Nghiên cứu xây dựng kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi cây giống khoai lang nhật beniazuma

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành đề tài này tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cơ giáo
Th.s Phạm Thị Như Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào đã hướng dẫn tận tình
và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và
hồn thành đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp q báu của các thầy
cơ giáo trong bộ mơn sinh lí – sinh hố, sự tạo điều kiện ủng hộ của cán bộ
phịng thí nghiệm Ni cấy mơ – tế bào thực vật.
Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận
lợi nhất trong quá trình thực hiện đề tài.
Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi những
thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ và bạn bè để đề tài
nghiên cứu của tơi được hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

1


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................6
Chương I: Tổng quan tài liệu............................................................................8
1.1. Tìm hiểu chung về cây khoai lang.................................................................8
1.1.1. Nguồn gốc, phân bố của cây khoai lang............................................8
1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây khoai lang...............................................9
1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây khoai lang...........................................11
1.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống khoai lang bằng cơng nghệ nuôi cấy mô
tế bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam.........................................12
1.2.1. Trên thế giới.....................................................................................13
1.2.2. Ở Việt Nam......................................................................................14
Chương II: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu.....................17
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu..............................................17

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.....................................................................17
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu......................................................................17
2.1.3. Thời gian nghiên cứu......................................................................17
2.2. Nội dung nghiên cứu...................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................17
2.3.1. Quy trình nghiên cứu.......................................................................17
2.3.2. Vật liệu khởi đầu............................................................................18
2.3.3. Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.................................................18
2.3.4. Giai đoạn huấn luyện thích nghi......................................................19
2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................19
Chương III Kết quả nghiên cứu và thảo luận................................................21
3.1. Kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh.............................21
3.2. Kết quả nghiên cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi..................................28
3.3. Một số lưu ý trong quá trình nhân giống khoai lang Nhật Beniazuma.......31
3.3.1. Vô trùng..........................................................................................31
2


3.3.2. Giai đoạn ở phịng thí nghiệm........................................................32
3.3.3. Giai đoạn huấn luyện thích nghi....................................................32
Kết luận và đề nghị...........................................................................................33
A. Kết luận...............................................................................................33
B. Đề nghị................................................................................................33
Tài liệu tham khảo............................................................................................34

3


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHỐ LUẬN

BA

:

Benzyl Adenine

BAP

:

6- benzylamino purin

CT

:

Cơng thức

CT ĐC

:

Cơng thức đối chứng

Chất ĐTST

:

Chất điều tiết sinh trưởng

IAA

:

Axít Indolylacetic

In vitro

:

(điều kiện) nuôi cấy nhân tạo

MS

:

(Môi trường) Marashige & Skoog 1962

mg

:

milligam

NCM – TB

:

Nuôi cấy mô – tế bào

SPFMV

:

Sweetpotato feathery motte virus

α-NAA

:

Naphthylacetic axit

2,4-D

:

4

Dichlorophenory Acetic Acid


DANH MỤC BẢNG SỔ LIỆU, BIỂU ĐỒ, HÌNH VẼ
Bảng 1: Ảnh hưởng của IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra rễ của chồi
khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Bảng 2: Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh trưởng của rễ khoai lang
in vitro (sau 4 tun nuụi cy)
Bảng 3: ảnh hởng của cac giá thể đến sức sống của cây
khoai lang in vitro giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần thích nghi)
Biểu đồ 1 : Ảnh hưởng của IAA đến thời gian ra rễ của chồi khoai lang in
vitro (sau 4 tuần nuôi cấy )

Biểu đồ 2 : Ảnh hưởng của IAA lên sự ra rễ và chiều dài rễ chồi khoai
lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của các giá thể đến sức sống của cây khoai lang in
vitro giai đoạn vườn ươm (sau 4 tuần thích nghi)
Hình 1: Chồi khoai lang in vitro sau 2 tuần ra rễ
Hình 2: Chồi khoai lang in vitro sau 4 tuần ra rễ
Hình 3: Cây khoai lang in vitro trước khi đưa ra vườn ươm
Hình 4: Cây khoai lang in vitro sau 1 tuần thích nghi ngồi vườn ươm
Hình 5: Cây khoai lang in vitro sau 2 tuần thích nghi ngồi vườn ươm
Hình 6: Cây khoai lang in vitro sau 4 tuần thích nghi ngồi vườn ươm

5


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây khoai lang (Ipomoea batatas L), thuộc giới thực vật (Plantea), lớp hai
lá mầm (Magnoliopsida), bộ Cà (Solanales), họ Bìm Bìm (Convolvulaceae), chi
khoai lang (Ipomoea), là 1 trong 5 cây có củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai
mỡ, khoai sọ) được trồng rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như
Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ La Tinh.
Ở Việt Nam, khoai lang là một cây lương thực truyền thống đứng thứ ba
sau lúa, ngô. Khoai lang với thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng thích ứng
rộng, được trồng ở khắp mọi nơi trên cả nước từ Đồng bằng đến miền núi và
Duyên Hải Miền Trung… Khoai lang cịn có thể trồng được ở nhiều vùng sinh
thái và chân đất khác nhau.
Trong số các cây lương thực, cây có củ giữ một vai trị quan trọng trong
sản xuất lương thực ở những nước nông nghiệp nghèo, chậm và đang phát triển
(Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc, 2004). Đặc biệt trong những năm mất mùa hạn
hán hay ở những vùng sản xuất khó khăn, khoai lang là cây chủ lực giải quyết
lương thực và thức ăn gia súc. Tại một số vùng sinh thái có điều kiện đặc biệt

cây khoai lang được xếp ngang hàng thậm chí cịn cao hơn cả lúa và có thể nói
cây khoai lang là cây chủ lực, củ khoai lang được sử dụng khá đa dạng. Theo số
liệu thống kê của Tổ chức Lương Thực và Nông Nghiệp của Liên Hợp Quốc,
trên thế giới 77% khoai lang sử dụng làm lương thực, 13% làm thức ăn gia súc,
3% làm nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau như: luộc để ăn
sáng, làm mứt, làm bánh kẹo, nước giải khát, rượu, làm thuốc, dùng thay thế cho
bột mì để làm bánh bích qui. Phần loại bỏ đi rất ít chiếm 6% (FAO, Horton,
1988) phần thân lá ngọn vừa được sử dụng làm rau xanh cho con người đồng
thời là nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi gia súc.

6


Tuy nhiên năng suất khoai lang còn thấp và bấp bênh do sử dụng giống đã
thoái hóa dẫn đến nguồn giống cây chưa đáp ứng được cả về chất lượng và số
lượng, ít quan tâm đến biện pháp canh tác, sâu bệnh.
Hiện nay giống khoai lang Nhật nổi tiếng về chất lượng cao và thích nghi
trong điều kiện ở Việt Nam và trở thành đối tượng nghiên cứu của thời sự.
Từ thực tế này, vấn đề đặt ra là cần có một hệ thống hồn chỉnh và liên tục
để nhân giống, lưu trữ, phục tráng giống và nhân nhanh giống mới, đảm bảo
hiệu quả, an toàn, đáp ứng yêu cầu sản xuất.
Nuôi cấy mô tế bào in vitro là một công nghệ hiện đại cho phép sản xuất
những cây giống sạch bệnh với quy mô lớn, cung cấp cây giống với số lượng
lớn cho sản xuất trong thời gian ngắn nhất, cây con giống hệt bố mẹ về các đặc
tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng đều lớn, thể hiện tính ưu việt so với các
phương pháp nhân giống truyền thống khác.
Xuất phát từ những vấn đề trên, để tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt là nghiên cứu việc nhân nhanh giống
khoai lang bằng công nghệ in vitro góp phần cung cấp dữ liệu hồn thiện cơng
nghệ nhân nhanh giống khoai lang để có được nguồn giống tốt, đảm bảo cả về

số lượng và chất lượng cho người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng kỹ thuật tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi
cây giống khoai lang Nhật Beniazuma”
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI:
Góp phần hồn thiện quy trình nhân giống cây khoai lang Beniazuma
bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật, phục vụ cho công tác duy trì và
sản xuất giống khoai lang chất lượng cao để cung ứng cho sản xuất.
NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI :
Thử nghiệm và tìm ra điều kiện ni cấy in vitro thích hợp cho các
giai đoạn ra rễ, tạo cây hồn chỉnh và huấn luyện thích nghi đối với giống
khoai lang Beniazuma.
7


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tìm hiểu chung về cây khoai lang.
1.1.1 Nguồn gốc, phân bố của cây khoai lang.
a. Nguồn gốc:
Khoai lang có nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Cơng
Ngun. Dấu tích củ khơ tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca
Canyon thuộc Peru (Engel, 1977). Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của
khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ. Astin (1977) đã giả thuyết có
hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang tại Guatamala và nam Peru. Trong
một số cơng trình khác cũng chỉ ra sự đa dạng loài khoai lang cao nhất ở
Colombia, Equador và nam Peru.[2]
Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám
hiểm tìm ra châu Mỹ năm 1492. Ơng đã đưa nó vào Tây Ban Nha được gọi là
khoai tây Tây Ban Nha, mãi sau này mới gọi là khoai lang.
Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con dường từ Tây Ban Nha giới
thiệu vào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn. Con

đường khác do người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới
Philippines vào khoảng năm 1521, sau đó tiếp tuc đưa đến châu Phi. Khoai lang
được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến năm 1594.
Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha, đưa vào vùng
Combatfami năm 1674. Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615. Khoai lang
được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á.[2]
Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh nam
tạp kỳ” và “Quảng Đơng tân ngữ” của Lê Q Đơn thì khoai lang được du nhập
vào nước ta từ Philippines vào khoảng cuối đời Minh cai trị. Cây được trồng
8


trong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao
2.300m so với mặt nước biển.
b. Phân bố :
- Trên thế giới :
Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong khu vực nhiệt đới và
ôn đới với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó.
Theo thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng tồn thế giới là 127 triệu
tấn. Phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn và diện tích
trồng khoảng 49 000km2 .
Sản lượng lớn nhất trên đầu người tại quốc gia mà khoai lang là lương
thực chính là trong khẩu phần ăn là quần đảo Solomon với 160/kg/người/năm.
Bắc Carolina, bang đứng đầu Mỹ về sản xuất khoai lang, mỗi năm cung
cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm cho quốc gia này.
Mississipi cũng là bang chủ lực trong việc trồng khoai lang, tại đây khoai
lang được trồng trên diện tích khoảng 8.200 mẫu Anh. Khoai lang từ Mississipi
đóng góp khoảng 19 triệu USD vào nền kinh tế bang này và hiện nay có khoảng
150 trang trại ở thành phố này trồng khoai lang.
- Ở nước ta :

Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven
biển. Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứng
mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng trên nhiều loại đất khác nhau. Khoai lang
được trồng nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định.
Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc,
Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long…
1.1.2. Đặc điểm thực vật của cây khoai lang :
* Rễ:
Khoai lang sau khi trồng 3-4 ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khơ hạn
hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các
9


đốt thân dưới đất. Mỗi đốt có khả năng ra rễ 15-20 rễ, nhưng thường chỉ có 5-10
rễ được phân hóa thành rễ dày mới có cơ hội thành củ.[1]
* Thân :
Thân khoai lang có dạng bị hay nửa đứng, thân phổ biến màu xanh, tím
và xanh tím. Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác nhau. Ở mắt đốt mọc ra
rễ phụ.
Độ dài đốt phụ thuộc vào giống. Căn cứ vào độ dài thân chính người ta
chia làm hai loại: loại thân dài khoảng 2-5m, loại ngắn 0,5-1m.Thân phát triển
dài ngắn ngồi yếu tố chính là giống cịn phụ thuộc vào chế độ mưa, loại đất,
phân bón.[1]
* Lá :
Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mặt một lá gồm cuống lá và phiến
lá. Cuống dài 6-20cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên
khoảng khơng gian và có thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng
để lá sử dụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân bò dưới mặt
đất. Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ có năng suất chất xanh cao.
Màu sắc cuống lá do giống qui định. Đa số các giống khoai lang có cuống màu

xanh, một số khác có màu tím nhạt, tím.[1]
* Hoa :
Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngon thân, hoa hình chng có cuống
dài. Hoa mọc chùm hay riêng rẽ. Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt
hồng, bên trong nó có nhiều lơng tơ và tuyến mật hấp dẫn côn trùng. Một hoa
gồm 5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái.[1]
* Quả và hạt :
Quả khoai lang thuộc quả sóc hình trịn màu nâu đen, sau khi thụ tinh một
đến hai tháng thì quả chín và cịn tùy thuộc giống và mùa vụ. Một quả có từ
1đến 4 hạt, hạt có vỏ cứng, dễ bị rụng khi quả chín.[1]
10


Khoai lang Nhật Beniazuma có đặc điểm thực vật về cơ bản cũng giống
các cây khoai lang khác nhưng nó có một số đặc điểm để phân biệt như là:

- Cây thân thảo, dạng dây leo, hình bị lan rộng.
- Thân to mập, ít phân cành, có màu tím.
- Lá hình tim, màu xanh, ngọn và lá non có màu xanh vàng.
- Củ thn dài, nhẵn, vỏ củ có màu tím, ruột màu vàng đậm .
- Khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, thời gian sinh trưởng 105-120 ngày.
- Có chất lượng và sản lượng cao, năng suất củ đạt từ 9-15 tấn/ha, hàm lượng
chất khô từ 27-33% .
1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây khoai lang:
Cây khoai lang có các yêu cầu sau để đem lại năng suất và chất lượng cao nhất:
Nhiệt độ:
Nhiệt độ thích hợp trong quá trình sinh trưởng từ 15-30 0C. Nhiệt độ dưới
100C cây khoai lang ngừng sinh trưởng, dưới 6 0C có thể chết héo. Khi trồng nếu
gặp nhiệt độ 18-200C thì cây bén rễ nhanh. Trong suốt quá trình sinh trưởng,
nhiệt độ ban ngày 20-350C khoai đồng hóa tốt. Thời kỳ phát triển củ, ban ngày trời

nắng ráo, ban đêm trời mát lạnh thì củ ra nhiều, to, hàm lượng tinh bột trong củ
cao.[8]
Nước:
Trong suốt quá trình sinh trưởng, khoai lang cần độ ẩm thích hợp từ 6070%, nếu bị hạn hán hay ngập úng đều ảnh hưởng không tốt đến việc hình
thành, phát triển và làm củ.[8]
Ánh sáng:
Khoai lang là cây cần nhiều ánh sáng. Thời kỳ đầu thích hợp với ánh sáng
dài ngày. Từ khi bắt đầu làm củ thích hợp với ánh sáng ngắn ngày.[8]
Đất trồng:
11


Khoai lang khơng kén đất, thích hợp với đất cát pha, nhẹ dễ thoat nước. Đất
sét nhẹ cũng trồng được khoai nhưng ít củ mặc dù thân, lá phát triển mạnh. Khoai
lang có khả năng chịu đất chua, pH=4,5 – 8 khoai lang đều sinh trưởng bình
thường.
Về dinh dưỡng, khoai lang cần nhiều nhất kali rồi mới đến đạm và lân.
Kali cần nhiều từ khi bắt đầu làm củ; đạm cần nhiều trong thời kỳ phát triển
thân, lá; lân thúc đẩy hình thành tinh bột của củ.[8]
Ngồi các u cầu về ngoại cảnh để cây khoai lang thu được năng suất cao cần
chú ý đến các điều kiện khác nữa như:[8]
Thời vụ: Vụ thu đông trồng cuối tháng 8 đến đầu tháng 9. Vụ xuân hè trồng
sớm để tránh mưa cuối vụ.
Dây giống: Dùng dây bánh tẻ, không bị sâu bệnh; chỉ sử dụng dây đoạn 1 hoặc
2 kể từ đoạn ngọn.
Phân bón (cho 1ha):
10 tấn phân chuồng + 60 kg N + 30 – 40 kg P 2O5 + 90 kg K2O. Lót tồn bộ
phân chuồng và phân lân + 30% N + 20% K2O; thúc lần 1: 50% N + 30% K2O;
thúc lần 2: 20% N + 50% K2O.
Kỹ thuật trồng:

Trồng bằng, nông; mật độ trồng 38.000 - 40.000 khóm/ha.
Chăm sóc :
Lần 1 (sau trồng 20-25 ngày ): xới đất, làm sạch cỏ kết hợp bón thúc lần 1, vun nhẹ.
Lần 2 (sau trồng 40-45 ngày ): xới đất, làm sạch cỏ kết hợp bón thúc lần 2, vun nhẹ.
Thường xuyên giữ đất ẩm, độ ẩm thích hợp khoảng 65-80%, nếu vụ khoai lang
gặp khơ hạn thì cần phải tưới rãnh (cho nước ngập1/2-2/3 luống)
Bấm ngọn khi dây dài 30-40cm :
Khi dây phủ kín luống tiến hành nhấc dây thường xuyên.
Thường xuyên giữ ẩm (65-75%) :
Độ ẩm tối đa đồng ruộng tuỳ từng giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây.
Thu hoạch: Khi cây biểu hiện ngừng sinh trưởng, lá gốc chuyển vàng; củ vỏ
12


nhẵn, ít nhựa. Khi thu hoạch lưu ý hạn chế sây sát vỏ làm giảm chất lượng mẫu
mã sản phẩm.
1.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống khoai lang bằng cơng nghệ nuôi cấy mô
tế bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Phương pháp nhân giống khoai lang bằng công nghệ nuôi cấy in vitro đã
được áp dụng ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Cu Ba, Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
Bản, Mỹ...
Năm 1975, Alconero và cộng sự đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng và xử lí nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng có
kích thước từ 0,4-0,8mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và
auxin (NAA, IAA). Sau thời gian 20-50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mơ
sẹo.[2]
Năm 1988, Anura Hettiarachchi và Sri Lanka, sử dụng môi trường MS bổ
sung auxin (2,4-D), cytokinin (KN, BA), GA3 (0,1 mg/l) để nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng với 2-3 lá mầm được cắt và cấy trên

mơi trường có chất điều hịa sinh trưởng khác nhau, đặt trong phịng ni cấy ở
nhiệt độ 27÷20C, cường độ ánh sáng 2000-3000 lux. Kết quả thí nghiệm cho
thấy 2,4-D (1mg/l) và BA (0,25 mg/l) tạo được cây con tốt hơn. Trường hợp 2,4D và KN ở nồng độ cao tương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo mô sẹo.[2]
Mervat và cộng tác viên (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóng
khoai lang (SPFMV). Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virus
bằng phương pháp dot-ELISA. Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý
nhiệt ở nhiệt độ 420C/ngày (16h chiếu sáng) và 390C /đêm (8h bóng tối) trong
thời gian 3 tuần đầu trước khi tách đỉnh sinh trưởng. Những cây hình thành từ
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA. Kết quả
nghiên cứu cho thấy khơng có cây nào bị nhiễm.[2]
Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hịa sinh trưởng đến sự
ni cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và cộng tác
viên (2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng mơi trường MS có bổ
13


sung 2 mg/l KN và 0,5 mg/l GA3. Và các chồi này hình thành trực tiếp thành cây
mà khơng phát triển thành mô sẹo. Theo tác giả, TDZ và BA làm chồi phát triển
qua mô sẹo nên không dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.[2]
Sự tái sinh chồi khoai lang invitro từ rễ đã được công bố bởi Hwang và
cộng sự (1983), theo nghiên cứu này, đầu tiên các đoạn rễ kích thước 2-3cm
được ni cấy lên mơi trường MS biến đổi có bổ sung nồng độ muối khoáng
cao, 100mg/l meo-inositol, 2mg/l BA, 0,1mg/l NAA, 30mg/l đường và 10g/l
Agar. Sau đó, từ các nốt rễ tạo mơ sẹo và các vùng giống như mô phân sinh để
phát triển thàn chồi.
Mười năm sau, Berlamio (1993) đã thực hiện lại quá trình phát sinh chồi
từ các nốt rễ khoai lang invitro trên giống Beniazuma thông qua nuôi cấy mô lá
trên môi trường MS bổ sung 0,5mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l BA và thu được tần số
tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ.[2]
1.2.2. Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và cơng nghệ NCM-TB nói
riêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều. Việc ứng dụng những
thành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới mẻ,
nhưng giàu tiềm năng phát triển. Tuy nhiên, trong những năm gần đây chúng ta
cũng đã đạt được những thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh các loại
cây như: cà phê, cỏ ngọt, chuối (Trung tâm CNSH), dứa (Viện nghiên cứu dầu
và cây có dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đường (Trung tâm CNSH, Viện
nghiên cứu dầu và cây có dầu, Trung tâm sinh học và cây thực nghiệm)… và đã
mang lại hiệu quả kinh tế cao .[9]
Trên cơ sở ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật, Viện khoa học và công nghệ
Việt Nam đang tiếp tục nghiên cứu để cho ra khoảng 50.000 hom cây giống khoai
lang Nhật Bản sạch bệnh; cây giống khoai lang thuần với tỷ lệ tạp nhiễm giống
thấp dưới 0,1% và đưa ra được quy trình về nhân giống, ứng dụng thuốc trừ sâu
sinh học trong phòng trừ bọ hà khoai lang và kết hợp xây dựng được 2 cơ sở cung
cấp giống thuần khoai lang Nhật Bản và khoai lang cao sản đáp ứng nhu cầu
trồng khoai lang của nông dân tại huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai.
14


Với mục đích đưa các giống khoai lang Nhật chất lượng cao vào trồng tại
Xuân Lộc, Đồng Nai bằng các kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp xử lý
nhiệt để tạo cây khoai lang sạch bệnh; bảo tồn nguồn gen khoai lang tốt bằng
ni cấy mơ từ đó nhân giống khoai lang ra đồng ruộng nhằm nâng cao thu nhập
cho người nông dân, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã triển khai nghiên
cứu đề tài “Áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để sản xuất khoai lang Nhật tại
huyện Xuân Lộc, tỉnh Đồng Nai”. Nhóm nghiên cứu triển khai thực hiện dự án
nhằm đưa các biện pháp kỹ thuật như: kỹ thuật nuôi cấy, kỹ thuật bảo tồn nguồn
gen tốt bằng nuôi cấy mô, quy trình kỹ thuật nhân giống khoai lang ni cấy mơ
ra vườn ươm và đồng ruộng. Hiện dự án đã triển khái thí điểm tại ruộng khoai
của một số hộ nơng dân cho kết quả tốt.

Được biết, giống khoai lang Nhật Bản đã được một số nông dân ở huyện
Xuân Lộc đưa vào trồng từ đầu năm 2008 trên diện tích gần 70 ha, đạt năng suất
12 tấn/ha/vụ, lợi nhuận cao gấp 5 - 6 lần trồng sắn trước đây. Tuy nhiên trong
quá trình trồng, nơng dân lại gặp phải các trở ngại là những giống này bị thoái
hóa, tạp lẫn, khó mua giống cho sản xuất mở rộng và khó duy trì được chất
lượng giống gốc. Kỹ sư Trịnh Việt Nga - Chủ nhiệm nhóm nghiên cứu đề tài cho
biết: “Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào khoai lang sẽ góp phần quản lý
tốt nguồn gen, cung ứng trong một thời gian xác định theo hợp đồng số lượng
cây đúng giống, đồng đều và sạch bệnh để trồng trên quy mô công nghiệp làm
nguồn nguyên liệu chế biến phục vụ tiêu thụ nội địa và xuất khẩu thay vì dùng
phương pháp cũ là đi thu mua cây giống trong dân”.
Ngồi ra cịn có nhiều đề tài nghiên cứu khác nữa như nghiên cứu của
Nguyễn Mỹ Uyên và cộng sự (2006) : “Khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây
khoai lang Ipomoea batatas (L) trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên” và nghiên
cứu của Nguyễn Thị Hoài An (2011) : “Tìm hiểu quy trình nhân giống khoai
lang Nhật từ đốt thân”.
Tại các tỉnh phía Bắc, giống khoai lang Beniazuma đã được Trung tâm
NC&PT Cây có củ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học
15


Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) nghiên cứu trồng thử nghiệm ở một số tỉnh: Hà
Nội, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lào Cai, Thái Bình, Thanh Hoá, Hà Tĩnh… Kết
quả thử nghiệm cho thấy giống khoai lang này có thân lá sinh trưởng phát triển
rất mạnh, chất lượng củ tốt, ăn rất ngon.
Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện KHKTNN, Viện Rau Quả Trung
Ương, Trung Tâm nghiên cứu ứng dụng KH và CN Hải Phịng, Sở KHCN Nam
Định, cơng ty giống cây trồng Trung Ương I, Viện Sinh học Đà Lạt,… mỗi năm
sản xuất hàng triệu cây giống in vitro, củ giống in vitro của các loại cây hoa, cây
khoai tây, cây mía, khoai lang… Tại Đà Lạt từ nhiều năm nay, rất nhiều phịng

ni cấy mơ của tư nhân ra đời, hoạt động rất có hiệu quả và mỗi năm đã cung
cấp một số lượng lớn cây giống in vitro cho vùng sản xuất tại Đà Lạt và các
vùng phụ cận.[9]

16


CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu.
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
Là đoạn chồi invitro khoai lang Nhật Beniazuma chiều dài 5-7 cm, có 2-3 lá.
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu:
- Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh được thực hiện tại phịng thí nghiệm
NCM- TB thực vật thuộc TTTHTN Trường Đại Học Vinh .
- Các nghiên cứu trong giai đoạn huấn luyện thích nghi được tiến hành tại
nhà lưới thuộc TTTHTN Trường Đại Học Vinh.
2.1.3. Thời gian nghiên cứu :
- Đề tài được tiến hành từ tháng 10-2011 đến tháng 04-2012.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của Auxin (IAA) đến quá trình phát sinh hình
thái rễ (giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh).
- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây (giai đoạn
huấn luyện thích nghi cây giống ).
- Theo dõi quá trình phát triển của cây giống.
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Quy trình nhân giống in vitro
Về cơ bản quy trình nhân giống được chia thành 4 giai đoạn [10].
a. Giai đoạn 1: Giai đoạn vào mẫu
Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới tồn bộ quy
trình nhân giống. Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:

- Tỷ lệ chết thấp, tỷ lệ sống cao
- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt.
Một số hoá chất thường dùng HgCl 2, CaOCl2, NaOCl, H2O2... Tuỳ thuộc vào từng
mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thời gian xử lý và hoá chất thích hợp [10].
b. Giai đoạn 2: Giai đoạn nhân nhanh

17


Giai đoạn nhân nhanh được xem là giai đoạn then chốt của cả quá trình
nhân giống in vitro vì mục đích của giai đoạn này là nhằm tạo ra hệ số nhân chồi
in vitro cao nhất. Để tăng hệ số nhân chồi, phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng các chất điều tiết sinh trưởng: Auxin, Xytokinin, Gibberelin,… các hợp
chất tự nhiên kết hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Giai đoạn này kéo
dài trong khoảng 4 – 8 tuần [10].
c. Giai đoạn 3: Giai đoạn ra rễ tạo cây hồn chỉnh
Mơi trường ni cấy thường được bổ sung một lượng nhỏ Auxin vì đây là
nhóm hoocmon thực vật có vai trị sinh lý là tạo rễ bất định cho mơ ni cấy,
trong đó IAA, β-IBA, α-NAA, 2,4-D được sử dụng nhiều nhất. Giai đoạn này
thường kéo dài 2 – 8 tuần [10].
d. Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro, nó quyết định
khả năng ứng dụng của quá trình này vào thực tiễn sản xuất. Thời gian tối thiểu
cho sự thích nghi đó là 2-3 tuần, trong thời gian này cây cần được chăm sóc, bảo
vệ cẩn thận trước những bất lợi như mất nước, nhiễm nấm, vi khuẩn,… Giai đoạn
này cần có giá thể chăm sóc phù hợp. Phải giữ ẩm cho cây, khi đưa ra ngoài vườn
ươm cần phải che chắn để giữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh. Giai đoạn này cần
đảm bảo độ ẩm đất từ 76 – 80% và độ ẩm khơng khí đạt 82 – 85% [10].
2.3.2. Vật liệu khởi đầu :
Vật liệu khởi đầu cho quá trình nghiên cứu là các chồi ni cấy trong ống

nghiệm của các cụm chồi khoai lang Nhật Beniazuma, được sử dụng để tạo cây
hồn chỉnh và huấn luyện thích nghi là những đoạn chồi dài 5-7cm, có 2-3 lá
đồng đều.
2.3.3. Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh:
- Để nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến sự ra rễ của chồi invitro chúng
tôi sử dụng các công thức như sau:
+ CT1 : 0,2mg/l IAA .
+ CT2 : 0,4mg/l IAA .
+ CT3 : 0,6mg/l IAA .
18


+ CT4 : 0,8mg/l IAA .
- Để bổ sung và môi trường nền là (MS +8g/l Agar +30g/l saccaroza
+10% nước dừa +10mg/l than hoạt tính +100mg/l Myo innositol).
Trong đó MS là môi trường nuôi cấy cơ bản, được sử dụng là môi trường
Murashige – Skoog, 1962 [5]
Công thức đối chứng MS không bổ sung IAA.
-Các chỉ tiêu đánh giá là:
+ Số cây ra rễ :
+ Hình thái rễ :
+ Số rễ trung bình/cây (rễ) =
+ Chiều dài trung bình rễ/chồi (cm) =
- Thời gian nghiên cứu của giai đoạn này là 4 tuần.
- Tất cả thí nghiệm nói trên đều được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại,
mỗi lần theo dõi 10 bình, mỗi bình cấy 3-5 chồi, mỗi chồi mang 2 mắt nghủ.
- Điều kiện nuôi cấy cho cả 3 giai đoạn trên là :
+ Nhiệt độ : 23 ± 20C.
+ Độ ẩm : 60-70 %.
+ Ánh sáng : 2000-2500 lux .

+ Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày.
2.3.4. Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Khi các cây khoai lang invitro đạt được những tiêu chuẩn nhất định về
hình thái là mỗi cây có từ 4-6 rễ, chiều dài trung bình của rễ từ 8-11cm, cây
khỏe mập thì có thể đưa ra vườn ươm .
Trong giai đoạn này, chúng tơi bố trí các cây khoai lang in vitro vào trong
các loại giá thể khác nhau trong cùng điều kiện chăm sóc, huấn luyện để nghiên
cứu ảnh hưởng của giá thể khác nhau đến tỷ lệ sống và sức sống của các cây
khoai lang.
Các công thức giá thể được bố trí là :
19


+ CT1 : Cát .
+ CT2 : Đất thịt + trấu hun, tỷ lệ 1:1
+ CT3 : Cát + đất thịt, tỷ lệ 1:1
- Điều kiện huấn luyện :
+ Độ ẩm khơng khí : 80-85%.
+ Độ ẩm giá thể : 65-80%
+ Nhiệt độ : 20-280C
+ Nguồn khoáng bổ sung là dung dịch dinh dưỡng 1/2MS phun lên lá dưới
dạng sương mù .
- Các chỉ tiêu theo dõi :
- Tỷ lệ sống (%) = x 100%.

- Tăng trưởng chiều cao cây (cm):
=
- Số lá mới/cây (lá) =
- Hình thái cây, màu sắc lá.
- Sự phát triển của rễ.

-Thời gian nghiên cứu của giai đoạn này là 4 tuần.
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng toán xác suất thống kê trên phần mềm microsoft
Excel 2007.

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

20


3.1. Kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn
chỉnh.
AA là một loại Auxin có tác dụng kích thích sự hình
thành rễ bất định. Trong giai đoạn này, chúng tôi bố trí các
công thức thí nghiệm bổ sung thêm vi các nồng độ ln
lt l: 0,2 (mg/l); 0,4 ( mg/)l; 0,6 (mg/l); 0,8 (mg/l) vào môi trờng (MS + 8 g/l agar +30 g/l saccaroza + 10% níc dõa + 10mg/l
than ho¹t tÝnh + 100mg/l Myo innositol).
KÕt quả thí nghiệm sau 4 tuần đợc thể hiện ở các b¶ng sau:
Bảng 1: Ảnh hưởng của IAA đến thời gian ra rễ và khả năng ra rễ của
chồi Khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công
thức

Số
chồi cấy
(Chồi)

Ngày bắt đầu
ra rễ
(Ngày)

Số chồi
ra rễ
(Chồi)

Tỷ lệ
ra rễ
(%)

CT ĐC
( 0mg/l IAA )

60

18

40

66,67

CT1
(0,2mg/l IAA)

60

14

60

100

CT2
(0,4mg/l IAA)

60

10

60

100

CT3
(0,6mg/l IAA)

60

7

60

100

CT4
(0,8mg/l IAA)

60

9

60

100

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến thời gian ra rễ của chồi
khoai lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)

21


Kết quả nghiên cứu ở bảng 1 và đồ thị 1 cho thấy :
- Về chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ của các công thức, kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ
có CT ĐC cho tỷ lệ ra rễ thấp nhất sau 4 tuần ni cấy chỉ đạt 66,67%. Cịn các
công thức được bổ sung IAA tỷ lệ ra rễ đều đạt 100%.
- Về thời gian bắt đầu ra rễ của các cơng thức thí nghiệm, chúng tơi thấy
thời gian bắt đầu ra rễ ở các cơng thức có sự sai khác nhau. Cụ thể :
Công thức đối chứng, các chồi khoai lang hình thành rễ đầu tiên sau 18
ngày, thậm chí có những chồi sau 4 tuần ni cấy vẫn khơng hình thành rễ.
Khi bổ sung vào mơi trường nuôi cấy từ 0,2- 0,8 mg/l IAA thời gian ra rễ
của các chồi khoai lang biến động từ 7-14 ngày điều này chứng tỏ sự có mặt của
IAA đã có tác động tới thời gian ra rễ của cây khoai lang invitro, IAA kích thích
ra rễ sớm hơn so với công thức đối chứng.
Qua nghiên cứu chúng tôi thấy nếu bổ sung vào môi trường nồng độ IAA
ở các công thức tăng lần lượt là 0,2mg/l : 0,4mg/l : 0,6mg/l : 0,8mg/l thì số
22


ngày ra rễ tương ứng là 14 : 10 : 7 : 9 (ngày). Đặc biệt khi tăng nồng độ lên đến
0,8mg/l thì số ngày ra rễ khơng giảm mà tăng lên 9 ngày có khi là 13-14 ngày
mới bắt đầu ra rễ. Điều đó chứng tỏ nồng độ IAA trong môi trương quá cao sẽ

ức chế khả năng ra rễ của các chồi khoai lang in vitro.
Trong các công thức được bổ sung IAA, chúng tôi nhận thấy công thức 3
(0,6mg/l IAA) được đánh giá là tối ưu hơn .
Như vậy : Môi trường nền bổ sung 0,6mg/l IAA các chồi khoai lang in
vitro sẽ ra rễ sớm và tỷ lệ ra rễ đạt cao nhất.
Theo dõi khả năng sinh trưởng rễ của chồi khoai lang in vitro (sau 4 tuần ni
cấy) chúng tơi thu được kết quả trình bày ở bảng sau:
Bảng 2 : Ảnh hưởng của IAA đến khả năng sinh trưởng của rễ khoai
lang in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức

CT ĐC
(0mg/l
IAA)
CT 1
(0,2mg/l
IAA)
CT 2
(0,4mg/l
IAA)
CT 3
(0,6mg/l
IAA)
CT 4
(0,8mg/l
IAA)

Số
chồi
cấy

Số
rễ/chồi

Chiều dài Hình thái rễ
rễ/chồi(cm)

60

0,45

1,32

60

2,12

2,67

60

4,00

7,48

60

5,63

11,02

60

4,48

8,46

23

Trắng đục, rễ tù,

Chất
lượng rễ

Yếu

rất ít rễ bên
Trắng đục, rễ tù,

Yếu

ít rễ bên
Trắng, mập, ngắn,

Trung

rễ bên trung bình

bình

Trắng, mập, dài,

Tốt

nhiều rễ bên
Trắng, mập, ngắn,
nhiều rễ bên

Khá


Biểu đồ 2 : Ảnh hưởng của IAA lên sự ra rễ và chiều dài rễ chồi khoai
lang in vitro (sau 4 tun nuụi cy)

Trong các công thức có bổ sung , số rễ hình thành từ
chồi in vitro đều nhiều hơn, cứng và khoẻ hơn so với công thức
đối chứng.
- Công thức 1: Nồng độ 0,2mg/l IAA: chồi in vitro thấp và
yếu, bộ rễ có mu trng c, ngắn, u, đầu rễ tù. XÐt vỊ h×nh
24


thái, cây khoai lang in vitro ở công thức này còi cọc, lá xanh
nhạt hoặc phớt vàng. Điều này, chứng tỏ nồng độ AA trong môi
trờng còn thấp, cha đủ ®Ĩ kÝch thÝch sù ra rƠ cđa chåi khoai
lang in vitro.
- Công thức 2: Nồng độ mg/l IAA cho cõy khe, la xanh, s lợng, chiu di rễ tăng nhng đặc điểm hình thái của rễ khác
nhiều so với công thức 1; số lượng rễ vấn ít, ngắn, đường kính nhỏ nên cơng
thức 2 vẫn chưa tối ưu nhất.
- C«ng thức 3: Nồng độ mg/l IAA cho hiệu quả kích

thích ra rễ tốt hơn so với 3 công thức khác. ở công thức này, rễ
phát triển tơng đối nhanh, cây in vitro cao khe, lá xanh đậm,
dáng cây cứng và đẹp. Tất cả các cây đều phát sinh rễ sớm,
số lợng rễ nhiều, đờng kính rễ to hơn so với các công thức còn
lại; đặc biệt là rễ ít bị đứt gÃy trong quá trình đa cây ra vờn ơm. §iỊu nµy chøng tá, nång độ 0,6mg/l IAA cã hiƯu qu¶ cao
trong viƯc kÝch thÝch chåi in vitro ra rƠ, tạo cây hoàn chỉnh.
- Công thức 4: Sử dụng nồng độ 0,8mg/l IAA cho kết quả là
cây in vitro sinh trưởng chậm, rễ yếu, dễ gãy khi đưa ra vườn ươm. Số
lượng, chiều dài trung bình rễ giảm so với CT3. Nồng độ 0,8mg/l IAA cao
đà ức chế khả năng ra rƠ cđa chåi khoai lang.
Nh vËy, theo chóng t«i, bổ sung 0,6mg/l IAA vào môi trờng nn l thích hỵp nhÊt cho sù ra rƠ cđa chåi khoai lang in
vitro.

25