QUY TRÌNH SẢN XUẤT LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
I.1. Giới thiệu về Yakult

Yakult là sữa uống lên men từ sữa bột gầy, đường, nước và chủng khuẩn
probiotic Lactobacillus casei Shirota.
Mỗi chai Yakult có chứa hơn 6.5 tỉ khuẩn L.casei Shirota. Không giống như hầu hết
những chủng khuẩn bình thường khác trong yogurt, mà khuẩn L.casei Shirota có khả
năng sống sót trong dịch vị dạ dày và dịch vị mật, tiến đến ruột vẫn sống, hỗ trợ phục hồi
sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Khi tiêu thụ Yakult hàng ngày,
khuẩn L.casei Shirota hỗ trợ cải thiện tiêu hóa, điều hịa hệ miễn dịch và ngăn ngừa các
bệnh truyền nhiễm.

Hình 1.1. Sản phẩm đặc trưng của sữa chua uống Yakult
Trong sản phẩm Yakult, chỉ chứa duy nhất chủng khuẩn Lactobacillus casei Shirota,
là chủng probiotic đã được chứng minh một cách khoa học là kháng dịch vị tiêu hóa, tiến
đến ruột vẫn sống và đã được chứng minh là có những tác động có lợi cho sức khỏe.
I.2. Đặc điểm chủng Lactobacillus casei Shirota
Đây là một chủng vi khuẩn lactic thuộc một lồi thơng thường, nhưng khác với các
chủng khác ở chỗ chúng đề kháng mạnh mẽ với dịch dạ dày (độ acid rất cao) và dịch mật
cùng các enzyme tiêu hóa khác, do đó đến được ruột non và phát triển được trong ruột
non. Chính vì vậy đây là một trong những lợi khuẩn mạnh nhất L. casei Shirota khơng có


gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng kháng sinh cho vi sinh vật bản địa của
người sử dụng, đặc biệt là các kháng sinh dùng phổ biến hiện nay như Vancomycin
(Khuẩn probiotic phải khơng có gene kháng kháng sinh hay chuyển gene kháng kháng
sinh cho vi sinh vật bản địa vì nếu khơng, nó sẽ làm rối loạn và ảnh hưởng đến quá trình
điều trị bệnh sau này).
Khả năng bám dính của khuẩn L. casei Shirota vào bề mặt của các tế bào thành ruột

là không cao (khuẩn probiotic phải có khả năng bám dính vào bề mặt các tế bào ruột để
kích thích hệ miễn dịch và chống lại các vi sinh vật gây bệnh bản địa định cư trong ruột.
Khuẩn L. casei Shirota khơng có khả năng phân giải niêm mạc dạ dày (gastric
mucin) (khuẩn probiotic phải khơng có khả năng phân giải lớp niêm mạc dạ dày. Lớp
niêm mạc có vai trị bảo vệ dạ dày không bị tác động chính bởi dịch vị acid dạ dày. Nếu
lớp niêm mạc này bị phá vở, dạ dày sẽ bị chính dịch vị acid do dạ dày tiết ra và phá hủy
gây loét, và tạo điều kiện cho vi sinh vật bản địa gây bệnh và gây nhiễm trùng đến các cơ
quan khác).
I.3.Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường
gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Chúng khơng có khả năng chuyển
động. Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose,
maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-acid lactic. Nhiệt độ tối
thích cho phát triển là 38-40oC, nhờ có hoạt tính protease nên có thể phân hủy protein
trong sữa thành acid amin.
I.3.1. Khả năng chịu được điều kiện dịch dạ dày nhân tạo
Nguyên tắc: Các mẫu sẽ được cho vào môi trường dạ dày nhân tạo SGJ. Theo nghiên
cứu của Zhou và cộng sự (2009) cho rằng giá trị pH 2 và pH 3 được xem là giới hạn
quyết định trong sàng lọc các chủng vi sinh vật có khả năng sống sót. Thời gian xử lý mô
phỏng theo thời gian lưu của thức ăn trong dạ dày từ 2 giờ đến 3 giờ.
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS dạ dày nhân tạo pH 2 cho vào các ống nghiệm
và đem thanh trùng ở nhiệt độ 90ºC trong 5 phút. Bổ sung dịch sản phẩm Asau khi đã lên


men với tỷ lệ cấy giống 10%. Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp
cấy trải trên đĩa petri sau các khoảng thời gian: 0; 60; 120 phút.
I.3.2. Khả năng chịu muối mật
Nguyên tắc: Sản phẩm đạt tiêu chuẩn probiotic phải có vi sinh vật có khả năng sống
và phát triển trên mơi trường có bổ sung muối mật (một thành phần được tiết ra trong
quá trình tiêu hóa thức ăn). Chính nhờ khả năng này mà vi khuẩn mới có thể tồn tại và

phát triển trong cơ thể.
Tiến hành: Chuẩn bị môi trường MRS và bổ sung muối mật để đạt nồng độ cuối
0,3%. Cho vào các ống nghiệm vô trùng 10 ml môi trường rồi bổ sung 1 ml dịch mẫu.
Tiến hành xác định mật độ vi sinh vật bằng phương pháp cấy trải đĩa sau các khoảng thời
gian: 0; 2; 4 giờ.
I.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật thử nghiệm đối với một số vi
khuẩn gây hại như B. subtilis, Salmonella sp. theo phương pháp của Aslim và cộng sự
(2005).
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên tác này
dựa trên khả nắng kháng các vi sinh vật chỉ thị của
hai sản phẩm.
Tiến hành: Dịch sữa của hai sản phẩm sau khi được lên men tiến hành đem ly tâm
4000 rpm, 10 phút để thu dịch nổi bên trên. Các chủng Salmonella sp. và B. subtilis được
nuôi cấy 12 giờ và cấy trải trên các đĩa môi trường NA (25ml/đĩa) với thể tích 20 µL. Sau
đó, sử dụng ống thép đã được vô trùng đục các lỗ đường kính 5 mm trên các đĩa thạch.
Dịch của mẫu được cho vào các lỗ thạch với thể tích 35 µL. Đọc kết quả các đĩa thạch
sau 12 giờ ủ ở 37°C. Khả năng kháng khuẩn của hai sản phẩm được xác định dựa vào
đường kính vịng vơ khuẩn xuất hiện xung quanh lỗ thạch.
I.4. Lợi ích của sữa Yakult
1.4.1. Giúp điều hòa nhu động ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón.
Trong cuộc sống hiện nay, chúng ta rất dễ bị tác động bởi các nhân tố như stress,
dùng kháng sinh, sự lão hóa, sự nhiễm khuẩn hay hóa chất từ thực phẩm, hoặc chế độ ăn


nhiều béo và đạm nhưng ít chất xơ,… gây rối loạn tiêu hóa, ảnh hưởng đến sức khỏe và
chất lượng cuộc sống của chúng ta, mà phổ biến nhất là gây ra các bệnh về đường tiêu
hóa như tiêu chảy, táo bón, hội chứng ruột kích thích, hội chứng ruột ngắn, viêm dạ dày,
thậm chí là ung thư ruột…
Hiện nay, liệu pháp probiotic dùng trong phòng và điều trị các bệnh về đường tiêu

hóa cũng như để tăng cường sức khỏe ngày càng được ứng dụng rộng rãi. Chúng có thể
được dùng dưới dạng thực phẩm như sữa lên men, thức uống hoặc thuốc. Và có thể nói
probiotics được xem là 1 liệu pháp thay thế hiệu quả cho liệu pháp dùng kháng sinh
trong điều trị bệnh hiện nay.
Trong điều kiện in vitro, chủng khuẩn L.casei Shirota đã được chứng minh là kháng
dịch vị acid dạ dày và dịch vị mật nhân tạo. Và trong những thử nghiệm lâm sàng trên
người, kết quả cho thấy rằng khả năng kháng dịch vị tiêu hóa của chủng L.casei Shirota,
sống sót qua hệ tiêu hóa và được bài tiết ra ngồi qua phân [M. Shirota et al 1966 và
Touhy et al 2007]. Sau khi vượt qua hàng rào dịch vị tiêu hóa, chủng
khuẩn L.casei Shirota tiến đến ruột và có những tác động hỗ trợ đối với hệ tiêu hóa cũng
như là tăng cường hệ miễn dịch. Chúng có sự tương tác với thành phần của hệ vi sinh vật
đường ruột, giúp điều hịa và duy trì hệ vi sinh vật đường ruột ở mức cân bằng bằng cách
làm tăng các vi khuẩn có lợi thuộc chi Lactobacilli, Bifidobacteria đồng thời ức chế sự
phát triển của những vi khuẩn gây hại như E.coli, Clostridium, Staphylococus,…[Tanaka
et al 1994, M. Shirota et al 1966], cũng như là tạo ra các sản phẩm trao đổi chất giúp
điều tiết chức năng của ruột. Từ đó giúp cải thiện tình trạng tiêu chảy, táo bón hay các
bệnh lý khác về đường tiêu hóa như viêm dạ dày, hội chứng ruột ngắn, hội chứng ruột
kích thích,...
Trong các bệnh về đường tiêu hóa, thì tiêu chảy là một trong những bệnh lý thường
gặp và phổ biến nhất. Nguyên nhân phổ biến nhất là do sự nhiễm khuẩn gây hại
như E.coli, Vibrio, Shigella,… từ thực phẩm không vệ sinh, chúng làm mất cân bằng hệ
vi sinh vật đường ruột, và tạo điều kiện cho những vi sinh gây hại phát triển tạo độc tố
gây tiêu chảy. Mục tiêu hàng đầu trong điều trị bệnh tiêu chảy là cân bằng hệ vi sinh vật
đường ruột bằng vi khuẩn có lợi probiotics. Chủng khuẩn probiotic L.casei Shirota đã
được ghi nhận có hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy. Trong điều kiện in


vitro, L.casei Shirota cho thấy có hiệu quả ức chế đáng kể sự phát triển các vi khuẩn gây
tiêu chảy như E.coli (ETEC-enterotoxigenic E.coli), Salmonella enteritidis, Shigella
dysenteriae và Vibrio cholerae [Godiosa O. et al. 1993] ).

1.4.2 Giúp duy trì cân bằng lượng khuẩn có lợi và vi khuẩn gây hại có trong đường
ruột.
Hệ tiêu hóa của chúng ta chứa hàng trăm tỉ khuẩn, bao gồm khuẩn có lợi và khuẩn
gây hại. Chúng ta rất dễ bị tác động bởi các nhân tố gây rối loạn hệ đường ruột như là
dùng kháng sinh, chế độ ăn khơng cân bằng, lão hóa, stress, sự nhiễm khuẩn,…Chính
những nhân tố này tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển và chiếm ưu thế
trong ruột, gây ảnh hưởng đến sức khỏe.
Yakult có khả năng duy trì sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột và hỗ trợ ngăn
ngừa các bệnh truyền nhiễm và ung thư. Yakult là một probiotic, nó có chứa hơn 6.5 tỉ
khuẩn có lợi Lactobacillus casei Shirota. Chủng khuẩn L.casei Shirota kháng được dịch
vị tiêu hóa, tiến đến ruột và phát triển trong ruột, và hỗ trợ cho sức khỏe bằng cách: Làm
tăng vi khuẩn có lợi và làm giảm vi khuẩn gây hại, giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột.
1.4.3 Giúp giảm độc tố trong ruột
Ngồi ra L.casei Shirota cịn giúp đào thải các độc tố trong ruột cũng như là giúp
ngăn ngừa và phòng chống ung thư ruột [Miyazaki K. and Takeshi Matsuzaki 2009 và
Ishikawa et al 2005]. Các độc tố gây hại như p-cresol, indican, phenol, ammonia,…từ
thực phẩm hay do các vi sinh vật gây hại tạo ra, nếu không được đào thải ra ngoài sẽ ảnh
hưởng đến sức khỏe, thậm chí nếu tích lũy lâu ngày sẽ gây những rối loạn chức năng của
gan, thận,.. và có thể dẫn đến ung thư.
1.4.4 Giúp tăng cường hệ miễn dịch, phòng chống các bệnh truyền nhiễm và ngăn
ngừa ung thư
Tế bào NK (Natural Killer Cell) được phát hiện vào khoảng năm 1970 từ trong một
quần thể tế bào limpho, nhưng công năng của nó thì nhiều năm sau mới được cơng nhận.


Trong cơ thể có 3 loại tế bào limpho, đó là: tế bào B (chuyên sinh kháng thể, được
hình thành từ lá lách); tế bào T (điều khiển tế bào miễn dịch, sinh trưởng) và tế bào NK
(tế bào miễn dịch tự nhiên, sinh trưởng trong tủy sống). 3 loại tế bào limpho này có 2
loại mọi người đều biết rõ và nó chiếm gần 90% trong tổng số các tế bào limpho

Tỷ lệ tế bào NK không lớn chỉ chiếm 10%- 15% nhưng là loại vũ khí sắc bén nhất
trong các tế bào tự nhiên nhằm loại bỏ các “phần tử phiến loạn”. khi các tế bào NK hoạt
động mạnh thì mắc khối u giảm, điều này đều được đông đảo giới khoa học kiểm chứng.
Nhiều nơi trên thế giới đã triển khai điều trị khối u bằng “Liệu pháp tế bào NK”.
Phương pháp này là rút máu từ cơ thể bệnh nhân và tiến hành các biện pháp kích
thích tế bào NK trong máu đó sau đó bơm nó trở lại cơ thể.
“Liệu pháp tế bào NK” ngăn chặn sự phát triển của khối u một cách hữu hiệu,
chứng minh tăng cường tế bào NK hồn tồn có thể điều trị khối u. Có nghiên cứu liên
quan chứng minh khi một tế bào NK ngã xuống nó có thể tiêu diệt 27 tế bào ung thư.
Năm 1990, phát hiện ra cơ chế nhận biết tế bào ung thư của tế bào NK thông qua
việc phát hiện tế bào khơng có phân tử MHC. Vì thế lý giải tại sao tế bào NK lại gọi là
sát thủ tự nhiên. Khi phát hiện ra phân tử MHC thấp đi là nó sẽ tiến hành các biện pháp
để tiêu diệt tế bào ung thư ngay lập tức chứ không phải đợi đến khi tiếp xúc với tế bào
ung thư mới có thể phát giác ra chúng. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tần suất mắc khối u
có mối quan hệ tỷ lệ nghịch với số lượng tế bào NK. Do đó nâng cao số lượng tế bào NK
trong cơ thể có thể phịng bệnh ung thư.
Hoạt tính tế bào NK có sự thay đổi khi sử dụng Yakult, hoạt tính tăng dần trong khi
sử dụng và khi ngừng sử dụng hệ miễn dịch đã giảm lại như ban đầu, tiếp tục bổ sung lợi
khuẩn để duy trì sức khỏe của hệ miễn dịch.
Acrylamide là độc tố được tạo ra do quá trình chế biến thực phẩm nào đó ở nhiệt độ
cao (chẳng hạn như khoai tây chiên, bánh phồng tôm,…). Theo các chuyên gia nghiên
cứu ghi nhận được thì việc hấp thụ độc tố Acrylamid qua chế độ ăn uống hàng ngày sẽ
gia tăng nguy cơ bị ung thư và có thể gây hại cho hệ thần kinh của chúng ta. Đối với nam
giới, nếu tiêu thụ trong thời gian dài sẽ ảnh hưởng đến các tuyến sinh sản. Tại Việt Nam,
Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng đã từng công bố “nếu chiên khoai tây ở nhiệt độ cao
và trong thời gian dài thì sẽ sinh ra độc tố acrylamide, có nguy cơ gây ung thư” sau khi
phân tích các mẫu khoai tây chiên đang bán tại các cửa hàng thức ăn nhanh và cửa hàng


bán lẻ trên địa bàn Tp.HCM. Vì vậy thật sự rất cần thiết phải có biện pháp mà có thể góp

phần làm giảm hoặc đào thải độc tố arcylamid từ thực phẩm mà chúng ta ăn vào.
Một nghiên cứu gần đây của GS. Serrano Nino vừa được đăng trên tạp chí Journal of
Food Safety hồi đầu tháng 2 về hiệu quả của 14 lợi khuẩn axit lactic có khả năng giúp
đào thải độc tố arcylamide trong điều kiện in vitro, trong đó khuẩn Lactobacillus
casei Shirota trong sữa Yakult là có hiệu quả cao nhất.
Cho đến nay chưa có biện pháp nào hồn tồn có thể loại bỏ acrylamide ra khỏi thực
phẩm. Trong thời gian chờ đợi các nhà khoa học tìm ra liệu pháp hữu hiệu thì việc sử
dụng các thực phẩm chứa lợi khuẩn acid lactic hàng ngày, chẳng hạn như sữa uống lên
men Yakult, là cần thiết và hữu ích, nó khơng chỉ giúp duy trì đường ruột khỏe mạnh mà
cịn góp phần giúp đào thải bớt các độc tố acrylamide, giảm nguy cơ gây ung thư gây ra
từ thực phẩm mà chúng ta ăn vào.

CHƯƠNG II: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SỮA CHUA
2.1. Lịch sử hình thành chủng


Tên "lactobacillus" đề cập đến khả năng của vi khuẩn lên men đường để tạo ra axid
lactic. Tên "casei" là tiếng Latin chỉ pho mát, liên quan đến việc sử dụng các vi khuẩn
trong quá trình làm ra pho mát. Tiến sĩ Nhật Bản Minoru Shirota (1899-1982) có một
phát minh quan trọng vào năm 1930, khi ông làm việc tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật
học của Trường Đại học Hoàng gia Y khoa Kyoto (nay là Đại học Kyoto). Đó là việc
phân lập và ni cấy được một chủng vi khuẩn thuộc loài Lactobacillus casei và về sau
được mang tên là chủng Lactobacillus casei Shirota theo tên của tiến sĩ. Chủng là một
trong khoảng 300 chủng của vi khuẩn mà Tiến sĩ Minoru Shirota, người sáng lập Yakult,
chọn lọc từ nhiều nguồn thực phẩm.
Các chủng được đặt tên Shirota vào năm 1966 nhưng thường được tham khảo trong
các tài liệu khoa học như chủng L.casei YIT 9018.
Năm 1930, vi khuẩn được phân lập bị nhiễm một thể thực khuẩn trong DNA, ảnh
hưởng kiểu hình của sự lây nhiễm này khơng được sản xuất acid lactic trong q trình
lên men.

Để ổn định quá trình sản xuất, một thực khuẩn được loại bỏ dẫn xuaatscuar chủng
gốc được chọn vào năm 1980, được chỉ định YIT 9029, và được kết lắng trong lên men
chọn lọc của International Depositary Authority, Cơ quan khoa học và Công nghệ Nhật
Bản, số đăng ký FERM BP-1366.
Chủng YIT 9029, hiện nay được chỉ định chủng L.Casei Shirota và được sử dụng để
sản xuất các sản phẩm sữa lên men, bao gồm thức uống được bán trên toàn thế giới dưới
tên Yakult.

2.2. Phân loại khoa học:


Giới (regnum): Bacteria
Ngành (phylum): Firmicutes
Lớp (class): Bacilli
Bộ (ordo): Lactobacillales
Họ (familia): Lactobacillaceae
Chi (genus): Lactobacillus
Lồi (species): Lactobacillus casei

Hình 2.1. Vi khuẩn Lactobacillus casei Shirota
2.3. Mô tả và xác định lactobacillus casei Shirota
Lactobacillus casei là một vi khuẩn Gram dương là một chi của việc phân loại rộng
các vi khuẩn axit lactic (LAB). LAB bao gồm một nhóm vi khuẩn liên quan đến chức
năng trao đổi chất thông thường - sản xuất axit lactic là sản phẩm cuối cùng trao đổi
chất chính của q trình chuyển hóa carbohydrate và các đặc điểm sinh lý phổ biến.
LAB là dương tính, khơng bào tử, và catalase âm tính và khơng có cytochromes
(Holzapfel et al. 2001). Chúng là những chất chống oxy hóa ưu việt nhưng có khả năng
chịu lạnh, chịu được axít và lên men nghiêm ngặt. Mặc dù chúng khơng phải là nhóm
phân loại được xác định chặt chẽ, LAB thường được coi là bao gồm các chi
phylogenetically liên quan đến chi, có một số tính năng sinh hóa và sinh thái chung

(Axelsson

1998):

Aerococcus,

Alloicoccus,

Carnobacterium,

Dolosigranulum,

Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenoccus, Vagococcus, và Weissella. Do
những điểm tương đồng trong sinh hóa, sinh lý học và sinh thái của nó, chi
Bifidobacterium thường được coi là LAB, mặc dù nó khơng liên quan đến


phylogenetically (Axelsson 1998). Ngoại trừ một số loài Streptococcus và có thể một số
chủng Enterococcus, hầu hết các chủng LAB được xem là có ít hoặc khơng có tiềm năng
gây bệnh (Donohue và Salminen 1996; Adams 1999). LAB có một lịch sử sử dụng lâu
dài trong thực phẩm lên men và không lên men và đã được ghi nhận về khả năng ức chế
các vi sinh vật khác có khả năng gây bệnh thực phẩm hoặc hư hỏng thực phẩm (Donohue
và Salminen 1996; Adams, 1999). Hơn nữa, một số LAB có mặt khắp nơi như các thành
phần nhỏ trong biểu mơ ruột và đường tiêu hóa của con người ở mọi lứa tuổi. Tất cả
những yếu tố này dẫn đến kết luận hợp lý rằng hầu hết các chủng LAB đều an tồn để sử
dụng trong thực phẩm thơng thường có thể được tiêu thụ bởi tất cả các thành viên của
dân số nói chung.
Lactobacillus là một chi khơng gây bệnh bao gồm hơn một trăm loài. Một báo cáo
của Cơ quan an toàn thực phẩm châu Âu vào tháng 11 năm 2007 (EFSA 2007b) đã xác

định 112 loài, trong khi Bemardeau et al. (2008), viết cùng năm, cho rằng chi có 135 lồi
và 27 phân lồi. Lactobacillus là một chi khơng đồng nhất với nhiều tính chất kiểu hình,
sinh hóa và sinh lý; nó đã được gợi ý rằng sự đa dạng cực đoan của bộ gen Lactobacillus
sẽ biện minh cho sự công nhận của các đơn vị mới subgeneric (Bemardeau et al. 2008).
Lactobacilli có dạng hình que, khơng di chuyển và khơng bào tử. L. casei thường thẳng,
có kích thước khoảng 1 x 3 gm, và được sắp xếp theo dây chuyền. Lactobacilli phát triển
trong điều kiện oxy giảm trong mơi trường sống nơi có nhiều chất dinh dưỡng tồn tại.
Các thành viên của chi có thể là homo- hoặc heterofermentative. Các cựu chuyển đổi
carbohydrate thành axit lactic thông qua các đường glycolytic, trong khi sau này chuyển
đổi carbohydrate bằng cách sử dụng phosphoketolase để sản xuất axit lactic, axit axetic,
và carbon dioxide. L. casei là homofermentative (Cogan 1996). Lactobacilli được sử
dụng trong các ứng dụng thương mại cho quá trình lên men các sản phẩm sữa, trái cây,
rau và thịt (Aguirre và Collins 1993; Gasser 1994). Một số chủng Lactobacillus được tìm
thấy trong đường tiêu hóa của người khỏe mạnh ở mọi lứa tuổi, nơi chúng nằm trong số
các vi khuẩn "bình thường" (Saxelin et al. 1996b; Goldin et al. 1992).
Việc phân loại chi Lactobacillus đã tiến hóa trong vài thập kỷ qua như một số tiến bộ
trong sinh học phân tử, đặc biệt là việc sử dụng phân tích chuỗi gen 16S rDNA, đã cho


phép phân biệt hơn nữa trong các nhóm trước đây được coi là các loài đơn lẻ. Như vậy,
hơn 100 lồi đã được cơng nhận trong khi chỉ có một thập kỷ trước con số này chỉ gần 50
(Axelsson 1998). Bemardeau et al. (2006) quan sát thấy rằng quá trình thay đổi danh
pháp là liên tục và liên tục. Nhóm L. casei, trước đây được coi là một loài duy nhất, là
một trường hợp tại điểm.
2.4. Hình thái học và tăng trưởng
Các tế bào chủng L. casei Shirota có hình que, 0,4-0,6 x 2-3 gm, và xảy ra đơn lẻ,
theo cặp, hoặc trong các chuỗi ngắn bao gồm ba hoặc bốn tế bào. Các chủng có khả năng
phát triển ở nhiệt độ từ 27 ° C đến 43 ° C với tối ưu là 37 ° C. Sau khi tăng trưởng kỵ khí
ở 37 ° C trong 48 giờ, các khuẩn lạc trên thạch thạch Man Rogosa Sharpe (MRS) có
đường kính 2-3 mm, màu be, nhẵn, và trịn với tồn bộ cạnh (mịn). Trong nước canh

MRS, tăng trưởng xảy ra ở 15 ° C nhưng không ở 45 ° C. Trong khi nó có thể phát triển
ở độ pH thấp tới 3,5, độ pH tối ưu của nó là 6,5.
Các chủng là một vi khuẩn axit lactic homofermentative đồng hóa, tạo ra 2 phân tử
axit lactic từ mọi phân tử glucose (mặc dù nó cũng tạo ra một lượng nhỏ acetate, etanol
và diacetyl). Chỉ có L-enantiomer của axit lactic được hình thành. Các chủng là chất
dinh dưỡng cho 12 amino acid, địi hỏi một mơi trường giàu có cho sự phát triển
(Morishita et al 1981).
Xác định GRAS đối với khả năng lên men của chủng L. casei Shirota, axit lactic
được sản xuất từ ribose, adonitol, galactose, D-glucoza, D-fructose, D-mannose, Lsorbose, mannitol, sorbitol, methyl-aD -glucoside, / V-acetylglucosamine, amygdalin,
arbutin, salicin, cellobiose, maltose, lactose, trehalose, turanose, D-lyxose và D-tagatose,
và được sản xuất yếu từ inositol, sucrose, P-gentiobiose, gluconate và 5- keto-gluconate,
nhưng không phải từ glycerol, erythritol, D- hoặc L-arabinose, D- hoặc L-xylose,
methyl-P-xyloside, rhamnose, galactitol, methyl-aD-mannoside, melibiose, inulin,
melezitose, raffinose, tinh bột , glycogen, xylitol, D- hoặc L-fucose, D- hoặc L-arabitol
hoặc 2-keto-gluconate. Aesculin được thủy phân, nhưng dextran không được sản xuất từ
sucrose, amoniac không được sản xuất từ arginine, và nitrat không bị giảm.


2.5. Cơ sở hóa sinh tởng hợp sản phẩm
Q trình lên men sữa chua là do vi khuẩn thuộc nhóm lactic cụ thể là Lactobacillus
casei Shirota phát triển và tích tụ một lượng acid lactic làm giảm pH của môi trường gây
đông tụ casein của sữa và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm.
2.5.1. Cơ chế của quá trình lên men Lactic
Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic ra
làm 2 nhóm: nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình (điển hình) và nhóm vi khuẩn lên
men lactic dị hình (khơng điển hình).
a. Lên men lactic dị hình
Là q trình lên men mà sản phẩm tạo thành ngoài acid lactic cịn có nhiều sản phẩm
khác: 40% acid lactic, 20% acid sucxinic và etanol, 10% acid acetic, 20% các chất khí…
nhóm vi khuẩn này gồm có vi khuẩn như: Bacterium coli, Bac. Aeogenes, Bac.

Pentoacetium, L. brevis, Strep. Votrovorus…
Quá trình này, vi khuẩn lactic dị hình do thiếu hai enzyme chủ yếu của con đường
EMP là aldolase và triozophosphate- isomerase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải
glucose xảy ra theo con đường PP (pentose phosphate).
b. Lên men lactic đồng hình
Là quá trình lên men mà sản phẩm tạo thành là acid lactic, nó chiếm 90-98% sản
phẩm của q trình lên men, sản phẩm phụ là etanol, acid acetic, CO 2, axetoin. Nhóm vi
khuẩn này chủ yếu là hai giống Lactobacterum như: Lactobacterium bungaricum,
L.casei, l.debruckii, l. cucunmeris fermentati…và Streptococcus như: Streptococcus
lactis, Streptococcus cremoris…
Trong trường hợp này acid pyruvic được tạo ra theo sơ đồ Embden- Meyerhoff. Sau
đó acid pyruvic sẽ tạo thành acid 10 actic dưới tác dụng của enzyme lactate
dehydrogenase. Chỉ một lượng nhỏ pyruvic bị khử carbon để tạo thành acid acetic,
ethanol, CO2 và acetone. Ở đây khuẩn Lactobacillus casei Shirota lên men đồng hình.
C6H12O6 → CH3-CO-COOH
lượng
(glucose)
(acid pyruvic)

CH3-CHOH-COOH + Năng
(acid lactic)

(21,8.104 J)


Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có ý nghĩa lớn trong cơng nghiệp vì để đảm bảo
năng lượng cho hoạt động sống, đồng thời cung cấp năng lượng cho sinh trưởng và phát
triển, chúng phải phân giải một lượng lớn đường và tạo thành một lượng đáng kể acid
lactic. Đây là sản phẩm có vai trị trong cơng nghiệp thực phẩm. Là một gia vị đối với
các đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt và siro. Trong ngành sữa, acid lactic được ứng dụng để

tạo các sản phẩm như sữa chua, phomat, và các loại sữa lên men lactic và lên men rượu.

CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH
3.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật


-

Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều

thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (DeMan et al., 1960).
-

Sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước cất, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng

độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa mơi trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để
tạo điều kiện kị khí. Nuôi ở 37oC trong 48h.
-

Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần khiết các khuẩn

lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong).
-

Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng.

-

Quan sát tế bào dưới kính hiển vi.

3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật
3.2.1. Định danh Lactobacillus casei Shirota ở mức độ lồi
3.2.1.1. Trích ly DNA và giải trình tự 16S rRNA
Chuỗi gen 16S rR.NA của chủng L. casei Shirota là 100% giống với chủng L. casei
được chỉ định ATCC 334 và NCDO 151. Ngược lại, mức độ trình tự gen 16S rRNA
tương tự giữa chủng L. casei Shirota và Các chủng L.zeae được chỉ định ATCC 393 và
ATCC 15820, và chủng L. rhamnosus ATCC 7469, lần lượt là 99,23, 99,23 và 98,9%.
Chuỗi gen 16S rRNA đã được đăng ký trong cơ sở dữ liệu ADN công khai với số gia
nhập AB531131.
3.2.1.2. Lai phân tử
Các mức DNA - liên quan DNA giữa chủng L. casei Shirota và L. casei ATCC 334 là
78-84%. Dựa trên những dữ liệu này, chủng L. casei Shirota được phân loại là thuộc loài
L. casei. Ngược lại, sự liên quan giữa chủng L. casei Shirota và chủng loại L. zeae
(ATCC 393) và L. rhamnosus (ATCC 7469) chỉ lần lượt là 17% và 9%. Hàm lượng DNA
G + C của chủng L. casei Shirota và chủng trong nhóm L. casei (ATCC 334, NCDO 151,
ATCC 393, ATCC 15820 và ATCC 7469) là 46,1, 44,2, 45,7, 47,8, 44,9 và 45,7 mol% ,
tương ứng.


3.2.2. Định danh Lactobacillus casei Shirota ở mức độ chủng
3.2.2.1. DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên
Một phương pháp dựa trên PCR đặc biệt đã được phát triển để xác định và định
lượng chủng L. casei Shirota sử dụng một chủng L. casei dạng mồi đặc trưng Shirota
(pLcS) bắt nguồn từ phân tích ADN đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (Fujimoto et al.
2008) . Trong một nghiên cứu cho con người, chủng L. casei Shirota được định lượng
trong phân sau khi ăn chủng bằng PCR định lượng (qPCR) sử dụng pLcS. Khả năng của
phương pháp để xác định chủng phù hợp với một ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng và
phân tích RAPD trong một mẫu đại diện của các khuẩn lạc được nuôi cấy từ phân người.
Sau 14 đối tượng khỏe mạnh ăn 1011 cfu L. casei chủng Shirota hàng ngày trong 7 ngày,
10 9.1 +/-0.5 cfu / g L. casei chủng Shirota được phát hiện bởi qPCR trong các mẫu phân của

tất cả các đối tượng, trong khi 10 8.04+/-0.9 cfu / g được phát hiện bằng phương pháp ni
cấy chọn lọc. Chuỗi L. casei Trình tự DNA đặc trưng của Shirota thu được trong nghiên
cứu này đã được đăng ký trong cơ sở dữ liệu ADN công cộng với số gia nhập AB246299.
3.2.2.2. So sánh DNA trực tiếp
Xác định chủng L. casei Shirota có thể trực tiếp thơng qua trình tự DNA của nó, vì
tồn bộ nhiễm sắc thể được biết (Sato et al. 2004). Mặc dù trình tự cơ bản thực tế của nó
vẫn được giữ kín, nhưng các phần khác nhau của chuỗi gen L. casei đã được công bố.
Các chuỗi ADN này được đăng ký trong cơ sở dữ liệu DNA theo các số gia nhập X02734
(Shimizu-Kadota et al. 1985), AB023773 (Shimizu-Kadota et al. 2000), và AB470649
(Yasuda et al. 2008).
3.2.2.3. Xung điện trường Gel điện di
Trong một nghiên cứu về sự sống còn của chủng L. casei Shirota qua đường tiêu
hóa, được thảo luận chi tiết trong Phần 4.4.2.1.1, Tuohy et al. (2007) cho thấy tính khả
thi của việc sử dụng điện di gel xung để xác định L. casei biến dạng Shirota trong các
chủng L. casei trong phân.
3.2.2.4. Miễn dịch


Yuki et al. (1999) đã thiết lập một phương pháp phát hiện và xác nhận đối với chủng
L. casei Shirota sử dụng một môi trường nuôi cấy cụ thể và các kháng thể đơn dòng đặc
hiệu được nâng lên chống lại chủng này. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong trường
hợp chủng L. casei Shirota phải được phân biệt với các vi khuẩn khác và liệt kê trong
một mẫu phức tạp, chẳng hạn như mẫu phân.
Tóm lại, việc xác định chủng như chủng L. casei Shirota đạt được bằng cách so sánh
mơ hình RAPD và mơ hình PFGE cũng như bằng cách trình tự DNA trực tiếp của các
vùng gen cụ thể. Ngoài ra, việc xác định cũng đạt được bằng cách nuôi cấy chủng với
môi trường thạch chọn lọc, sau đó xác nhận bằng một kháng thể đơn dịng đặc hiệu.
Ngồi ra, Maze et al. (2010) giải mã bộ gen của L. casei biến dạng BL23, xác định kích
thước 3.079.196 cặp cơ sở với hàm lượng G + C là 46,34%. Họ so sánh vật tìm thấy của
họ với thơng tin tuần tự có sẵn cho chủng neotype, ATCC 334 và chủng Shirota, kết luận

rằng 3 chủng "có vẻ rất giống nhau", với hầu hết sự khác biệt do chèn thể tiền thực phẩm
hoặc mã hóa gen để sử dụng carbohydrate. Điều này cung cấp thêm xác nhận về sự suy
đốn của chủng Shirota.
3.3. Phân tích gen
3.3.1. Trình tự Shotgun
Sato et al. (2004) đã xác định toàn bộ chuỗi gen shotgun của L. casei và Shirota và
chuỗi kết quả được chú thích và phân tích cho các gen có thể là mối quan tâm an tồn có
thể xảy ra chủng L. casei. Trình tự DNA chuỗi gen của Shirota dẫn đến khoảng 60.000
lần đọc cho 31 megabases (Mb). Một ước tính trước đây về kích thước bộ gen dựa trên
dữ liệu PFGE là khoảng 3,1 Mb, cho độ bao phủ 10 lần của bộ gen. Lắp ráp các dữ liệu
này tạo ra 120 contigs 3,104,260 cặp base (bp); kích thước trung bình của các contigs là
25.868 bp. Kích thước ước tính cuối cùng của bộ gen là 3.035.755 bp cộng với một
plasmid đơn (pLY101) chứa 66.801 bp. Phân tích này được công bố đầy đủ trong một tạp
chí khoa học Nhật Bản (Sato et al. 2004).
3.3.2. Nghiên cứu bộ Gen và Plasmid
Sato et al. (2004) so sánh bộ gen với chuỗi các chủng Lactobacillus và Lactococcus,
bao gồm L. casei ATCC 334 và L. casei BL23, đều liên quan chặt chẽ đến chủng L. casei
Shirota. Kết quả của phân tích này là danh sách các con đường và quá trình sinh hóa mơ


tả khả năng trao đổi chất cơ bản của chủng L. casei Shirota. Tổng cộng có 2,985 khung
đọc mở (ORF) đã được xác định, bao gồm 2,918 ORF trong bộ gen và 67 ORF trong
plasmid, với các chức năng được gán cho 2,301 (77%) trong số chúng-2,255 trong bộ
gen và 46 trong plasmid. Một chú thích thứ hai về trình tự bộ gen được thực hiện bởi
O'Sullivan (2012) sử dụng dự đoán gen và chức năng chú thích của chương trình
GAMOLA (Altermann và Klaenhammer 2003) và cơ sở dữ liệu BLAST được cập nhật.
Chú thích sau này đã tiết lộ 4,269 gen tiềm năng trong bộ gen, bao gồm các ORF tiềm
năng trong các gen khác và cho phép phân tích tất cả các mẫu chức năng xác định, cũng
như 83 gen tiềm năng trong plasmid.
3.3.3. Kết quả phân tích gen

3.3.3.1. Kháng kháng sinh
Khơng có gen mã hóa cho kháng kháng sinh, cũng khơng phải bất kỳ trình tự cho
thấy tương đồng đáng kể với các gen kháng kháng sinh đã được xác định bởi Sato et al.
(2004) trong bộ gen hoặc plasmid. Mặc dù chủng L. casei Shirota, giống như hầu hết các
lactobacilli, có khả năng kháng với vancomycin, sức đề kháng này không dựa trên di
truyền. Sự vắng mặt của các gen kháng kháng sinh được xác định là phù hợp với những
phát hiện, được thảo luận dưới đây, rằng các chủng là dễ bị hầu hết các kháng sinh và
cho thấy khơng có sức đề kháng rõ ràng ngoại trừ vancomycin. O'Sullivan (2012) đã xác
định được các chất vận chuyển đa kháng thể mã hóa tính kháng với Daunorubicin, một
loại thuốc hóa trị liệu được sử dụng trong điều trị ung thư hơn là thuốc truyền nhiễm, và
với họ neomycin / kanamycin Những gen này rất phổ biến trong các vi khuẩn Gram
dương, bao gồm lactobacilli, và không được liên kết với các thành phần di động. Do đó,
chúng khơng gây rủi ro an tồn.
3.3.3.2. Tổng hợp các amin sinh học
Sự hình thành amin sinh học vi sinh vật xảy ra thơng qua q trình khử amin của các
axit amin. Trong khi đây là một chức năng phổ biến của vi sinh vật, nồng độ cao của
amin sinh học có thể gây ra tác dụng sinh lý không mong muốn. Các amino acid tiền chất
chính và các amin được tạo ra bởi các decarboxylases cụ thể là histidine (histamin),
tyrosine (tyramine), hydroxytryptophane (serotonin), tryptophan (tryptamin), lysin
(cadaverine), ornithine (putrescine) và arginine (spermine / spermidin0). Bộ gen của
chủng L. casei Shirota đã được tìm kiếm cho các gen có thể mã hóa sự sản xuất của bất
kỳ các decarboxylases cụ thể nào.Các chủng có trình tự bộ gen của ornithine


decarboxylase isozyme xúc tác chuyển đổi ornithine thành putrescine. tồn tại ở nhiều
chủng Lactobacillus, ví dụ L. casei BL23, L. casei ATCC 334, L. rhamnosus ATCC
53013, L. rhamnosus GG, L. rhamnosus Lc705, L. salivarius UCC118, L. delbrueckii
ssp. bulgaricus BAA-365 , L. delbruecldi ssp. Bulgaricus ATCC 11842, L. acidophilus
NCFM, L. helveticus CNRZ32, L. helveticus DPC4571, L. gasseri ATCC 33323, L.
johnsonii F19785 và L. johnsonii NCC533). Rõ ràng là việc sở hữu gen này khơng gây

ra mối lo ngại về an tồn.
3.3.3.3. Độc lực / Nhiễm trùng
Genome của chủng L. casei Shirota được kiểm tra về các gen mã hóa liên quan đến
độc lực, bao gồm sản xuất độc tố, màng ngoài hoặc protein phân bào, hemolysin,
enterohemolysin, tế bào xâm nhập và điều chế protein, nội độc tố, protein bề mặt tế bào,
exotoxin, và protein bao gồm. Trong khi phân tích gen đã xác định một số gen mã hóa
protein liên quan đến các protein xâm nhập tế bào đã biết, chẳng hạn như internalin, các
gen này và các protein của chúng được tìm thấy trong một loạt các vi khuẩn khác khơng
có hoạt tính gây bệnh. Một số trong số này là gen bảo vệ chung, mã hóa các protein như
collagen hoặc protein liên kết fibronectin. Một trình tự cho thấy tương đồng với một
hemolysin giả định. Liên quan đến gen này, O'Sullivan (2012) lưu ý rằng, trong khi
hemolysin được coi là yếu tố độc lực, homologs của chúng là phổ biến đối với nhiều
lactobacilli và chức năng thực sự của chúng vẫn chưa được nghiên cứu trong LAB. Như
đã nói ở trên, và như trong Bảng 1, các gen liên quan đến độc lực được tìm thấy trong
chủng L. casei Shirota được phân bố rộng rãi trong lactobacilli mà không có dấu hiệu của
khả năng gây bệnh.

CHƯƠNG IV: PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ TUYỂN CHỌN
LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA
4.1. Khả năng bám dính các tế bào đường ruột
Tác giả

Cơng trình nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu


Lee et al. (2000)

so sánh độ bám dính với

các tế bào Caco-2 và chất
nhầy ruột cũng như quá
trình phân ly của chủng L.
casei
Shirota,
L.
rhamnosus GG, và E. coli
TG1

Các tác giả lưu ý rằng,
"Các quan sát rằng các tế
bào Lactobacillus bám dính
trong đường tiêu hóa đã
dần được thay thế các vi
khuẩn đường ruột nhưng
lactobacilli được sử dụng
không thể phát triển đủ
nhanh để thiết lập nơi mơi
trường sống lâu dài trong
đường tiêu hóa."

Juntunen et al. (2001)

Nghiên cứu độ bám dính
vào chất nhầy ruột của con
người trong ống nghiệm
bằng cách sử dụng chất
nhầy có nguồn gốc từ mẫu
phân từ 20 trẻ bị tiêu chảy
do rotavirus và 10 trẻ khỏe

mạnh.

Một số kết hợp probiotic
xuất hiện để kết quả trong
sự gắn kết tăng cường sự
bám dính.

Lee et al. (2003)

Nghiên cứu độ bám dính
của các tế bào Caco-2 và
chất nhầy ruột của chủng
L. casei Shirota và L.
rhamnosus GG trong cạnh
tranh với 8 chủng E. coli và
Salmonella spp

Các chủng Lactobacillus
được ủ trước, chúng có thể
loại trừ vi khuẩn GI ở một
mức độ nào đó. Mặt khác,
khi các vi khuẩn GI được ủ
đầu tiên, sự dịch chuyển
bởi lactobacilli là một quá
trình cực kỳ chậm được đo
trong nhiều giờ, lâu hơn
thực phẩm hoặc đồ uống
vẫn còn trong ruột non

Lee et al. (2004)

đã đưa ra một cách tiếp cận
khác để đánh giá độ bám
dính của chủng L. casei
Shirota bằng cách đánh giá
khả năng bám dính trong
ruột chuột

Các tác giả kết luận rằng
tốc độ sinh sản của chủng
L. casei Shirota sẽ nhanh
gấp 2 đến 3 lần so với
chúng để đạt được khả
năng bám dính lâu dài.


Nissen et al. (2009)

Các tác giả nghiên cứu độ
bám dính của chủng L.
casei Shirota và 12 chủng
lactobacilli khác và một
chủng
Enterococcus
faecium. L. casei Shirota
Nghiên cứu in vitro sử
thể hiện chính xác độ bám
dụng các tế bào biểu mơ
dính trung bình với các tế
ruột lợn

bào biểu mô ruột lợn, với 6
trong số các chủng so sánh
cho thấy độ bám dính cao
hơn và 6 cho thấy độ bám
dính yếu hơn.

4.2. Khả năng làm giảm chất nhầy

Tác giả

Cơng trình nghiên cứu

O'Brien et al. (1999)

lưu ý rằng tất cả các "vi
khuẩn axit lactic probiotic
đã được đánh giá khơng có
khả năng làm suy giảm
niêm mạc dạ dày."

Bemardeau et al. (2006)

báo cáo rằng một chủng L.
paracasei được thử nghiệm
cho sự suy giảm chất nhầy,
L. paracasei Immunitas
(giống như L. casei chủng
Shirota được coi là L. casei
trước phân loại phân loại
gần đây) không thể làm

như vậy

Kết quả nghiên cứu


4.3. Kháng kháng sinh
Tác giả

Cơng trình nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu

Ammor et al. (2007)

quan
sát
thấy
rằng
"lactobacilli thường nhạy
cảm với penicillin và các
chất ức chế β-lactamase,
nhưng có khả năng chống
oxacillin và cephalosporin
hơn, khả năng chống thấm
của tế bào dường như là cơ
chế kháng chính.

Borriello et al. (2003).

Nhiều chủng lactobacilli bao gồm chủng L. casei

Shirota — có tính kháng
với vancomycin

Mare et al. (2007)

chủng L. casei Shirota
khơng có tính kháng cao
hơn ECOFF dự kiến được
thiết lập cho L. paracasei


→ Trong Bảng 5, tính nhạy cảm này được so sánh với 42 chủng khác của L. casei.
Sự so sánh này cho thấy rõ ràng rằng chủng L. casei Shirota cho thấy khơng có sự
đề kháng hồn tồn với bất kỳ loại kháng sinh nào khác ngoài vancomycin


CHƯƠNG V: QUY TRÌNH SẢN XUẤT LACTOBACILLUS CASEI SHIROTA
5.1 Phương pháp bảo quản giống và chuẩn bị giống gốc
Giống gốc sản xuất chính được bảo quản khoảng hai năm một lần. Khi giống gốc
được bảo quản, sẽ được cấy vào môi trường nuôi cấy lỏng được ủ ở 37 ° C cho đến khi
nuôi cấy đạt đến giai đoạn tĩnh. Môi trường nuôi cấy được chuyển đến môi trường thạch
và ủ lại ở 37 o C cho đến khi nuôi cấy đạt đến pha tĩnh, khi được làm lạnh và bảo quản ở
-20 ° C. Điều này cung cấp nguồn cung cấp dự trữ khoảng 2 năm.
Môi trường nuôi cấy chất lỏng chứa đủ nitơ, cacbon, muối và các chất dinh dưỡng
khác cho sự phát triển của chủng L. casei Shirota.
Môi trường Agar cũng chứa các thành phần tương tự cùng với thạch, và nước dùng
sữa chỉ chứa sữa bột và nước cấp thực phẩm.
Bột đông khô của LcS, trong ống (giống gốc, bảo quản sau 2 năm)→ Nuôi cấy trên
môi trường nuôi cấy chất lỏng→ cấy trên môi trường agar và bảo quản ở -20 aC (Có hiệu
lực trong 2 năm) → Cấy trên môi trường nuôi cấy →cấy vào nước dùng sữa, 3 lần →Sử

dụng cho sản xuất.

5.2 Quy trình sản xuất
5.2.1. Sơ đồ quy trình sản xuất