Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT
STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana B.)

GVHD: TS. LÊ XUÂN TIẾN

TP. HỒ CHÍ MINH – 12/2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

---------Số………/BKDT

Khoa:

Kỹ thuật Hóa Học

Bộ mơn: Kỹ thuật Hóa Hữu Cơ
Họ và tên:
Chuyên ngành: Hóa dược

Lớp: HC13HD

1. Đề tài:
Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt.
2.
−
−
−

Nhiệm vụ:
Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung mơi nước.
Khảo sát quy trình tinh chế dịch chiết cỏ ngọt bằng phương pháp gia vơi.
Khảo sát quy trình tính chế dung dịch thu được sau q trình gia vơi bằng

phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion.
3. Ngày giao nhiệm vụ:
03/2016
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ:
12/2016
5. Giảng viên hướng dẫn:
TS. Lê Xuân Tiến
Luận văn này được thông qua bởi Bộ mơn Hóa hữu cơ - Khoa Kỹ thuật hóa học.
Tp. HCM, ngày tháng

năm 2017

Trưởng bộ mơn Hóa Hữu Cơ

Giáo viên phản biện

Giáo viên hướng dẫn

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

2


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cám ơn đến thầy Lê Xuân Tiến đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến
thức trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn
em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện luận văn tại Phịng thí nghiệm Kỹ thuật Hữu cơ và
Phịng thí nghiệm Hóa dược đã hỗ trợ tơi hồn thành tốt luận văn.
Xin cảm ơn những lời động viên, hỗ trợ từ gia đình và bạn bè.

3


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng, khảo sát quy trình chiết và tinh chế
các hợp chất ngọt steviol glycoside từ cây cỏ ngọt. Quy trình chiết được xây dựng như
sau: trích ly cỏ ngọt với dung môi nước, loại màu sơ bộ dung dịch thu được bằng
phương pháp gia vơi, sau đó tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao
đổi ion. Đây là “phương pháp sạch” để thu các chất ngọt từ cây cỏ ngọt, không sử
dụng các loại dung môi độc hại. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly được

khảo sát bao gồm: dạng ngun liệu, tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết.
Dựa vào hiệu suất chiết và độ hấp thu UV (λ= 210 nm) để đánh giá chọn ra điều kiện
thích hợp ở từng yếu tố khảo sát. Quy trình loại màu bằng phương pháp gia vôi khảo
sát những yếu tố sau: nồng độ dung dịch, khối lượng Ca(OH) 2/khối lượng cao, nhiệt
độ, thời gian gia vôi. Tiếp đến, khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế
steviol glycoside bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion bao gồm: tốc độ dịng
chảy, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch. Sử dụng phương pháp so sánh màu và độ hấp thu
UV (λ= 210 nm) để xác định điều kiện tinh chế thích hợp nhất. Kết quả nghiên cứu chỉ
ra rằng, điều kiện trích ly thích hợp là: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8
g/mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 90 oC, chiết 2 lần với hiệu suất chiết là
37.96%; điều kiện gia vơi thích hợp nhất: nồng độ dung dịch 90 g/mL, khối lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g, nhiệt độ 0 oC, thời gian 10 phút; điều kiện trao đổi
ion tốt nhất: tốc độ dịng chảy 0.5 mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10
mL/mL với hiệu suất quá trình là 12.22%. Hiệu suất tổng tồn bộ q trình chiết và
tinh chế steviol glycoside là 4.64%.

4


ABSTRACT
This study was carried out to develop and investigate the process of extracting and
purifying steviol glycosides from Stevia. The extraction procedure was as follows:
extraction of Stevia with water, preliminary decolorizing of the obtained extraction by
Ca(OH)2, and purification by ion exchange chromatography. This is a "green –
method" for obtaining sweeteners from Stevia, without the use of organic solvents.
The factors influencing the extraction process were investigated including: material
type, solid /liquid ratio, time and temperature of extraction, extraction times. Based on
the extraction efficiency and UV absorption (λ = 210 nm), to determine the
appropriate conditions for each factor. The decolorize process by Ca(OH) 2 investigates
the following factors: solution concentration, Ca(OH) 2 mass/extract mass, temperature

and time of reaction. Next, investigating the factors that affect the purification of
steviol glycoside by ion exchange chromatography, including: flow rate, plastic
volume /extract volume ratio. Use color difference and UV absorption (λ = 210 nm) to
determine the most suitable refining conditions. The results show that the appropriate
extraction conditions are: raw leaf material, solid /liquid ratio 1/8 g/mL for 30 minutes
at temperature 90 °C, with extract efficiency is 37.96%; the most suitable liming
condition: solution concentration 90 g/mL, Ca(OH)2 mass/extract mass 1/1 g/g at
temperature 0 oC for 10 minutes; the best ion exchange condition: flow rate 0.5
mL/min, plastic ratio/extract volume 1/10 mL/mL with process efficiency of 12.22%.
The total extraction and purification efficiency of steviol glycoside was 4.64%.

5


MỤC LỤC

6


DANH MỤC HÌNH ẢNH

7


DANH MỤC BẢNG BIỂU

8


DANH MỤC PHỤ LỤC

9


LỜI MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu cho thấy mối liên hệ tiềm tàng giữa sử dụng đường ngọt và các vấn đề
sức khỏe, bao gồm béo phì và sâu răng. Sử dụng quá mức đường có liên quan
đến bệnh tiểu đường loại 2, béo phì, gia tăng bệnh tim và làm cho các tế bào ung thư
phát triển nhanh hơn. Theo nhiều nghiên cứu, các hợp chất ngọt chiết xuất từ cây cỏ
ngọt có độ ngọt gấp rất nhiều lần so với đường sucrose và rất tốt đối với sức khỏe con
người khi dùng trong một giới hạn cho phép. Hiện nay, trên thế giới đặc biệt là Nhật
bản, Hàn Quốc đã và đang sử dụng các hợp chất ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt này để thay
thế dần cho đường sucrose và đường nhân tạo trong thực phẩm, dược phẩm. Tuy
nhiên, ở Việt Nam cỏ ngọt ít được người dân biết đến do chưa có quy trình chiết xuất
các hợp chất ngọt từ cỏ ngọt nào ứng dụng vào quy mô công nghiệp để sản xuất trong
nước, nếu nhập khẩu thì giá rất cao nên các hợp chất ngọt này chưa được bán nhiều ở
nước ta. Nhìn thấy được điều đó và dựa trên các nghiên cứu, thăm dị về cỏ ngọt, đề tài
nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt hướng định hướng
ứng dụng trong quy mô công nghiệp được đề xuất.

10


CHƯƠNG 1.
1.1.

TỔNG QUAN

Giới thiệu về cỏ ngọt

Tên thường gọi: cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc.
Tên khoa học: Stevia rebaudiana Bertoni
Giới: Plantae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Tơng: Eupatorieae
Chi: Stevia
Lồi: S. rebaudiana

Hình 1.1. Hình ảnh về cỏ ngọt
1.1.1.

Nguồn gốc và phân bố

Cỏ ngọt là cây bụi lâu năm thuộc họ Cúc Asteraceae, có nguồn gốc từ vùng Amambay
và Iguacu thuộc biên giới Brazil và Paraguay [1, 2]. Ngày nay được trồng nhiều ở một số

11


quốc gia trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia, Hoa
Kỳ, Brazil, Argentina, Paraguay, Mexico.
Cây cỏ ngọt bắt đầu được du nhập từ Nam Mỹ vào Việt Nam từ năm 1988 [3] . Hiện nay,
đã có khá nhiều giống cỏ ngọt được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong cả nước,
từ các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hịa
Bình, Hà Nội… cho đến các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc. Tuy nhiên, mới
chỉ có rất ít nghiên cứu về thành phần cỏ ngọt, cũng như dinh dưỡng của lá cỏ ngọt
được trồng tại Việt Nam.
1.1.2.

Mơ tả thực vật

Thân cỏ ngọt có thể cao tới 1 m dạng thân bụi trịn nhiều lơng, mọc thẳng. Cỏ ngọt
phân nhiều nhánh. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển
mạnh. Lá mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có răng cưa. Lá hầu như không
cuống, lá trưởng thành dài 3-4 cm, rộng 0.6-1 cm, có 3 gân song song, lá màu xanh
lục. Cây con gieo từ hạt có 2 lá mầm trịn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá.
Tồn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá. Lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt hơn lá
non ở phía trên cao, lá chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng (vẫn cịn
vị ngọt).
Hoa tự, nhóm dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính. Mỗi hoa đơn
hình chùy có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng
khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có màu vàng sáng, các chỉ
nhị rời cịn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ơ, 1 nỗn, vịi nhụy mảnh chẻ đơi,
các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc khơng
có. Quả và hạt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu sẫm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phơi,
nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp.
Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở
đường kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất
tơi xốp, đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nơng từ 0–30 cm tùy thuộc vào
độ phì nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất[4].

12


Hạt cỏ ngọt có sức sống kém, tỷ lệ nảy mầm thấp nên cần chọn đất màu mỡ, dễ thấm
nước và thốt nước, kín gió và tưới tiêu thuận lợi, được thu hoạch khi đạt độ cao 1m
hoặc hơn[5]. Cỏ ngọt là cây lâu năm, có thể được thu hoạch trong 8 năm mỗi năm 6 lần
thu, khối lượng lá thu được khác nhau từ 15 tới 30 g/cây [6]. Cỏ ngọt chịu được lạnh
không thấp hơn 9 oC. Tốc độ phát triển nhanh nhất ở nhiệt độ 20-24oC[7].

Ở nước ta cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho thu hoạch cao nhất từ tháng 4
đến tháng 11 dương lịch (trừ 3 tháng rét nhất là tháng 12, tháng 1 và tháng 2 ở phía
Bắc). Bởi vậy cỏ ngọt nên được trồng vào tháng 4 đến tháng 9, nhưng để có thu hoạch
cao ngay từ những năm đầu nên trồng vào tháng 4 và 5 Dương lịch, trong điều kiện đất
đai cho phép có thể trồng từ tháng 2-3, nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém và
thu hoạch thấp, chậm.
Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, lượng tiêu thụ cỏ ngọt là rất lớn. Vì vậy, ta cần
quan tâm đến những yếu tố ảnh hưởng đến việc trồng cỏ ngọt để cho năng suất cao,
hàm lượng chất ngọt nhiều. Tác giả Nguyễn Văn Tý và nhiều cộng sự [8] đã có nhiều
nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh
hóa và năng suất cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái. Sau đó cũng chính tác giả
Nguyễn Văn Tý đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acid boric đến sinh trưởng và
hàm lượng stevioside của cây cỏ ngọt trồng trên đất Trung Du Việt Bắc.
1.1.3.

Bảo quản

Phần lá sau khi thu hoạch đem rửa sạch, phơi nắng hoặc sấy thơng gió cho đến khi
khơ. Sau khi phơi 1 – 2 ngày thì tuốt lá và bảo quản lá khô trong túi nilông để tránh
hút ẩm. Bảo quản trong nơi khô mát, hàm lượng nước trong lá khô dưới 10%, tạp chất
dưới 5%
Trong thời kỳ có mưa phải sấy bằng máy hoặc là sấy ở 30 oC trong 24h. Trong q
trình phơi sấy phải đảo nhẹ và khơng xếp lớp.
Để sản phẩm lá khơ có chất lượng cao, cần đảm bảo các đặc điểm cơ bản sau:
− Hình dáng bên ngồi: Lá khơ có 1 phần cành ngọn
− Màu sắc: Nguyên liệu có màu xanh tự nhiên
− Mùi: Có mùi cỏ khơ và mùi thơm đặc trưng của cỏ ngọt.
− Độ ẩm: <12%
13

− Tạp chất: khơng có lá mốc và đen, các tạp chất khác nhỏ hơn 5%[9].
1.1.4.

Thành phần hóa học

Cây cỏ ngọt (chủ yếu là lá) chứa những diterpene glycoside đặc biệt, tạo ra vị ngọt
nhưng không tạo ra hay tạo ra rất ít năng lượng. Steviol glycoside, tên gọi chung cho
các diterpene glycoside ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt, là một hứa hẹn tái tạo những thứ
thực phẩm sống mới trên thị trường thế giới và thực vật không calorie, vị ngọt tự nhiên
có thể được sử dụng như một loại đường thay thế hoặc thay thế cho các chất làm ngọt
nhân tạo [10].
Hiện nay, cỏ ngọt được biết nhiều đến về nồng độ diterpene ngọt cao khoảng 5-20%
khối lượng lá khô [11], khoảng 0.9-1% khối lượng trong hoa[12]. Trong 240 lồi thuộc chi
Stevia, chỉ có lồi rebaudiana và phlebophylla chứa các steviol glycoside

[13]

. Những

hợp chất ngọt trong lá cỏ ngọt là nhóm các dẫn xuất diterpene glycoside, ngày nay đã
ghi nhận hơn 30 chất trong tài liệu khoa học

[14]

. Hợp chất chính trong lá cỏ ngọt là

stevioside (4-13% khối lượng lá khơ), và tiếp theo có nhiều nhất là rebaudioside A (24%). Một số steviol glycoside khác như dulcoside A (0.3%), rebaudioside B, C (1-2%),
D và F và steviolbioside cũng được xác định nhưng nồng độ thấp

[15]

. Các glycoside

tìm thấy chủ yếu trong lá của cây, nồng độ lên đến 15% , tùy thuộc vào giống

[16]

.

Nồng độ của các glycoside ngọt trong lá cỏ ngọt các nguồn khác nhau không giống
nhau, nhiều nghiên cứu [17] cho thấy nồng độ của nó phụ thuộc vào điều kiện phát triển
[18]

, cũng như về việc áp dụng các kỹ thuật nông học hiện đại

[19, 20]

. Đa số các giống cỏ

ngọt đều chứa lượng rebaudioside A ít hơn nhiều so với stevioside

[18]

. Ở Việt Nam đã

có vài nghiên cứu về nồng độ steviol glycoside trong cây cỏ ngọt Việt Nam. Năm
2001, Nguyễn Kim Cẩn và Lê Nguyệt Nga đã định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt
khô là từ 3% đến 6%. Năm 2009, Phạm Thành Lộc và Lê Ngọc Thạch cũng đã xác
được định hàm lượng stevioside trong lá cỏ ngọt khô là 3,38%. Năm 2014, Trương

Hương Lan đã xác định hàm lượng stevioside trong các giống cỏ ngọt của nước ta dao
động từ 2,13% đến 7,72% và rebaudioside A thay đổi từ 2,05% đến 9,32%, trong đó lá
cỏ ngọt S77 của Việt Nam có hàm lượng steviol glycoside lớn nhất 11,53%[21].
Tuy nhiên, cũng có một số cơng bố của các bằng sáng chế nước ngồi cho thấy một số
giống cỏ ngọt có hàm lượng rebaudioside A lớn hơn stevioside. Các giống cỏ ngọt này
14


đã được sử dụng để sản xuất rebaudioside A tinh khiết phục vụ cho chế biến một số
loại thực phẩm phẩm và đồ uống. Chiết xuất tinh khiết lấy từ lá cỏ ngọt và được cung
cấp trên thị trường có chứa chủ yếu là stevioside (> 80%) hoặc rebaudioside A (>
90%) [22].
Tất cả các glycosides diterpene phân lập từ lá cỏ ngọt có cùng khung steviol (Hình 1.)
và chủ yếu khác nhau về gốc carbohydrate (R1 và R2), mono-, di-, và trisaccharide có
chứa glucose (C6H12O6) và / hoặc rhamnose (C6H12O5) và/ hoặc xylose (C5H10O5) tại
các vị trí C13 và C19 [23].

Hình 1.2. Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt

15


Bảng 1.1. Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt. Glc, Xyl, and
Rha tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19].
Hợp chất

R1

R2

Steviol

H

H

Steviolbioside

H

β-Glc-β-Glc(2→1)

Stevioside

β-Glc

β-Glc-β-Glc(2→1)

Rebaudioside A

H

β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)

Rebaudioside B

β-Glc

β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)

Rebaudioside
(Dulcoside B)

C
β-Glc

β-Glc-α- Rha(2→1)
|
β-Glc(3→1)

Rebaudioside D

β-Glc-β-Glc(2→1)

β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)

Rebaudioside E

β-Glc-β-Glc(2→1)

β-Glc-β-Glc(2→1)

Rebaudioside F

β-Glc

β-Glc-β-Xyl(2→1)
|
β-Glc(3→1)

Dulcoside A

β-Glc

β-Glc-α- Rha(2→1)

Tích chất hóa ly
Vị ngọt của steviol glycoside tăng với sự gia tăng số lượng các đơn vị đường gắn với
steviol aglycone. Tuy nhiên, nồng độ của chúng trong nguyên liệu thực vật giảm cùng
một lúc

[24]

. Stevioside tinh khiết thường tạo ra một dư vị đắng đáng kể

[25]

.

Rebaudioside A có thêm một đơn vị glucose so với stevioside, cả độ ngọt và chất

16

lượng của hương vị đều tốt hơn, là chất duy nhất trong cỏ ngọt khơng có dư vị đắng
khi sử dụng [17].
Vị ngọt của bất kỳ hợp chất steviol glycoside đều lớn hơn so với saccharose:
stevioside (250-300 lần), rebaudioside A (250-450 lần); rebaudioside B (300-350 lần);
rebaudioside C (50-120 lần); rebaudioside D (250-450 lần); rebaudioside E (150-300
lần); dulcoside A (50-120 lần); và steviolbioside (100-125 lần). Tính trung bình, vị
ngọt của các hợp chất steviol glycoside lớn 250-300 lần so với đường saccharose.
Bảng 1.2. Tính chất vật lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt[26]
Hợp chất

Số CAS

Khối lượng
phân tử

Nhiệt độ nóng
chảy (oC)

Độ tan trong
nước (%)

Stevioside

57817-89-7

804

196–198

0.13

Rebaudioside A

58543-16-1

966

242–244

0.80

Rebaudioside B

58543-17-2

804

193–195

0.10

Rebaudioside C

63550-99-2

958

215–217

0.21

Rebaudioside D

63279-13-0

1128

283–286

1.00

Rebaudioside E

63279-14-1

966

205–207

1.70

Steviolbioside

41093-60-1

642

188–192

0.03

Dulcoside A

64432-06-0

788

193–195

0.58

Stevioside có độ tan trong nước tương đối thấp và nhiệt độ nóng chảy cao

[27]

. Tuy

nhiên, rebaudioside A lại tan tốt hơn stevioside 6-7 lần trong nước vì nó chứa thêm
một đơn vị glucose. Những phân tử này rất ổn định trong dung dịch nước trên phạm vi
rộng giá trị pH và nhiệt độ

[28, 29]

. Đun nóng trong phạm vi pH 1-10 hơn 2 giờ ở 60oC,

hầu như khơng có bất cứ sự phân hủy stevioside nào diễn ra, phân hủy chỉ nhẹ tới 5%
(pH 2 và 10) ở nhiệt độ 80 oC. Trong điều kiện có tính axit mạnh (pH 1.0) sự phân hủy
của stevioside đã được quan sát mà kết quả tổng phân hủy sau khi ủ ở nhiệt độ 80 oC
trong 2 giờ [28]. Kết quả tương tự đã được báo cáo bởi Buckenhuskers và Omran (1997)
cho thấy rằng stevioside có một nhiệt độ ổn định tuyệt vời ở 100 oC trong 1 giờ ở

khoảng pH 3-9, , khơng bị hóa nâu hay caramen hóa, nhưng phân hủy nhanh chóng

17


xảy ra ở mức độ pH lớn hơn 9 dưới điều kiện tương tự hay nhiệt độ quá 140 oC ở điều
kiện tương tự [17].
Ngồi ra, cỏ ngọt cịn chứa các hợp chất khác như sterol (stigmasterol, sitosterol,
campesteol), flavonoid (Apigenin 4'-O-glucoside, Kampferol 3-O-rhamnoside,
Luteolin

7-O-glucoside,

5,7,3'-Trihydroxy

3,6,4'-trimethoxyflavone),

sterebin,

cosmosiin, chất dễ bốc hơi caryophyllenm spathuienol, chlorophyll A, triterpenoid.
Tannin, carotennoid, protein, xơ, cacbonhydrate, rutin… cũng tìm thấy trong cỏ ngọt
với hàm lượng thấp. Và một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali,
magie, kẽm,mangan,… vitamin A, vitamin B2, vitamin C và axit folic cũng tồn tại
trong cây cỏ ngọt[26].
1.1.5.

Tác dụng dược ly

Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
Nhiều nghiên cứu cho thấy lá cây cỏ và chiết xuất callus có thể là một ứng cử viên lý

tưởng để nghiên cứu sâu hơn về sử dụng của chúng trong việc bảo quản thực phẩm và
dược phẩm do các chất chống oxy hoá và các hoạt động kháng kh̉n[30].
Dịch chiết cỏ ngọt có tính chất ức chế rotavirus [31], chống vi khuẩn Helicobacter
pylori nên được đề nghị đem dùng trị u khối[32]. Phần chiết hay những hoạt chất của cỏ
ngọt có thể dùng để uống giảm hay chữa viêm tế bào [33]. Những người bị bệnh đái
đường không những có thể dùng stevioside mà chất này có khả năng hạ đường trong
máu[34], giảm huyết áp trên chuột [35], trên chó[36]. Cũng ở trên chuột, nó ức chế sự phát
triển ung thư trên da. Cho trộn trong thuốc đánh răng, nó có tác dụng lên vi
khuẩn Streptococcus mutans kết dính lên răng và cấu thành các mảng răng [37-39]. Nó đã
được dùng làm thuốc kích thích tóc mọc[40, 41], khử dioxin trong đất[42, 43]. Lá và cành có
tính chất chống histamin nên có thể dùng để kiềm chế những triệu chứng như ngứa
ngáy, đau đớn[44].
Khả năng kháng oxi hóa
Dịch chiết cỏ ngọt có khả năng kháng oxi hóa cao. Khả năng kháng oxi hóa của dịch
chiết cỏ ngọt được cho là khử các eletron tự do và superoxide [45]. Một nghiên cứu in

18


vitro năm 2009, chỉ ra rằng dịch chiết ethanol lá cỏ ngọt có tiềm năng được sử dụng
như một chất kháng oxi hóa tự nhiên[46].
Độc tính[47]
− Nhiều thí nghiệm tiến hành cho chuột uống stevioside hoặc rebaudioside A tới
liều 2g/kg vẫn khơng thấy biểu hiện độc tính hay những sai lệch về trọng lượng
cơ thể, cũng như các phủ tạng sau 2 tuần theo dõi.
− Những thí nghiệm ở Nhật và Hàn Quốc cho thấy những chỉ tiêu cân nặng, huyết
học, sinh học và xét nghiệm tế bào mô học gan đều tỏ ra bình thường sau 56
ngày cho chuột ăn 0.25 hoặc 0.5g stevioside.
− Độc tính với thận: Năm 1988, Panichkul T. thực nghiệm trên chuột, đã thông
báo stevioside có thể gây độc với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanh

khi cho quá liều, gây bại niệu, natri niệu và làm ức chế sự vận chuyển paraaminohippurate (PAH) trong ống gần thận[48-50].
− Theo GS Ryan Huxtable- đại học University of Arizona, Tuscon - cho biết
stevioside có thể ảnh hưởng đến hoạt động của chức năng sinh dục, như làm
giảm số lượng tinh trùng ở chuột đực, giảm kích thước tinh nang hoặc có thể
dẫn đấn tình trạng vơ sinh.
Nhưng trong những thí nghiệm này người ta đã sử dụng những liều lượng stevioside
khổng lồ, thực tế hằng ngày chúng ta chỉ sử dụng những liều lượng stevioside rất thấp
xa so với những liều lượng đã dùng để thí nghiệm ở trên.
Một số đánh giá an toàn của stevioside và chiết xuất cỏ ngọt đã được thực hiện để xác
định mức độ độc tính, gây đột biến, gây ung thư, độc tính di truyền và các vấn đề sinh
sản, tất cả đều được tìm thấy là âm tính [51-55]. Các kết quả này khẳng định rằng
stevioside và các glycosid khác có trong chiết xuất Stevia có khả năng an tồn đối với
người tiêu dùng và khơng ngụ ý bất kỳ mối nguy hiểm nào về sức khoẻ khi sử dụng
lâu dài.
1.1.6.

Ứng dụng

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết dùng cỏ ngọt như một
loại nước giải khát, cho đến những năm 1960, việc trồng thương mại bắt đầu ở
Paraguay và Nhật Bản, và sau đó ở các nước khác. Stevioside và rebaudioside A là
chất chiết xuất từ lá cỏ ngọt hiện nay được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Hàn Quốc,
19


Trung Quốc, Đông Nam Á và Nam Mỹ, như chất làm ngọt trong nhiều loại thực phẩm.
Kể từ khi có sự chấp thuận của chất làm ngọt Stevia ở Hoa Kỳ bởi FDA và EU năm
2008, lợi ích cơng nghiệp của cỏ ngọt đã tăng lên nhanh chóng[56, 57].
Năm 2008, Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) đã phát hiện và phản
hồi yêu cầu của European Commission về European Food Safety Authority (EFSA) để

đưa ra những quan điểm khoa học về độ an toàn của steviol glycoside, chất ngọt được
sử dụng trong thực phẩm. Sau khi xem xét tất cả các dữ liệu về độ ổn định, các sản
phẩm xuống cấp, q trình trao đổi chất và độc tính, EFSA đã thành lập ADI cho các
hợp chất steviol glycoside có độ tinh khiết ≥95% là 4 mg/kg bw/day. Năm 2009,
JECFA đã sửa đổi cho phép rebaudioside D và F được sử dụng như là một phần của
hỗn hợp steviol glycoside với độ tinh khiết ≥ 95% và điều này đã được EFSA phê
duyệt.
Năm 2008, FDA đã xem xét các dữ liệu về steviol glycoside và tham khảo ý kiến từ
các cơ quan có thẩm quyền như JECFA và Viện hàn lâm khoa học quốc gia đã chấp
nhận hỗn hợp steviol glycoside có độ tinh khiết cao ≥ 95% được sản xuất phù hợp với
FDA Good Manufacturing Practices được sử dụng trong thực phẩm với lượng ADI
như JECFA đưa ra.[58]
Cỏ ngọt được dùng như một loại trà dành cho những người bị tiểu đường, béo phì hay
cao huyết áp. Trong cơng nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt dùng để pha chế làm tăng độ ngọt
mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm. Ngồi ra, cỏ ngọt cịn được dùng trong
dược phẩm, mỹ phẩm như sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da.
1.2.

Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt
1.2.1.

Nghiên cứu trong nước

1.2.1.1.

Phương pháp chiết và tinh chế

Ở Việt Nam chỉ mới đưa ra quy trình chiết và cơ lập stevioside trong phạm vi phịng
thí nghiệm, chưa ứng dụng được vào sản xuất. Đây là quy trình được đưa ra bởi các
tác giả ở Viện dược liệu năm 2006.

Lá cành nhỏ

-

Ethanol 80o, hồi lưu 30 phút, 60OC.

- -KếtNước
tinh lạnh
nóngnhiều- lầnĐun
trong
cách
MeOH
thuỷ
-- --Cơ
Lọc
Khuấy
Lắc
với
BuOH
quay
loại dung môi
ChếStevioside
phẩm
PhaDịch
Dịch
BuOH
Stevioside
Cắn
chiết

sệt
thô Chiết
Pha nước
Pha
Bãnước

(4 lần)

20


-

-

Lọc

Cô quay loại dung môi

-

Lắc với ether dầu hoả

Pha ether dầu

Hình 1.3. Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam[59]
Cỏ ngọt khô được chiết hồi lưu 4 lần mỗi lần 30 phút bằng ethanol 80% ở 60 oC. Tập
trung dịch chiết, cô quay chân không để thu hồi dung môi ethanol cho tới khi dịch cô
đặc hu được cắn. Thêm khoảng 20% nước cất nóng so với lượng dịch ban đầu, tạo
thành dịch sệt. Loại lipid bằng ether dầu hỏa. Dịch sau khi đã loại bỏ lipid đưa đi

chưng cách thủy để tách ether dầu hỏa. Lắc dịch chiết với n-butanol bão hòa nước, cho
đến khi dịch nước khơng cịn stevioside nữa. Cất thu hồi n-butanol và cô đặc. Cuối
cùng, kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được stevioside tinh khiết.
Ưu điểm:
21


− Stevioside thu được tương đối tinh khiết
Nhược điểm:
− Lượng stevioside thu được ít, dễ ngã màu trong khơng khí
− Dung môi sử dụng tinh chế đắt tiền, tương đối độc hại
− Quy trình tốn nhiều thời gian, phức tạp.

22


Theo Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tôn Nữ Liên Hương và đồng nghiệp
đã đưa ra 2 phương pháp chiết tách và tinh chế stevioside từ cỏ ngọt[60].
Bột cỏ ngọt khô
-

Ngâm với nước cất (tỉ lệ 25:30 g:ml)

-

Trong 2 giờ ở 65oC.

-

Lọc bỏ bã

(2 lần)

Dịch chiết
-

Acid

hóa

citric

acid

Cách 2

Cách 1

bằng

-

với

pH=3
- Khuấy 30 phút
- Lọc với celite

Sắc ký cột với silicagel
Hệ giải ly chloroform và

methanol với độ phân
cực tăng dần

Dịch dưới lọc
-

Kiềm hóa bằng Ca(OH)2

-

với pH=10,5
Khuấy 1 giờ ở 50oC

-

Phân đoạn chứa stevioside

Lọc với celite
Trung hịa tới pH=7

Cơ bớt dung mơi
-

Chiết với n-butanol
Pha BuOH
-

Loại hết dung mơi

Rắn

-

Hịa tan trong MeOH nóng

-

Làm lạnh 0-5oC , kết tinh

Tinh thể
Hình 1.4. Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt

23


Chiết cỏ ngọt với nước 2 lần mỗi lần trong 2 giờ ở 65oC. Lọc dịch chiết, đuổi bớt dung
môi còn khoảng 20% dịch so với ban đầu.
Cách 1: Dịch chiết được acid hóa bằng citric acid đến pH gần bằng 3, khuấy nhẹ dung
dịch trong 30 phút. Dung dịch sau khi acid hóa lọc qua cột celite. Dung dịch sau lọc
được kiểm hóa bằng calcium hydroxide tới pH 10.5 ở 50oC, khuấy đều trong 1 giờ.
Lọc dịch qua cột celite. Trung hòa dịch tới pH 7 bằng citric acid. Cô quay dung dịch
loại bớt nước. Chiết lỏng lỏng với n-butanol để loại phần tạp còn lại, thu lấy lớp nbutanol, cơ quay loại hồn tồn dung mơi. Kết tinh trong methanol, làm lạnh 0-5 oC và
để qua đêm, thu lấy tinh thể.
Cách 2: Tiến hành sắc ký cột (SKC), sử dụng chất hấp phụ là silicagel. Giải ly cột sắc
ký lần lượt với các hệ dung môi là những hỗn hợp chloroform và methanol với độ
phân cực tăng dần. Theo dõi quá trình SKC bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với hệ
dung môi giải ly là n–butanol:nước:acid acetic = 4:5:1 (v/v), hiện vết với dung dịch
acid sulfuric:methanol = 1:10 (v/v), sấy bản mỏng ở 110°C trong 2 phút. Thu phân
đoạn cao chứa stevioside và tiếp tục sắc ký cột rồi kết tinh lại trong dung mơi thích
hợp để thu được stevioside tinh khiết.
Kiểm tra độ tinh khiết của stevioside : Dùng SKLM, hệ giải ly: n-butanol:nước:acid

acetic tỉ lệ 4:5:1 (v/v).
Ưu điểm
− Cách 1 dung môi tương đối không độc hại, trừ methanol;
− Quy trình đơn giản, ít tốn thời gian.
Nhược điểm
− Hiệu suất chiết khơng cao;
− Cách 2 khó ứng dụng vào quy mô công nghiệp.
1.2.1.2.

Phương pháp định lượng

Tất cả các bài báo nghiên cứu về thành phần và hàm lượng steviol glycoside trong cỏ
ngọt ở nước ta đều dùng phương pháp định lượng bằng HPLC. Theo bài báo của
Trương Hương Lan và đồng nghiệp, điều kiện chạy HPLC của dịch chiết nước cỏ ngọt
ban đầu như sau[21]:
24


−
−
−
−
−

Cột sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4.6mm, 5µ
Pha động: acetonitrile:nước tỉ lệ 10:30
Tốc độ dòng: 1.5 mL/phút
Nhiệt độ buồng cột: 30oC
Đầu dị: PDA 2996 ở bước sóng 210nm
1.2.2.

Nghiên cứu nước ngồi

1.2.2.1.

Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết và tinh chế các

hợp chất steviol glycoside
Các kỹ thuật được sử dụng để thu được steviol glycoside có thể phân loại vào những
hạng mục khác nhau, như dựa trên chiết dung môi

[61, 62]

, hấp phụ sắc ký

[63-66]

,trao đổi

ion [67-69], kết tủa chọn lọc [70], phương pháp màng [67, 68, 71] và các chất lỏng siêu tới hạn
[72]

.

Hầu hết các quy trình chế biến cỏ ngọt được tiến hành ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Brazil hoặc Paraguay. Quy trình chiết steviol glycoside từ lá cỏ ngọt phổ biến
nhất bao gồm các bước sau:
−
−
−

−

Ngâm lá trong nược ấm/nóng để hịa tan steviol glycoside
Lọc với chất trợ lọc, lấy dịch lọc
Loại dung môi bằng bay hơi chân không
Sử dụng nhựa trao đổi để thu được các phân đoạn steviol glycoside có nồng độ

cao
− Tinh chế trao đổi ion (đôi khi)
− Bay hơi và sấy phun hoặc, ít phổ biến hơn, kết tinh để tạo bột/tinh thể.
Một số chế biến thứ cấp được thực hiện tại Nhật để cải thiện chất lượng hương vị. Quy
trình trên giống với quy trình chiết đường thơ từ mía[26].
Phương pháp chiết dung môi
Dung môi hữu cơ thường được sử dụng để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật, do
tính chọn lọc của chúng đối với các thành phần hữu cơ. Các dung mơi hịa lẫn vào
nước, methanol, chloroform, n-butanol, ethanol và rượu béo đã được sử dụng để chiết
xuất stevioside từ lá cỏ ngọt (Fumio 1980 [73], Jackson và cộng sự, 2006[74]; Pol và
Shigeji 1980[75], Tadaaki 1976[76], Tadashi và Masato 1995[77], Toyoshige và Usei
2002[78]). Stevioside và rebaudioside A được tinh chế thêm bởi quá trình kết tinh và kết
25