tìm hiểu hoạt tính của enzim proteza ở vi khuẩn bacillus subtilis

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện đề tài, tơi đã nhận được su giúp đỡ quý báu,
sự chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, gia đình và bạn bè.
Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn
Dương Tuệ, người thầy đã ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q
trình nghiên cứu và hồn thành đề tài này.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn di
truyền – vi sinh – phương pháp giảng dạy, các giáo viên phụ trách, các kĩ
thuật viên phịng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như
sự hướng dẫn giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tơi trong suốt q trinh thực
hiện đề tài.
Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn hộ trỡ, giúp đỡ cho tôi cả về
tinh thần, vật chất lẫn cơng sức để cho tơi hồn thành tốt để tài.
Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian và kinh nghiệm còn hạn
chế nên đề tài khơng tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và hình thức, rất
mong nhận được sự góp ý của các thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài được hoàn
thiện hơn.

1


Mở
đầu
....................................................................................................................................
4.
I. Đặt

vấn

đề

4.
II. Mục

tiêu

5.
III.Nhiệm

vụ

6.
Chương I: Tổng quan tài liệu.
1.1.

Cở

sở

khoa

1.1.1.

Vi

khuẩn

học

7.
Bacillus

subtilis:

7.
1.1.2.

Tổng

1.1.3.

Các

quan

về

enzim

phẩm

enzim

8.
chế

10.
1.1.4. Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp và phương pháp
12.
1.1.5.

Enzim

proteaza

của

vi

sinh

vật

14.
1.1.6.

Sự

phân

giải

protein

15.
1.1.7.

Đặc

tính

và

ứng

16.

2

dụng

của

proteaza


1.2. Tình

hình nghiên cứu trong

nước và trên

thế

giới

17.
1.2.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn và enzim proteaza trong nước
17.
1.2.2.

Tình

hình

nghiên

cứu

trên

thế

giới

19.
Chương II: Đối tượng thời gian và phương pháp nghiên cứu.
2.1.

Đối

tượng,

địa

điểm

và

thời

gian

nghiên

cứu

23.
2.1.1.

Đối

tượng

nghiên

cứu

Địa

điểm

nghiên

cứu

Thời

gian

nghiên

cứu

Phương

pháp

nghiên

cứu

23.
2.1.2.
23.
2.1.3.
23.
2.2
23.
2.2.1.

Phương

pháp

thu

xử

lý

và

Phương

pháp

nuôi

cấy

và

phân

bảo

quản

mẫu

23.
2.2.2.

lập

vi

khuẩn

24.

2.2.3.

Phương

pháp

phân

loại

vi

khuẩn

25.
2.2.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tăng sinh
25.
2.2.5. Phương pháp xá định số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis
27.

3


2.2.6. Phương pháp xác đinh tốc độ tăng trưởng theo Black man
29.
2.2.7.

Phương

pháp

quan

sát

tế

bào

29.
2.2.8.

Phương

pháp

nghiên

cứu

các

u

tố

các

yếu

tố

29.
2.2.9.

Phương

pháp

xác

đinh

30.
2.2.10.

Phương

pháp

xác

đinh

hoạt

tính

31.
2.2.11.

Phương

pháp

phân

lập

32.
Chương III: Kết quả nghiên cứu.
3.1.

Đặc

điểm

chung

của

vi

khuẩn

33.
3.1.1.

Phân

loại

Hình

thái

33.
3.1.2
33.
3.2.

Số

lượng,

vi

khuẩn

cứu

các

Bacillus

subtilis

34.
3.3

Kết

quả

nghiên

yếu

tố

ảnh

hưởng

35.
3.3.1.

Ảnh

hưởng

của

nhiệt

độ

độ

ẩm

35.
3.3.2.

Ảnh

hưởng

38.

4

của


3.3.3.

Ảnh

hưởng

của

PH

40.
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính của
enzim..........................................................................................................................
43.
3.4.1.

Ảnh

hưởng

của

nhiệt

độ

độ

ẩm

43.
3.4.2.

Ảnh

hưởng

của

46.
3.4.3.

Ảnh

gưởng

của

PH

48.
3.5.

Ảnh

hưởng

của

mật

độ

đến

hoạt

thu

nhận

và

tính

của

enzim

sạch

enzim

51.
3.6

Xây

dựng

quy

trình

làm

53.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ:
Kết

luận

56.
Kiến

nghị

56.

5


MỞ ĐẦU
I: ĐẶT VẤN ĐỀ.
Enzim là chất xúc tác sinh học được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực công nghiệp và nền kinh tế quốc dân như:
Công nghiệp thực phẩm, y học, hóa phân tích…
Người ta có thể thu nhận enzim từ nhiều nguồn khác nhau như từ động
vật ,thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên enzim lấy từ động vật, thực vật không ưu
thế bằng enzim vi sinh vật do hoạt tính thấp,xúc tác khơng đa dạng ,khơng
chủ động điều khiển để thu nhận enzim. Vì thế khơng thể dùng làm nguyên
liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzim thõa mãn nhu cầu của
đời sống . Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên
liệu vi sinh vật là dồi dào và hứa hẹn sẽ khắc phục được các hạn chế trên, vì
thực tế dã chứng tỏ được ưu việt của nguồn ngun liệu vi sinh vật (hóa sinh
cơng nghiệp - Lê Ngọc Tú, 2005)
- Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzim .
- Hệ enzim vi sinh vật thì vơ cùng phong phú và đa dạng .
- Hệ enzim vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh .
- Thu enzim từ vi sinh vật có khả năng tăng cường sinh tổng hợp các
enzim nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao .
- Việc nuôi vi sinh vật khá dễ dàng . Từ đó ta thấy rằng việc tách chiết
enzim từ vi sinh vật khá dễ và có ý nghĩa rất lớn .
Mà một trong những vi sinh vật có khả năng cho khối lượng enzim lớn
là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ,trong đó có enzim proteaza .

Proteaza là enzim có rất nhiều ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau
.trong công nghiệp chế biến thịt, công nghiệp sữa ,sản xuất tơ tằm ,trong y
học … nó đã có những đóng góp to lớn trong đời sống con người.

6


Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu ,thu nhận enzim proteaza từ vi
sinh vật còn đang phát triển, đang tìm tịi nghiên cứu về khả năng ứng dụng
vơ vàn của enzim protein .
Cịn ở việt nam đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về việc sử dụng
enzim proteaza nhưng chủ yếu tập trung vào enzim proteaza của động vật
,thực vật cịn enzim proteaza từ vi sinh vật thì chỉ mới được nghiên cứu .Công
nghệ enzim ở nước ta hiện còn đang mới mẻ , đang trong giai đoạn hưởng
ứng và ngày càng hồn thiện ,việc đi sâu vào tìm hiểu enzim proteaza từ vi
sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một vấn đề mang tính thời đại và
cấp thiết .
Xuất phát từ những ưu việt cũng như sự cấp thiết đó của enzim
proteaza được chiết xuất từ vi sinh vật nói chung và từ vi khuẩn Bacillus
subtilis nói riêng nên chúng tơi chọn đề tài: “tìm hiểu hoạt tính của enzim
proteza ở vi khuẩn Bacillus subtilis”.nhằm mong muốn góp phần đưa ra
những điều kiện tối thích cho việc sử dụng nó trong thực tiễn phục vụ đời
sống con người.
II: MỤC TIÊU
Do thấy được vai trò của proteaza được tách chiết từ vi khuẩn Bacillu
subtilis nên chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu:
- Nuôi cấy từ đó phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để có thể
tách chiết dược enzim .
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng,phát triển của vi khuẩn
Bacillus subtilis hướng tới việc điều khiển sự sinh trưởng ,phát triển của vi

khuẩn theo mục đích sử dụng .
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzim proteaza để
đưa ra các điều kiện tối thích nhằm sử dụng enzim trong cộng nghiệp.
- Nắm được quy trình tách triết enzim từ vi khuẩn để sử dụng enzim
trong thực tiễn.

7


- Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng làm quen với phương pháp
nghiên cứu khoa học.
III: NHIỆM VỤ
Để đạt được mục tiêu trên thì nhiệm vụ của đề tài gồm:
- Thu thập, xử lý, bảo quản mẫu
- Pha chế môi trường nuôi cây, nuôi và phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis.
- Nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn
Bacillus subtilis
- Làm thí nghiệm về ảnh hưởng của một số điều kiện lên hoạt tính của
enzim, từ đó đưa ra điều kiện tối thích cho hoạt tính của enzim proteaza gồm:
nhiệt độ, pH,độ ẩm (RH)
- Nghiên cứu tác xúc tác của enzim proteaza.
- Xây dựng được quy trình sản xuất enzim proteaza từ vi sinh vật .

8


Chơng 1: Tổng quan tài liệu
1.1 Cơ sở khoa học:
1.1.1

Vi khuÈn Bacillus subtilis:

Vi khuÈn Bacillus subtilis thuéc lo¹i trùc khuÈn (Bacillus)
là vi khuẩn có dạng hình que, nhuộm Gram dơng, cã kÝch thíc 0,5-1*1-4 µm, cã bµo tư, sèng hiÕu khí hoặc kị khí không
bắt buộc. Chúng sinh bào tử gần nh hình cầu để tồn tại
trong trạng thái ngủ đông. Bacillus subtilis là loại vi khuẩn
nổi tiếng làm hỏng thức ăn, bào t của nó có thể sống sót
trong độ nóng cùng cực thờng thấy khi nấu thức ăn và đây
chính là tác nhân làm h hỏng bánh mì [2]. Hệ enzim của
Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm: Proteaza,
Amylaza, Glucoamylaza, Glucanaza, Celluloza, Dextranaza,
Pectinaza [21].
Quan sát dới hính hiển vi Bacillus subtilis đơn lẻ có dạng
hình que ,phần lớn những chiếc que này có bào tử hình
oval có khuynh hớng phình ra một đầu. Thờng khi quan sát
thấy tập đoàn của vi khuẩn này rất rộng lớn, có hình dạng
bất định.
Bacillus subtilis không phải là tác nhân gây bệnh cho
con ngời, nó có thế gây ô nhiễm thực phẩm nhng hiếm khi
gây ngộ độc thực phẩm, có thể sinh ra enzim phân giải
protein subtilisin. Là loài sống phổ biến nhất đợc thấy nhiều
trong môi trờng đất và trên bụi cây rậm. Chúng có khả năng
phân giải các hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn d thừa và
phế thải nhờ có khả năng tổng hợp các enzim phân huỷ các
hợp chất hữu cơ nh :Poteaza, Emylaza Chúng còn có khả

9

năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lợng vi sinh
vật gây bệnh phát triển quá mức nh: Vibrio, Aeromonas.
Vi khuẩn Bacillus subtilis đà đợc ứng dụng khá nhiều
trong các nghành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản
xuất enzim nh Proteaza, Amylaza,..[2]. ĐÃ có nhiều công trình
nghiên cøu vỊ øng dơng cđa Bacillus subtilis trong chÕ biÕn
thùc phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thc [3].
1.1.2 Tỉng quan vỊ enzim:
1.1.2.1 Giíi thiƯu chung vỊ enzim:
Nhóm enzim Proteaza xúc tác quá trình thủy phân liên
kết peptid (-CO-CH-)n trong phân tử protein, polypeptid đến
sản phẩm cuối cùng là các axitamim.
Ngoài ra protein cũng có khả năng thủy phân liên kết
este và vận chuyển axitamin.
HN2 - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - COOH +H2O
R1

R2

Rx

H2N - CH - COOH + H2N - CH - CO…NH - CH - COOH
R1

R2

Rx

Proteaza cÇn thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về
chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đợc

phân bố rỗng rÃi trên nhiều đối tợng tõ sinh vËt ®Õn ®éng
vËt, thùc vËt. So víi proteaza động vật và thực vật thì
proteaza của vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trớc
hết proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzim rất giống nhau về cấu trúc, khối lợng và
hình dạng phân tử nên rất khó tách ra đợc dạng tinh khiÕt.

10


Cũng do phức hệ gồm nhiều enzim khác nhau nên
proteaza vi sinh vật thờng có tính đặc hiệu rỗng rÃi cho sản
phẩm thủy phân triệt để.

1.1.2.2 Phân loại enzim proteaza:
Proteaza đợc chia thành hai loại: endopeptidaza và
exopeptidaza:

Peptidaza
(proteaza)

Exopeptida
za

aminopeptid
aza

Carboxype
ptidaza

Endopeptida
za

Serine
proteaza

Cystein
proteaza

Aspartic
proteaza

Metallo
proteaza

- Dựa vào vị trí tác động lên chuỗi polypeptide,
exopeptidaza đợc phân thành hai lo¹i :

11


+ Aminopeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide ở
đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra mét
aminoaxid, mét dipeptide hc mét tripeptide .
+ Carboxypeptidaza : xúc tác thủy phân liên kết peptide
ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một
aminoaxit hoặc một dipeptide.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza
đợc chia thành 4 nhóm:
+ Nhóm serinproteaza: là những proteaza có nhóm -OH

của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc
biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzim.
+ Nhóm cysteinproteaza : là các proteaza co nhóm -SH
trong trung tâm hoạt động.
+ Nhóm aspartic proteaza : hầu hết các aspartic
proreaza thuộc nhóm pepsin.
+ Nhóm metallo proteaza; là nhóm enzim đợc tìm thấy
ở vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn.
1.1.3 Các chÕ phÈm enzim:
Trong ®êi sèng cđa thÕ giíi vi sinh vật luôn xảy ra các
phản ứng hoá sinh chuyển hoá vật chất, các phản ứng này đợc thực hiện nhờ sự có mặt của hệ enzim (hay còn gọi là
fecment).
Enzim là những protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai
trò là chất xúc tác sinh học. Dới tác dụng của enzim các phản
ứng hoá sinh trong cơ thể xảy ra rất nhanh mà không cần
cac điều kiện nhiệt độ, áp suất cao,nồng độ axit hay kiềm
đậm đặc. Tên enzim bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: enzim (có

12


nghĩa là

chất trong men). Fecment bắt nguồn từ chữ

LaTinh fermentum (nghĩa là sủi bọt). Tất cả những quá
trình biến đổi hoá sinh đều xảy ra dới tác dụng của hệ
men.
Tất cả các enzim có thể xếp thành hai nhóm theo thành
phần cấu tạo: đơn cấu tử và hai cấu tử. Nhóm đơn cấu tử là

những enzim với protein thuần tuý, phần lớn các enzim có
thành phần cấu tạo phức tạp gồm hai cấu tử: phần protein gọi
là apoenzim, phần không phải protein gọi là coenzim.
Tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật có chứa nhiều
loại enzim . Vì vậy có thể dùng những tế bào hoặc các mô
của chúng làm nguồn sản xuất enzim.trớc kia ngời ta sản xuất
enzim từ động vật và thực vật với số lợng khá lớn (hàng chục
vạn tấn/năm) song trong cơ thể động vật và thực vật quá
trình sinh tổng hợp enzim gắn liền với sự trao đổi chất của
tế bào, số lợng enzim cần tổng hợp gắn liền với yêu cầu sống
của cơ thể, hơn nũa các bộ phận cơ thể có số lợng enzim
không đồng nhất. Vì vậy chỉ có một số bộ phận cơ thể
dùng để sản xuất enzim đợc, muốn thu đợc enzim cần phải
phá bỏ các tổ chức ®Ĩ chiÕt rót. Nh vËy viƯc dïng ®éng vËt,
thùc vËt làm nguyên liệu để sản xuất enzim là rất hạn chế
và không kinh tế, không thể đáp ứng đợc nhu cầu ngày càng
cao về enzim.
Tế bào vi sinh vật có chứa rất nhiều enzim. Trong quá
trình nuôi cấy vi sinh vật các enzim đợc tạo thành trong tế
bào gọi là enzim nội bào và ở vi sinh vật còn tiết vào môi trờng enzim ngoài tế bào phân huỷ cơ chÊt gióp tÕ bµo dƠ

13


đồng hoá. Vi sinh vật là một nguồn sản xuất enzim tơng đối
lý tởng, nó có nhiều u việt so với nguồn động vật và thực vật:
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh, có thể thu đợc khối lợng lớn tế bào trong một thời gian ngắn (từ 6-8h đến
20-30h). Đặc biệt ở vi khuẩn chỉ 20 60 phút/thế hệ nên
sản sinh ra một lợng enzim vô cùng lớn.
Các enzim của vi sinh vật có hoạt tÝnh cao. Trong 24h cã

nh÷ng vi sinh vËt cã thĨ chuyển hoá một lợng thức ăn gấp 3040 lần so với trọng lợng cơ thể của chúng.
Nguồn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thờng là
rẻ tiền: BÃ thải của công nghiệp, chế biến lơng thực, thực
phẩm, nguyên liệu tự nhiên (dầu mỏ, khí đốt...).
Có thể điều khiển các điều kiện tối u trong quá trình
nuôi cấy để có thể thu đợc hiệu suất cao trong quá trình
sản xuất.
Trong khoảng 50 năm gần đây các chế phẩm enzim từ
vi sinh vật đà dần dần thay thế các chế phẩm enzim từ động
vật và thực vật.
Cho đến nay, nhất là trong vòng vài chục năm gần
đây, nền công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzim đà có
những bớc tiến khổng lồ với tiến độ phát triển khá mạnh mẽ.
Số lợng enzim đợc sản xuất ngày càng tăng, các phơng
pháp tách tinh chế ngày càng đợc hoàn thiện và hợp lý hoá,
lĩnh vực ứng dụng các chế phẩm enzim ngày càng đợc mở
rộng. Sản lợng hàng năm tới vài trăm ngàn tấn chế phẩm và
đợc sử dụng trong hơn 30 ngành khác nhau: Công nghiệp thc

14


phẩm, thuộc da, dệt, y học...trong số các enzim đợc sản xuất
thì số lợng các chế phẩm proteaza và emylaza là cao nhất.
Hiện nay thì có rất nhiều công trình nghiên cứu về các
enzim. Các nghiên cứu nhằm theo hớng tách, tinh sạch enzim,
tạo ra các chế phẩm có độ tinh sạch khác nhau, nghiên cứu
cấu trúc, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của
enzim, khả năng ứng dụng của enzim trong thực tế.
Các nghiên cứu bao gồm:

- Nghiên cứu về công nghệ enzim đà đợc tiến hành bởi
nhiều tác giả: sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất
pancreaza, pepsin, tripsin.
- Nghiên cứu về sử dụng nấm men để sản xuất
amylaza.
- Ã có những thử nghiệm công nghệ nh sản xuất
aminoacid từ nhộng tằm bằng proteaza, bột protein thịt bằng
bromelain từ quả dứa.
- Trong y dợc : nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzim
nhằm tạo ra một số thuốc dùng điều trị một số bệnh, đặc
biệt là tạo ra một số sản phẩm thuốc chống suy dinh dỡng ở
trẻ em [25].
1.1.4 Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp và phơng pháp thu c¸c chÕ phÈm enzim tõ vi sinh vËt:
1.1.4.1 C¸c loại enzim vi sinh vật:
Các vi sinh vật đợc dùng ®Ĩ s¶n xt enzim gåm cã vi
khn, nÊm mèc, nÊm men và xạ khuẩn. Các enzim này đà đợc ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.

15


Những enzim đó chủ yếu là enzim thuỷ phân nh: Amylaza,
proteaza, pectinaza, xenluloza...
Amylaza tõ nÊm mèc: NhiỊu lo¹i nÊm cã khả năng sinh
amylaza, có khả năng phân huỷ tinh bột.
Amylaza vi khuẩn: Một số vi khuẩn có khả năng sinh
enzim amylaza
Proteaza: Là nhóm enzim thuỷ phân các liên kết peptit,
đợc s¶n xuÊt tõ cac vi sinh vËt nh: Vi khuÈn, nấm, xạ khuẩn.
Pectinaza: Đây là nhóm thuỷ phân pectin, sản phẩm tạo
thành là axit galacturonic, glucoza, galactoza

Xitolaza: Trong thiên nhiên không gặp xeluloza ở dạng
tinh khiết, nó thờng tồn tại ở dạng kết hợp với các chất khác nh: Hemyxelulo, pentoza, ligninvi sinh vật đặc biệt là nấm
mốc,vi khuẩn sản sinh ra hƯ enzim cã ho¹t lùc cao cã thĨ
thủ phân các hợp chất này.
Invectaza: Là một enzim phổ biến trong nhiều động
vật, thực vật và vi sinh vật, nấm mốc, nấm men có khả năng
tạo thành enzim hoạt động .
Enzim oxy ho¸: Glucozooxydaza-Catadaza la enzim oxy
ho¸ khư, chØ t¸c dụng lên D-glucoza khi có mặt oxy, nó oxy
hoá glucoza thành gluconic và H2O.
1.1.4.2 Sinh tổng hợp enzim vi sinh vật:
Cơ chế sinh tổng hợp

enzim:(công nghệ hoá sinh-Lê

Ngọc Tú, 2005)
Quá trình sinh tổng hợp enzim là một quá trình rất
phức tạp, gắn liền mật thiêt với cấu trúc tế bào và đợc tiến

16


hành qua nhiều giai đoạn với sự tham gia của nhiều hệ enzim
và các axit nucleic khác nhau.
Theo thuyết khuôn và dựa trên những quan điểm hiện
đại có thể chia quá trình này làm 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Hoạt hoá axit amin.
- Giai đoạn 2: Vận chuyển axit amin đà đợc hoạt hoá
đến ribôxom là địa điểm tổng hợp protein mạnh mẽ nhất
của tế bào.

- Giai đoạn 3: Xếp đặt và phối tác các axtit amin đà đợc hoạt hoá theo một trật tự đà cho trên ARN thông tin và
hình thành liên kết peptit.
- Giai đoạn 4: Giải phóng mạch polypeptit đà đợc tổng
hợp và thiết lập cấu trúc không gian của phân tử enzim trong
không gian 3 chiều.
1.1.4.3 Phơng pháp thu các chế phẩm enzim từ vi
sinh vật (công nghệ vi sinh vật- Nguyễn Dơng Tuệ, 2005)
Công nghệ sản xuất enzim hiện nay trên thế giới đà áp
dụng hai phơng pháp: Nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm .
- Phơng pháp nuôi cấy bề mặt: Trong phơng pháp này
vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trờng rắn hoặc lỏng, môi trờng rắn trớc khi nuôi cấy vi sinh vật cần làm ẩm, thờng dùng
cám, gạo, ngô, bà bia...hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này.
+ Ưu điểm của phơng pháp này là: Nồng độ enzim tạo
thành của môi trờng rắn cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi
cấy theo phơng pháp chìm sâu khi dễ tách tế bào vi sinh
vật. Nuôi bề mặt dễ dàng sấy khô và ít bị tổn hao hoạt
tính enzim.

17


+ Phơng pháp nuôi cấy này không cần các thiết bị
phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng nuôi giữ ở
nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, quá trình sản xuất ít tiêu hao
năng lợng.
+ Phơng pháp này đợc nuôi cấy trong điều kiện vô
trùng không tuyệt đối.
- Phơng pháp nuôi cấy chìm: Nuôi cấy vi sinh vật theo
phơng pháp chìm ở quy mô công nghiệp đợc thực hiện
trong các thùng lên men Biorcactor có khuấy và thổi khí liên

tục. Trong nhiều phơng pháp nuôi cấy chìm nguồn cacbon
thờng là tinh bột, các loại bột khác nhau, đôi khi còn dùng các
nguyên liệu khác nữa.
Trong phơng pháp nuôi cấy chìm tất cả các quy trình
phải đợc tiến hành trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt.
Tuy nhiên phơng pháp này xét về mặt kỹ thuật thì hiện đại
hơn vì dễ dàng cơ khí hoá và tự động hoá cũng nh chuyển
sang quy mô sản xuất lớn rất dễ dàng và đơn giản.
1.1.5 Enzim proteaza của vi sinh vật (công nghệ vi
sinh vËt – Ngun D¬ng T, 2005).
NhiỊu vi sinh vËt có khả năng tạo thành enzim proteaza
nh vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn.
Vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành proteaza có hoạt tính
cao ở môi trờng có tinh bột. Nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8
đến 2% thì hoạt lực proteaza giảm vài lần. Với vi khuẩn sinh
proteaza ngời ta còn dùng các đờng mônô hoặc dixaccarit
trong môi trêng dinh dìng.

18


Nhiều xạ khuẩn a nhiệt trong đó có Micromonospora
vulgaris 42 mọc tốt và sinh tổng proteaza cao ở môi trờng có
tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 đến 1,5% sinh khối
cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzim. Nếu tăng
nồng độ hơn nữa sẽ không thu đợc kết quả dơng tính.
Một

số

chủng

Ps.seruginosa

có

thể

đồng

hoá

hidrocacbua và sinh ra proteaza.
Nhiều

loài

nấm

mốc

khác

nhau

(Asp.oryzae,

Asp.awamory, Asp niger). Trên môi trờng có các nguồn nitơ
hữu cơ sinh tổng hợp proteaza axit cao. Trên môi trờng MPA
NaNO3 đợc thay bằng cazêin hoạt lực của proteaza của nấm

mốc đợc tăng lên 3,5 lần. Còn khi thay tinh bột bằng glucoza
và bổ sung pepton hoạt lực enzim tăng lên 6 lần. Nhiều kết
quả nghiên cứu chỉ thấy sinh tổng hợp enzim đợc nâng cao
khi trong môi trờng có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và
nitơ vô cơ.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có Bacillus
subtilis các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ đợc dùng phối hợp
trong môi trờng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp
proteaza.
Những nguồn protein khác nhau nh (pepton, albumin,
gluten, sừng móng nghiền nhỏ, bột đậu tơng...) có ảnh hởng
nhất định tới việc sinh proteaza của xạ khuẩn. Các axit amin
cũng có ảnh hởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzim bằng vi sinh
vật. Đối với Bacillus subtili

các axit amin ức chế trong quá

trình này là glaxin, metionin, axit glutamic, alanin, lơxin.
1.1.6 Sự phân giải protein:

19


Muốn phân giải protein, cũng nh đối với các hợp chất cao
phân tử khác, đầu tiên vi sinh vật phải tiết ra các enzim
phân giải protein ngoại bào và làm chuyển hoá protein thành
các hợp chất có phân tử nhỏ hơn (các polypeptit và
olygopeptit). Các chất này hoặc tiếp tục đợc phân giải thành
các axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào hoặc đợc xâm
nhập ngay vào tế bào vi sinh vật sau đó mới chuyển hoá

thành axit amin. Một phần các axit amin này đợc vi sinh vật
sử dụng trong quá trình tổng hợp protein của chúng, một
phần khác đợc tiếp tục phân giải theo nhng con đơng khác
nhau để sinh NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác.
protit

proteaza

Polypeptit
origopeptit

peptidaza axit amin

1.1.7. ặc tính và ứng dụng của proteaza từ vi
sinh vật.
1.1.7.1. ặc tính của proteaza.
Proteaza là nhóm enzim thuỷ phân các liên kết peptit (CO-NH-) trong phân tử protein hoặc các polypeptit. Proteaza
có thể chia thành proteinaza và protidaza.
Proteinaza ph©n hủ ph©n tư protein thanh polypeptit,
pepton. Chóng cã tÝnh dặc hiệu tơng đối rộng . Tiếp đó là
sự phân huỷ các peptit có phân tử nhỏ này thành các axit
amin tù do díi t¸c dơng cđa peptidaza. C¸c peptidaza có tính
đặc hiệu hẹp hơn, chúng chỉ tác dụng lên các liên kết
peptit ở những vị trí nhất định.

20


Proteaza của nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng
hơn so với proteaza của động vật và vi khuẩn. Proteaza của

vi khuẩn hoạt động ở vùng ở 7-8. Còn proteaza của nấm mốc
Asp.oryzae hoạt động trong khoảng pH 3,5 - 9 tối thích ở pH
7-8. Nhờ vậy nó đợc dùng nhiều trong việc ổn định bia (pH
4-5) và trong việc làm mềm da (pH 8-9). Dựa vào khoảng pH
hoạt động ngời ta chia proteaza ra làm ba loại: Loại axit hoạt
động trong vùng pH 2,5-3; loại trung tính hoạt động trong ph
6-7,5; .và loại kiềm hoạt động trong khoảng pH 8-11
Còn dựa vào đặc trng của tâm hoạt động ngời ta chia
proteaza cđa vi sinh vËt thµnh proteaza serin, proteaza tiol,
peptidaza chứa kim loại và proteaza tác dụng trong môi trêng
axit.
ChÕ phÈm proteaza tinh khiÕt tõ vi khuÈn Bacillus cã
thÓ thuỷ phân hoàn toàn nhiều protein, chế phẩm này đợc
gọi là suptilizin, khi tác dụng trên cazein thì hoạt độ sẽ cực
đại ở pH trung tính.

21


1.1.7.2. Ứng dơng cđa c¸c chÕ phÈm proteaza tõ
vi sinh vËt.
C¸c chÕ phÈm proteaza cã nhiỊu øng dơng réng r·i trong
các ngành công nghiệp khác nhau :
- Trong công nghiệp thịt: Có thể sử dụng các chế phẩm
proteaza để làm mềm thịt ngoài ra có thể dùng để thuỷ
phân một phần nào đó các protein tham gia trong thành
phần của thịt. Từ đó làm cho chất lợng của thịt đợc tăng lên.
- Trong công nghiệp sữa: Proteaza không những có khả
năng phân ly protein mà còn có khả năng làm đông tụ sữa.
- Trong công nghiệp da: Trong ngành công nghiệp này

proteaza có tầm quan trọng trong hai quá trình: Làm mềm
và tách lông.
- Trong sản xuất tơ tằm: Ngời ta thờng dùng proteaza từ
nấm mốc mà đặc biệt là từ vi khuẩn để tách xerixin.
- Trong công nghiệp bia, dùng proteaza để thuỷ phân
protein để làm trong bia.
- Trong công nghiệp dệt dùng proteaza để dũ sạch vải.
- Trong y học dùng proteaza để sản xuất axit amin tạo ra
các chai đạm khắc phục hiện tợng suy dinh dỡng. Hoặc
dùng proteaza để nhỏ mắt phá tan các sợi máu trong mắt
chữa tối mắt.
- Trong hơng phẩm và mỹ phẩm: Dới tác dụng của
proteaza trong kem các biểu bì của da đà chết sẽ đợc tách
ra, da non và mới sẽ đựơc xuất hiện đồng thời sự phát triển
của lông tóc cũng bị chậm lại.

22


- Trong công nghệ vi sinh : Các chế phẩm proteaza vi
khuẩn và các vi sinh vật khác. Cũng đợc sử dụng để sản xuất
các môi trờng dinh dỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy.
1.2. Tỡnh hỡnh nghiờn cứu trong nước và trên thế giới
1.2.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn và enzim proteaza trong nước.
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều phải có vai trị
xúc tác của enzim - chất xúc tác sinh học. Vì thế các nghiên cứu về enzim đã
thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu hoá sinh học, sinh học thực
nghiệm và những nhà nghiên cứu khác. Các nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính,
tinh sạch enzim, tạo các chế phẩm có độ tinh sạch khác nhau, nghiên cứu cấu
trúc, mối quan hệ giữa cấu trúc va hoạt tính của enzim, khả năng ứng dụng

của enzim trong thực tiễn .
Gần đây nhất là những nghiên cứu mới mẻ mang tính ứng dụng lớn
được sử dụng rộng rãi như:
- Trần Quốc Hiền ,Lê Văn Việt Mẫn, trung tâm công nghệ sau thu
hoạch, viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II, Trường Đại Học Bách KhoaĐHQG Hà Nội đã “nghiên cứu thu nhận chế phẩm prôtein từ ruột cá Basa
(Pangasius bocoarti)” (thực hiện năm 2006). Nghiên cứu này khảo sát q
trình tích ly và tinh sạch enzim protein từ ruột cá basa [14].
- Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobecter
sp.QN6 sinh tổng hợp protein được thực hiện bởi Quyền Đình Thi, Trần Thị
Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện công nghệ sinh học đã chứng
minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với
chủng vi sinh vật biển Acinetobectersp. QN6 sinh tổng hợp protein [15].
- Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Tồn, Phan
Thị Ánh Hồng –ĐH Cần Thơ, ĐHKH Tự Nhiên –ĐHQGTPHCM đã tiến
hàmh tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các serin proteaza từ Trâm quế

23


(2007). Bước đầu khảo sát hệ enzim proteaza từ Trâm quế (Perionyx
excaratus) cho thấy phần lớn các protein trong dịch chiết enzim thơ có thể
tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đạm ammoniumsulfat nồng độ trong khoảng
30%-80% [16],[4].
- “Nghiên cứu ứng dụng protein của Bacillus subtilis trong sản xuất
bột đạm thuỷ phân từ cá mối” của Vũ ngọc bội, ĐH Thuỷ sản nha trang. Qua
nghiên cứu cho thấy proteaza của Bacillus subtilis có thể thuỷ phân mạnh mẽ
cơ thịt cá mối và có thể sử dụng enzim này trong sản xuất bột đạm thuỷ phân .
- Nghiên cứu ứng dụng của protein trong sản xuất bia, được thực hiện
trong các năm 1993-1994, thực hiện bởi : TS.Trương Thị Hoà và các cộng tác
viên công nghệ thực phẩm. Proteaza của Asp.oryzae được dùng để thuỷ phân

protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [8].
- Đỗ Thị Hồng Việt và cộng sự (1997) đã nghiên cứu về khả năng sinh
tổng hợp proteaza của Bacillus.
- Võ Thị Thứ và cộng sự (1997) đã phân lập được các chủng thuộc lồi
Bacillus sphaericus có khả năng diệt ấu trùng muỗi.
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu và phân loại vi khuẩn:
- Vi khuẩn đầu tiên được quan sát bởi Antony Van Leewanhoek năm
1683 bởi kính hiển vi một trịng do ơng tự thiết kế. Tên vi khuẩn được đề nghị
sau đó khá lâu bởi Christion Gottfried Ehrenberg vào năm 1882, xuất phát từ
chữ BacktnPiov trong tiếng Hi Lạp có nghĩa là “cái que nhỏ” .
- Louis pasteur (1822-1895) và Robert koch (1843-1910) miêu tả vai
trò của vi khuẩn là các thể mang và gây ra bệnh hay là tác nhân gây bệnh .
- Ban đầu vi khuẩn hay vi trùng được coi là các loại nấm có kích thước
hiển vi gọi là Schromyceter ngoại trừ các loại vi khuẩn lam quang hợp được
coi là một nhóm tảo ( Aganophyta hay tảo lam). Phải đến khi có những nghiên

24


cứu về cấu trúc tế bào thì vi khuẩn mới được nhìn nhận là một nhóm riêng
khác với các sinh vật khác .
- Đến năm 1856, Llebart Cofeland phân chúng vào một giới (kinhdam)
riêng gọi là mychota sau đó được đổi tên thành sinh vật khởi sinh (monera),
sinh vật nhân sơ (prokaryota) hay vi khuẩn (Bacteria). Trong thập niên 1960
khái niệm này được xem xét lại và vi khuẩn (bây giờ gồm cả Cyanbacteria)
được xem như là một trong hai nhóm chính của sinh giới cùng với sinh vật
nhân chuẩn.
Sự ra đời của phân loại học phân tử đã làm lung lay quan điểm này,
năm 1977 Carluoese đã chia sinh vật nhân sơ thành hai nhóm dựa trên trình tự

16s NAD gọi là vi khuẩn chính thức (Eu bacteria) và vi khuẩn cổ
Archaebacteria. Ơng kết luận rằng hai nhóm này cùng với sinh vật nhân
chuẩn tiến hoá độc lập với nhau. Vào năm 1909 nhấn mạnh thêm quan điểm
này bằng cách đưa ra hệ thống phân loại ba vực gồm vi khuẩn, vi khuẩn cổ và
sinh vật nhân chuẩn (Eucaryota). Quan điểm này được chầp nhận giữa các
nhà sinh học phân tử nhưng cũng bị chỉ trích bởi một số khác cho rằng ơng đã
quan trọng hố về sự khác biệt di truyền và cho rằng cả vi khuẩn cổ và sinh
vật nhân chuẩn có lẽ đều phát sinh từ vi khuẩn chính thức.
1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu về enzim proteza:
Trong các proteaza các nghiên cứu về enzim của hệ tiêu hoá được
nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 185, VForvisart đã tách được tripsin từ dịch tuỵ,
đó là proteaza đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng
tách được enzim pepxin từ dịch dạ dày của chó ở dạng tinh khiết tương đối.
Ngoài ra người ta cung đã khảo sát đầu tiên về các protein trong máu [11].
- Các protein thực vật được phát hiện muộn hơn: Năm 1987 Wartz được
xem là người đầu tiên tách được protein từ thực vật, đến nay người ta đã
nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protein như:
Papain, Tripsin, Subtilizin [11].

25