 3’ trên mạch tới và
mạch chậm
KHÁC NHAU
Prokaryotes
Eukaryotes
- Xảy ra trong TBC
- Xảy ra trong nhân, ở giai đoạn S
trong phân bào.
- Có 1 điểm khởi đầu phiên mã
- Có nhiều điểm khời đầu phiên mã
- Đoạn Okazaki dài (1000-2000 - Đoạn Okazaki ngắn (100-200
nuc)
nuc)
- Xảy ra rất nhanh (1000nuc/s)
- Xảy ra chậm (1/10 so với
Prokaryotes)
- Bao gồm DNA polymerase I,III
- Bao gồm DNA polymerase α,σ,ε.
+ DNA polymerase α + DNA
primase → RNAprimer
+ DNA polymerase σ,ε thay thế
DNA polymerase α tổng hợp đoạn
Okazaki và mạch tới
- Khơng có nucleosome
- Có nucleosome → giải phóng/kết
hợp histone.
- DNA vịng → ko có điểm tập hợp - DNA thắng → tổng hợp telomere
cuối.
= ezyme telomerase
 Một số kỹ thuật Y sinh học phân tử thông dụng

- PCR:
+ Kỹ thuật nhân nhanh một đoạn DNA (gen) trong phịng thí nghiệm.


MiMi nè :)

+ Tạo ra hàng triệu bản sao của 1 trình tự DNA trong 1-2h
+ Mơ phỏng q trình nhân đôi DNA
+ Ứng dụng: sinh học, y học, nông nghiệp.
- Real-time PCR:
+ Kỹ thuật PCR định lượng: định lượng DNA gốc có trong bệnh
phẩm.
+ Có chất phát quang, ghi tín hiệu khi DNA mới được tổng hợp.
+ Rút ngắn thời gian làm XN
+ Phát hiện sự hiện diện của yếu tố gây bệnh, gen qan tâm.
- Giải trình tự DNA:
+ Có 2 phương pháp thường dùng:
Maxam-Gilbert: hóa học, đồng vị phóng xạ
Sanger-Couulson: enzyme (4 loại dNTP hoặc 4 loại ddTNP)
+ Ứng dụng: xác định các đột biến gen, tầm sốt ung thư, định danh
tác nhân gây bệnh.
- Tính đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt giới hạn - RFLP:
+ Kỹ thuật nghiên cứu dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn, khai
thác điểm khác biệt trong trình tự DNA → lập bản đồ gen.
+ Enzyme cắt giới hạn: có khả năng nhận biết một trình tự DNA đặc
hiệu. Có 3 loại:
Loại 1: khi enzyme nhận biết trình tự sẽ di chuyển và cắt ở vị trí
cách đó 1000-5000 cặp base
Loại 2: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó
Loại 3: en zyme nhận biết trình tự và cắt ở vị trí cách đó 20 cặp

base.
+ Nguyên tắc: dựa trên độ đặc hiệu của enzyme cắt giới hạn đối với vị
trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai
cá thể → những đoạn cắt khác nhau.
+ Ứng dụng: Lập bản đồ gen, XN phả hệ, xác định giống, tác nhân
gây bệnh, phân tích đột biến, bệnh di truyền.
- Lai phân tử:
+ Là sự bắt cặp của 1 đoạn dò acid nucleic mạch đơn với 1 mạch đơn
acid nucleic khác từ mẫu.
+ Mẫu chứa DNA → Southern blot
+ Mẫu chứa RNA → Northern blot
+ Đánh dấu protein → Western blot
+ Phát hiện các trình tự nucleotide, nghiên cứu cấu trúc DNA của hệ
gen.
 Khái niệm Kỹ thuật PCR
- Là kỹ thuật nhân gen (DNA) trong ống nghiệm, cho phép khuếch đại
theo hàm số mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA quan tâm.
- Thực hiện với các đoạn base: từ vài chục → hàng ngàn cặp base.
- Ngun lý: Biến tính, hồi tính và q trình nhân đôi DNA.


MiMi nè :)

- Ứng dụng: phát hiện sự hiện diện yếu tố gây bệnh, gen quan tâm.
- Thiết bị: máy luân nhiệt
- Ưu điểm: độ nhạy cao, phát hiện 1 lượng DNA rất nhỏ trong mẫu trong
1-2h
- Nhươc điểm: Chỉ phân biệt dựa trên kích thước, khơng phát hiện các đột
biến điểm, phải xử lý sau PCR, chất nhuộm DNA Ethidium bromide gây
ung thư.

 Nguyên tắc PCR:
- Là 1 chuỗi 25-35 chu kỳ nhiệt,mỗi chu kỳ 3 giai đoạn:
+ Biến tính: Nâng nhiệt độ 94-98 độC, cắt lk hydro của mạch đơi
DNA, time:15-20s → DNA đích bị biến tính
+ Bắt cặp: Hạ nhiệt độ 45-65 độC, time: 10-30s → đoạn mồi bắt cặp
bổ sung vào DNA đích.
+ Kéo dài: nâng nhiệt độ lên 72 độC, time: tùy chiều dài DNA đích →
đoạn DNA mới được tổng hợp.
- Qua 1 chu kỳ, từ 1 DNA ban đầu nhân lên thành 21 = 2 DNA
=> n chu kỳ, số lượng DNA đạt được 2n phân tử → theo hàm số mũ.
 Thành phần phản ứng PCR:
- Đoạn DNA đích (khn mẫu) cần khuếch đại.
- 4 loại Deoxyribonucleotic (dNTPs): dATP,dGTP,dTTP,dCTP
- Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
- Cặp mồi: dài 10-30 base, trình tự bổ sung, đặc hiệu với DNA đích
- Dung dịch đệm: chứa cation NH4+, K+,Mg2+, Cl DNA khuôn mẫu:
- Độ tinh sạch cao, không lẫn tạp chất
- Hàm lượng: 10-500ng/50μl phản ứng
- Mạch đơn ỏ mạch đơi
- Có thể được tách chiết từ bạch cầu mãu ngoại vi, mô sinh thiết, dịch cơ
thể, mơ xương, răng, tóc
- Ngun lý tách chiết DNA:
+ Phá vỡ màng TB và màng nhân
+ Loại bỏ các thành phần đã bị biến tính
+ Loại bỏ protein
+ Kết tủa DNA
- Phân tích định tính và định lượng DNA: điện di, sắc ký, độ hấp thụ UV
260/280nm
 Đoạn mồi:
- Là những đoạn oligonucleotic dài 10-30base, có trình tự bổ sung đặc

hiệu với 2 đầu DNA đích
- Gồm: 1 mồi xuôi bắt cặp với mạch antisense
1 mồi ngược bắt cặp với mạch sense
- Nồng độ: 10-50μm phản ứng


MiMi nè :)

- Các phần mềm thiết kế mồi: primer express, primer 3
- Lưu ý khi thiết kế mồi:
+ Trinh tự mồi: 35-50% GC
+ 2 đoạn mồi ko có trình tự bắt cặp bổ sung
+ Tránh những vùng: trình tự khơng bình thường, trinh tự lặp
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (oC)=4(G+C) + 2(A+T)
+ Nhiệt độ của giai đoạn bắt cặp: Ta=Tm - 5oC
+ Nhiệt độ nóng chảy của 2 đoạn mồi không nên cách xa nhau.
 DNA polymerase
- Vai trò: quyết định hiệu quả phản ứng
- Enzyme chịu nhiệt (>90oC), thường là Taq polymerase
- các loại chiu nhiệt khác: Tth polymerase, Pfu polymerase
Lượng Taq polymerase cho 1 pư là 1-2 đơn vị
 Các deoxyribonucleotic tự do
- 4 loại dNTP: dATP,dTTP,dGTP,dCTP
- Nồng độ cho 1 pư: 20-200μm
- 4 loại dNTP phải có nồng độ tương đương nhau
 Ion Mg2+ và dung dịch đệm
- Thành phần dung dịch đệm chứ: Tris HCl, K+,NH4+,Mg2+, Cl
- Nồng độ Mg2+ thích hợp: 0.5-5 mM
- Nồng độ Mg2+:
Quá thấp: Taq polymerase ko thể hoạt động bình thường trong thời

gian kéo dài
Quá cao: ngăn ngừa sự biến tính hồn tồn DNA
 Phát hiện sản phẩm PCR
- Phương pháp: Điện di trên gel agarose
+ Tạo thạc agarose
+ Dùng dung dịch TAE
+ DNA tích điện âm: di chuyển vê cực +
+ Tốc độ di chuyển phụ thuộc kích thước DNA
+ Nồng độ agarose càng cao: độ phân gải càng lớn
+ Sau điện di, nhuộm DNA trong gel với các chất sáng sáng dưới tia
UV
+ Chất nhuộm bám vào mạch đôi và phát sáng, cho phép quan sát,
chụp hình DNA
+ Ethidium bromide: chất độc → ung thư
+ Nếu đoạn DNA rẩ nhó (<100 cặp base) → sử dụng gel
polyacryzlamide (PAGE)
 Một số vấn đề thường gặp
- Không có sản phẩm hoặc sản phẩm q ít: Kiểm tra thao tác, DNA mẫu,
trình tự; ↑ to biến tính, t/g kéo dài, bắt cặp, ↓ to bắt cặp


MiMi nè :)

- Sản phẩm không đặc hiệu: Kiểm tra trình tự, độ tinh sạch; thay đổi nồng
độ Mg2+; ↑ to găn mồi ; ↓ DNA mẫu
 Các loại PCR
- PCR đơn mồi (monoplex): sử dụng 1 cặp mồi → khuếch đại 1 đoạn
DNA đích
- PCR đa mồi (multiplex): sử dụng nhiều cặp → nhân các đoạn DNA
khác nhau trên cùng 1 phân tử DNA or phân tử DNA khác.

+ Phức tạp do các cặo mồi: có cùng to bắt cặp, không được bắt cặp với
nhau.
+ Đảm bảo độ nhạy như PCR đơn mồi.
- PCR tổ/lồng:
+ DNA đích thấp → ko đủ nhạy để phát hiện
+ Sử dụng 2 cặp mồi có trình tự lồng vào nhau
+ Sản phẩm PCR thứ 1 làm khuôn cho pư PCR thứ 2
- PCR sao chép ngược: sử dụng khuếch đại bộ gen virus có bộ gen là
RNA
+ Gồm 2 giai đoạn: Enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase
tổng hợp DNA từ khuôn mẫu
 Ứng dụng trong y học
- Chẩn đoán tác nhân nhiễm trùng
- Chẩn đoán bệnh di truyền
- Pháp y
- Điều trị ung thư
* Phần ĐBCL xem trong slide nhé :)
 Khái niệm - Nguyên tắc REAL - TIME PCR
- Là kỹ thuật PCR cho phép hiển thị kết quả khuếch đại DNA đích ngay
sau mỗi chu kỳ nhiệt
- Dựa vào cường độ huỳnh quáng phát ra sau mỗi chu kỳ, tỉ lệ thuận với
lượng sản phẩm PCR tạo thành
- Không xử lý sản phẩm PCR bằng điện di agarose → hạn chế ngoại
nhiễm, gây độc của chất nhuộm
- Nguyên tắc: 3 giai đoạn như PCR truyền thống
 So sánh Real-time PCR và PCR truyền thống
Real-time PCR

PCR truyền thống

- Định lượng sản phẩm Cường
độ
huỳnh Sau khi kết thúc PCR:
quang sau mỗi chu kỳ điện di, nhuộm DNA
nhiệt
- Thời gian
Ngắn
Dài
- Độ nhạy

Cao

Thấp


MiMi nè :)

- Độ đặc hiệu

Cao

Thấp

- Nguy cơ ngoại nhiễm Hạn chế

Cao

- Ước lượng DNA Có thể ước lượng
trong mẫu ban đầu

Khó

 Thành phần của pư Real-time PCR
- Đoạn DNA đích cần khuếch đại
- 4 loại dNTPs: dATP,dGTP,dTTP,dCTP
- Enzyme polymerase chịu nhiệt
- Cặp mồi: dài 10-30 base, trình tự bổ sung đặc hiệu với DNA đích
- Dung dịch đệm chứa: cation NH4+,K+,Mg2+,Cl- Chất nhuộm huỳnh quang hoặc đoạn dò đặc hiệu
 Các loại Real-time PCR thông dụng
- Tùy vào chất huỳnh quang, chia làm 2 loại:
+ Sử dụng chất huỳnh quang chèn vào mạch đôi DNA như Ethidium
bromide or SYBR I (sử dụng rộng rãi hơn: nền hunhf quang thấp, ái lựuc
cao, ít ảnh hưởng biến tính)
+ Sử dụng đoạn dò (probe) đặc hiệu
- Cơ chế phát huỳnh quang:
+ Khi một phân tử bị kích thích bởi nhiệt hay quang, sec chuyển năng
lượng từ mức S0 → S1cx
+
S1cx là trạng thái không bền, phân tử sẽ nhường năng lượng → năng
lượng thấp hơn. Khi trở về năng lượng ban đầu, phân tử phát ra năng
lượng dưới dạng photon gọi là ánh sáng huỳnh quang.
- Real-time PCR sử dụng chất nhuộm huỳnh quang:
+ Chất nhuộm có ái lực cao với sợi đơi DNA → sợi đơi phát màu khi
bị kích thích
+ Ngun tắc:
Khơng có sản phẩm PCR → ko phát huỳnh quang or phát khơng
đáng kể.
Có sản phẩm PCR → chất nhuộm chèn vào mạch đôi, phát huỳnh
quang
+ Ưu điểm: đơn giản, dễ, giá rẽ

+ Nhược điểm:
Chèn vào bất kì mạch đôi nào, kể cả sản phẩm ko đặc hiệu → ko
phân biệt các đoạn DNA có chiều dài khác nhau.
Khơng sử dụng trong Multiplex real-time PCR và SNP or xác
định kiểu di truyền.
- Real-time PCR sử dụng đoạn dò đặc hiệu:


MiMi nè :)

+ Đoạn dò: là đoạn oligonucleotic sợi đơn, có trình tự bắt cặp đặc
hiệu với DNA đích.
+ Ngun tắc:
Các đoạn dò ở trạng thái tự nhiên ko phát quang.
Khi có mặt sản phẩm PCR, đoạn dị bắt cặp vào vị trí đặc hiệu
trên sợi DNA và phát huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với số lượng sản phẩm PCR
+ Có 2 đọan dị: Taqman và Beacon
 Taqman:
+ Đoạn oligonucleotic (24-30 base) có trình tự bổ sung với DNA đích.
+ 5’ gắn chất huỳnh quang: Reporter (R)
+ 3’ gắn chất hấp thụ: Quencher (Q)
+ Chưa có sản phẩm PCR: huỳnh quang phát ra từ R bị Q hấp thụ →
ko có tín hiệu huỳnh quang.
+ Có sản phẩm PCR: Taq bắt cặp vào sợi khuôn DNA tại vị trí đặc
hiệu, đoạn mồi bắt cặp đầu 3’
+ Giai đoạn kéo dài: R rời xa Q và phát tín hiệu huỳnh quang
+ Sản phẩm PCR nhiều → reporter tự do nhiều → cường độ huỳnh
quang nhiều
 Beacon:

+ Đoạn oligonucleotic (25-40 base)
+ 5’ gắn chất huỳnh quang: Reporter (R)
+ 3’ gắn chất hấp thụ: Quencher (Q)
+ Đoạn giữa: 15-39 base, trình tự bổ sung DNA đích
+ Mỗi đầu có 5-6 base, trình tự bổ sung nhau → beacon hình kẹp tóc
→ R ở gần Q nên bị Q hấp thụ hết huỳnh quang.
+ Giai đoạn biến tính: kẹp tóc khơng còn, R xa Q → phát huỳnh
quang.
+ Giai đoạn bắt cặp: ko có sản phẩm → kẹp tóc → ko có tín hiệu
huỳnh quang; có sản phẩm: R xa Q → phát huỳnh quang
+ Giai đoạn kéo dài: Taq không phân hủy Beacon mà chỉ làm Beacon
tách ra khỏi DNA đích → trở lại kẹp tóc → ko phát huỳnh quang.
 Ưu điểm:
+ Đặc hiệu, nếu trình tự khác biệt sẽ không bắt cặp → Taq và Beacon:
phát hiện SNP và xác định kiểu di truyền
+ Thích hợp cho phản ứng multiplex, phát hiện trình tự đích cùng lúc.
 Nhược điểm:
+ Khó thiết kế: chọ R-Q thích hợp, Beacon có trình tự 2 đầu 5’ và 3’
có khản năng bắt cặp mạnh → kẹp tóc
- Multiplex Real-time PCR:
+ Dùng 2 hoặc vài đoạn dị có trình tự bổ sung vỡi trình tự DNA khác
nhau trong pư PCR


MiMi nè :)

+ Mỗi đoạn dò mang phân tử phát huỳnh qunag R khác nhau ứng Q
khác nhau.
+ Sự xuất hiện huỳnh quang từ mỗi đoạn mồi → xác định mẫu thử
chứa trình tự DNA đích hay khơng hoặc định lượng trình tự đích của mỗi

đoạn dị.
 Phân tích kết quả PCR
- Biểu đồ khuếch đại:
+ Kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt
+ Trục tung: Cường độ huỳnh quang
+ Trục hoành: Chu kỳ nhiệt
+ Giai đoạn ủ: cường độ huỳnh quang thấp do lượng bản sao DNA
thấp → ánh sáng thấp
+ Giai đoạn lũy thừa: số lượng bản sao đạt 1 ngưỡng nhất định, tín
hiệu huỳnh quang tăng theo cấp số nhân.
+ Giai đoạn bình nguyên: cường độ huỳnh quang tăng đến một giai
đoạn rồi chậm dần → đạt đến gd bình nguyên (hiệu suất PCR ↓)
+
- Biểu đồ chuẩn:
+ Mục đích: xác định chính xác số lượng DNA đích ban đầu
+ Được pha loãng theo hệ 10
 Ứng dụng trong y học
- Lĩnh vực bệnh truyền nhiễm:
+ Định lượng virus (HBV,HCV,HPV.HIV)
+ Định lượng vi khuẩn (Mycobacterium, Salmonella)
+ Định lượng vi nấm (Candida, Aspergillus)
- XN viêm não mô cầu:
+ Phát hiện bản sao DNA của vk Neisseria menigitidis
+ Mẫu bệnh phẩm: DNT, dịch ngốy họng, khuẩn lạc đã ni cấy...
- Lĩnh vực ung thư lâm sàng:
+ XN các đột biến
+ Phát hiện SNP và xác định kiểu di truyền
+ Nghiên cứu biểu hiện gen: Cytokine, các thụ thể
- Phát hiện SNP và kiểu di truyền:
+ Sản phẩm PCR có thể khác biệt 1 hay 1 vài nucleotic gọi là SNP

+ Giúp phát hiện kháng thuốc của VST,UT,....
 Khái niệm giải trình tự DNA
- Là 1 chuỗi xoắn kép, gồm 2 mạch đơn cấu tạo từ: A,T,G,C
- Là phương pháp xác định thứ tự sắp xếp của các nucleotic trong phân tử
DNA
- Có 2 phương pháp:
+ Hóa học: đồng vị phóng xạ
+ Enzyme: dùng thêm 4 loại ddNTP bên cạnh 4 dNTP thông thường.
- Dựa trên kỹ thuật PCR thông thường


MiMi nè :)

- Ứng dụng: xác định gen đột biến, kiểu gen, định danh VSV
 Phương pháp hóa học
- Xử lý đoạn DNA với 1 chất hóa học → Làm biến đổi đặc hiệu 1 đoạn
base trên DNA đích
- Các nuc bị biến đổi sẽ tách ra khỏi mạch DNA → Đoạn DNA bị bẽ gãy
ở vị trí base bị biến đổi
- Điện di DNA đã được xử lý để phân tách các đoạn DNA dựa trên kích
thước.
- Ưu điểm: hiệu quả trong giải trình tự các đoạn DNA ngắn
- Nhược điểm:
+ Xác định nồng độ chất hóa học sao cho trên đoạn DNA chỉ có 1
base biến đổi → khó áp dụng cho đoạn dài
+ Sự độc hại của chẩ hoa học → biến đổi base trong nucleotic
 Phương pháp Enzyme
- Giải trình tự lên đến 1 kb
- Thực hiện trong 4 ống nghiệm
- Dựa trên kỹ thuật nhân gen PCR

- Sử dung ddNTP có cấu trúc tương tự dNTP, ở C số 3 đường pentose, (OH) thay bằng (-H)
- Khi tổng hợp mạch mới, ddNTP gắn 3’ → tổng hợp DNA ngừng lại do
ko tạo được liên kết phosphodieste vs nucleotic
- Đọc trình tự dựa trên tín hiệu huỳnh quang or phóng xạ
 Giải trình tự bằng máy tự động
- Dựa trên phương pháp enzyme
- Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau đánh dấu 4 loại ddNTP
- Phản ứng thực hiện trong 1 ống nghiệm
- Dựa vào màu huỳnh quang xác định trình tự nucleotic của DNA đích
 Ứng dung
- Giải mã bộ gen người
- Định danh vi nấm
- Phát hiện các kiểu đột biến gen
- Phát hiện các SNP
- Giải trình tự gen thế hệ mớ
 Khái niệm ching Lai phân tử
- Là sự bắt căp của 1 đoạn dò acid nucleotic mạch đơn với 1 mạch đơn
acid nucleotic khác
- Mục đích: phát hiện các trình tự nuc đặc thù, nghiên cứu cấu trúc DNA
- Kỹ thuật lai giữa DNA-DNA: kỹ thuật Southern blot
+ Lai RNA - DNA: Northern blot
+ Lai protein - kháng thể: Western blot


MiMi nè :)

- Áp dụng lập bản đồ giới hạn của 1 gen → phát hiện đa dạng tình tự của
1 gen ở các chủng, cá thể khác nhau, phát hiện đột biến điểm, mất đoạn,
thêm đoạn.
 Nguyên tắc Lai phân tử

- Bắt cặp bổ sung giữa đoạn DNA cần tìm và đoạn dị (probe) được đánh
dấu phóng xạ, huỳnh quang
- Nếu mẫu chứa trình tự DNA có khả năng bắt cặp bổ sung với mẫu dị →
xuất hiện tín hiệu phóng xạ
 Các bước tiến hành
- Chuẩn bị mẫu
- Chuyển sang màng lai
- Lai phân tử
- Đọc kết quả lai phân tử
 Enzyme cắt giới hạn
- Là nhóm enzyme gồm DNAse có khả năng bẻ gãy liên kết
phosphadiester tại những trình tự xác định
- Gồm 3 loại: I,II,III (phổ biến nhất là II)
Loại I: khi enzyme nhận biết trình tự sẽ di chuyển và cắt ở vị trí cách
đó 1000-5000 base
Loại II: enzyme nhận biết và cắt ngay tại vị trí đó
Loại III: nhận biết và cắt ở vị trí cách đó 20 cặp base.
 Kỹ thuật Northern blot
- Phát hiện các trình tự RNA bằng cách lai RNA với các mẫu dò DNA
→ Phát hiện các đột biến gen bất thường trong cấu trúc RNA (bất thường
trong điều hòa gen
- Nguyên tắc: tương tự Southern blot
- RNA rất dễ bị biến tính bởi RNAse → ảnh hưởng độ nhạy cảm của phản
ứng.
 Kỹ thuật Western blot
- Là kỹ thuật lai giứa protein và protein (KN-KT) đặc hiệu.
Pro KN được phát hiện qua pư tạo màu or phát huỳnh quang.
- Ứng dụng: phát hiện KN gây ra bới VK, virus,kst, đánh giá tính chuyên
biệt của KT
 Kỹ thuật lai tại chỗ

- Là phương pháp lai phân tử ngay trong TB hoặc Mô, cho phép nghiên
cứu acid nucleic mà không cần tách chiết.
- Thường sử dụng mẫu dò để đánh dấu huỳnh quang: Kỹ thuật FISH
- Kỹ thuật lai trên NST:
+ Xác định vị trí và sự phân bố của 1 trình tự DNA trên NST nhờ mẫu
dị chun biệt
+ Dùng trong các trường hợp: Chẩn đoán trước sinh bất thường trên
NST, phát hiện mất đoạn, chuyển đoan, bất thường NST trong ung thư.


MiMi nè :)

- Kỹ thuật lai trên tế bào và mô:
+ Dùng để nghiên cứu sự phân bố mRNA trong TB
→ Chức năng, sự điều hòa biểu hiện và tương tác giữa mRNA vưới
các thành phần khác của TB.