Định lượng Bacillus cereus

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
TPHCM
KHOA:CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
Đề tài: Định lượng Bacillus cereus
GVHD: cơ Phan Thị Kim Liên

Nhóm 7


Danh sách nhóm
1.Nguyễn Thị Thanh Thảo

2005130222

2.Cầm Thị Hồn

2005130221

3. Lý n Sơn

2005130162

4. Lê Hồng Quang

2005130173


1.Tình hình ngộ độc

2.Đặc điểm của B.cereus
3.Định lượng B.cereus bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc
4. Định lượng B.cereus bằng phương pháp
MPN


1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
o Thực phẩm nhiễm Bacillus cereus là rất phổ
biến. Người ăn phải thực phẩm này thường
mắc hai triệu chứng điển hình là tiêu chảy và
nơn mửa.
o Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52
trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus
cereus được phát hiện, chiếm khoảng 2% số
ca ngộ độc thực phẩm.


1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM
o Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận hơn
5.600.000 ca tiêu chảy do nhiễm trùng qua
thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong.
o Riêng 9 tháng đầu năm ngoái ghi nhận
được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có
12 ca tử vong.
o Thực tế, theo các chuyên gia,phải gấp ít
nhất 10 lần con số được công bố.


1.TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM

• Mới đây,15/10/2015 vụ ngộ độc thực phẩm

xảy ra ở trường mầm non Thốt Nốt ( quận
Thốt Nốt, TP Cần Thơ ) làm cho 30 trẻ mầm
non bị ngộ độc. Nguyên nhân được xác định
là do các trẻ ăn phải thức ăn có nhiễm
Bacillus cereus.
• Vi khuẩn này nhiễm vào thức ăn do quá trình

bảo quản, tiếp xúc và chế biến không kỹ.


2. ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS
•
•
•
•

Trực khuẩn, Gram (+).
Hiếu khí, kỵ khí tùy ý.
Lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+).
Có khả năng sử dụng nitrate


2. ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS
• Nhiệt độ tối thích: 35-400C
• pH tối thích: 4.5-9.3
• Dễ tạo bào tử và bào tử nảy
mầm rất dễ dàng.
• Có khả năng di động.

Mơ hình cấu tạo B.cereus


2. ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS
• Trên mơi trường chọn lọc,vi khuẩn này
tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn.


2. ĐẶC ĐIỂM, TÍNH CHẤT BACILLUS CEREUS
Phân bố nhiều trong tự nhiên.
Nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm .
Vi khuẩn này xâm nhập vào sữa, thịt, rau
quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khơ.
Có khả năng tiết ra hai loại độc tố:
diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic
toxin gây nôn mửa.


3.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC


PHẠM VI ÁP DỤNG
• Dùng để định lượng B.cereus giả định có
khả năng mọc trên đĩa thạch bằng kỹ
thuật đếm khuẩn lạc ở 30 độ C.
• Phương pháp này có thể áp dụng cho các
sản phẩm dùng cho người và thức ăn
chăn nuôi và các mẫu môi trường trong

khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.


NGUYÊN TẮC
• Cấy một lượng mẫu thử quy định lên bề mặt
môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các
đĩa petri.
• Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều
kiện, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân
của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
• Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 30oC trong
khoảng 18-48 giờ
• Tính số lượng B.cereus trong 1ml (1g) mẫu từ
số lượng khuẩn lạc khẳng định thu được trên
các đĩa ở các độ pha loãng đã chọn.


MƠI TRƯỜNG VÀ HĨA CHẤT:

Mơi trường và hóa chất
Mục đích
SPW ( Saline Peptone Water )  
MYP agar base ( Mannitol- Egg
 
Yolk-Polymixin ).
 Ni cấy
Polymixin B.
B.cereus
Egg Yolk ( nhũ tương lịng đỏ
trứng ).

Blood agar base.
 Khẳng định
B.cereus giả định
Sheep blood.
HCL và NaOH 10%.

Chỉnh pH


Môi trường MYP
Thành phần
Cao thịt
pepton
Mannitol
NaCl
Phenol red ( 1% trong ethanol 90% )
Agar
Nước cất
Dung dịch Polymixin
Lòng đỏ trứng

Hàm lượng
1g
10g
10g
10g
2,5ml
15g
900ml
2,5ml

12,5ml


QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
Cân 10g (10ml) mẫu + 90 ml SPW
Đồng nhất mẫu

Dịch mẫu [ 10-1 ]

Dịch mẫu [ 10-2 ]
0,1ml

MYP

MYP

MYP

MYP

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn
mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt thạch. Ủ 30 oC/24 giờ.
Khẳng định B.cereus giả định trên MT thạch máu cừu bằng
phản ứng Haemolysin, Ủ 30oC/24 giờ.
Tính và biểu thị kết quả


CÁCH TIẾN HÀNH
1

4

Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu.
2

Pha loãng mẫu.

3

Cấy và ủ mẫu
Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định


Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù
ban đầu.


Bước 2: Pha loãng mẫu
1ml

9ml
SPW

……
10-1

10-2

10-n

Bước 3: Cấy và ủ mẫu


Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

Đọc kết quả: Chọn các đĩa có số khuẩn lạc mọc dưới
150 sau 24h nuôi cấy ở 2 độ pha loãng liên tiếp.
Đếm các khuẩn lạc giả định.
Lấy 5 khuẩn lạc giả định.
Cấy ria, cấy đâm sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã chọn
lên mặt thạch máu cừu, ủ ở 30oC trong 24h.
Đọc kết quả.


7.CÁCH TÍNH KẾT QUẢ:
•  

( CFU/g hay CFU/ml )

Trong đó:
• C: Tổng số khuẩn lạc B.cereus giả định đếm được
trên 4 đĩa của hai bộ pha lỗng tiếp theo.
• V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng
ml.
• n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ nhất.
• n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha lỗng thứ hai.
• d: hệ số pha lỗng ứng với độ pha lỗng thứ nhất.
• R: Tỉ lệ khẳng định dương tính.

Ví dụ:
Độ pha lỗng

10-1

10-2

Số khuẩn lạc

120
130

70
60

•  

Cách tính R:
Lấy 5 khuẩn lạc giả định
5 ống nghiệm thạch máu cừu
máu cừu
dương tính (+).

tan


4.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN
Phương pháp MPN được sử dụng để:

 Định lượng B. cereus trong những mẫu
thực phẩm khơng được có B. cereus
nhiều hơn 10 tế bào/g.
 Kiểm tra những mẫu thực phẩm có tinh
bột khơ mà phương pháp đếm khuẩn lạc
khơng thích hợp


4.ĐỊNH LƯỢNG B.CEREUS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN
 Dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân
bố vsv trong các độ pha loãng khác nhau của
mẫu.
 Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lặp lại nhiều lần
( 3- 10 lần).
 Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong
các lần lặp lại có một số lần dương tính và có
một số lần âm tính.
 Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với
bảng thống kê => giá trị ước đoán số lượng vsv
trong mẫu.