Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ aspergillus niger và thử nghiệm bóc vỏ tiêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
OẠI HỌC

THỦDẰUMỘT

BÁO CÁO TỔNG KẾT
THU DAU MOT UNIVERSITY

2009

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
••

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME
PECTINASE TỪ Aspergillus niger VÀ THỬ NGHIỆM
BÓC VỎ TIÊU (Pepper nigrum L.)
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần Ngọc Hùng

Bình Dương, 12 / 2018
MỤC LỤC
••
Danh mục bảng ...........................................................................................................
Danh mục hình ...........................................................................................................
Danh mục từ viết tắt ...................................................................................................
Thông tin kết quả nghiên cứu .....................................................................................
Mở đầu ......................................................................................................................

1

2
3
4
12


1. Tính cấp thiết ........................................................................................................ 12
2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 12
3. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 13
4. Phạm vi nghiên cứu .............................................................................................. 13
Chương 1: Tổng quan tài liệu .................................................................................. 14
1.1. Khái quát về nấm Aspergillus ............................................................................ 14
1.1.1. Phân loại Aspergillus ................................................................................... 14
1.1.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 14
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng................................................................................... 15
1.1.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Aspergillus ....................................... 16
1.2. Giới thiệu về enzyme pectinase ......................................................................... 16
1.2.1. Phân loại enzyme pectinase ......................................................................... 16
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và xúc tác của enzyme pectinase .................................... 17
1.2.3. Nguồn thu nhận enzyme pectinase .............................................................. 20
1.2.4. Đặc điểm enzyme pectinase của Aspergillus................................................ 20
1.2.5. Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc
sinh tổng hợp pectinase .................................................................................. 21
1.2.6. Ứng dụng của enzyme pectinase ................................................................. 22
1.3. Giới thiệu về hồ tiêu .......................................................................................... 23
1.3.1. Đặc điểm chung của cây tiêu ....................................................................... 23
1.3.2. Vai trò của tiêu đối với đời sống .................................................................. 24
1.3.3. Giá trị kinh tế của hồ tiêu ............................................................................ 24
1.3.4. Thành phần hóa học của hạt tiêu ................................................................. 26
1.3.5. Thành phần hóa học và cấu trúc của vỏ tiêu ................................................ 26

1.3.6. Các phương pháp bóc vỏ tiêu hiện nay ........................................................ 27
1.4. Những nghiên cứu gần đây liên quan đến đề tài .................................................. 28


Chương 2: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu ................................................... 31
2.1. Vật liệu và các loại môi trường dùng trong nghiên cứu .................................... 31
2.1.1. Vật liệu .......................................................................................................... 31
2.1.2. Các loại môi trường dùng trong nghiên cứu .................................................. 31
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 31
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận enzyme ........................................ 31
2.2.2. Phương pháp bóc vỏ tiêu theo truyền thống ................................................ 31
2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme pectinase .......................................................... 32
2.2.4. Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp định lượng đường khử....... 34
2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng piperine ................................................. 35
2.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong chế phẩm bán tinh sạch . . . 35
2.2.7. Phương pháp xác định độ ẩm chế phẩm pectinase bán tinh sạch ................. 35
2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 35
2.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 36
2.3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để
thu nhận chế phẩm enzyme pectinase............................................................. 36
2.3.2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase
trên quy mơ thí nghiệm ................................................................................. 37
2.3.3. Thử nghiệm nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu xanh của chế phẩm
enzyme pectinase ........................................................................................... 37
Chương 3: Kết quả.................................................................................................... 40
3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận chế phẩm
enzyme pectinase ................................................................................................ 40
3.2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase
trên quy mơ thí nghiệm ....................................................................................... 46
3.3. Thử nghiệm nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu xanh của chế phẩm

enzyme pectinase ................................................................................................ 48
Chương 4. Kết luận và kiến nghị ............................................................................ 56
4.1. Kết luận ............................................................................................................... 56
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 56
Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 57
Phụ lục ...................................................................................................................... 61

ii


DANH MỤC BẢNG
•

Bảng 1. Thành phần pectin và mức độ ester hóa của một số loại nguyên liệu ................22
Bảng 2. Nội dung các nghiệm thức thí nghiệm ...............................................................37
Bảng 3. Hoạt độ pectinase của các chủng Aspergillus niger ...........................................40
Bảng 4. Hoạt tính pectinase của chủng Aspergillus B2
trên mơi trường chứa chất cảm ứng khác nhau..................................................41
Bảng 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ cùi bưởi đến hoạt độ pectinase
của chủng Aspergillus B2 .................................................................................42
Bảng 6. Ảnh hưởng của lượng nước trong môi trường bán rắn đến hoạt độ pectinase ...43
Bảng 7. Ảnh hưởng của pH dịch khoáng đến khả năng sinh enzyme pectinase
của Asp. niger B2................................................................................................44
Bảng 8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase của chủng
Aspergillus B2....................................................................................................45
Bảng 9. Các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm enzyme pectinase sản xuất
trên quy mô pilot ................................................................................................48
Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng nước ngâm tiêu đến khả năng bóc vỏ ..........................49
Bảng 11. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu ......................50
Bảng 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ ngâm đến hiệu suất bóc vỏ tiêu ................................51

Bảng 13. Hàm lượng đường khử và hoạt độ các enzyme trong dịch nước ngâm tiêu .....52
Bảng 14. Ảnh hưởng của hoạt độ enzyme pectinase lên hiệu suất bóc vỏ tiêu ...............53
Bảng 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng hoạt động
của enzyme pectinase trong dịch ngâm tiêu .....................................................54
Bảng 16. Hiệu suất bóc vỏ tiêu trên quy mô pilot ...........................................................55
Bảng 17. Hàm lượng piperine của tiêu bóc vỏ thử nghiệm và một số
sản phẩm cùng loại ..........................................................................................56

DANH MỤC HÌNH
•

Hình 1. Khuẩn lạc Aspergillus trên mơi trường PGA sau 3 ngày....................................15
Hình 2. Mơ hình hoạt động thủy phân của enzyme pectinase ........................................19
Hình 3. Cấu trúc vách tế bào thực vật ............................................................................23
Hình 4. Hoạt độ pectinase của các chủng Aspergillus niger............................................40
Hình 5. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh pectinase của chủng
Aspergillus B2 ...................................................................................................41
Hình 6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cùi bưởi đến khả năng sinh tổng hợp pectinase ................42
Hình 7. Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp pectinase......43
Hình 8. Ảnh hưởng của pH dịch khống lên khả năng sinh enzyme pectinase
của Asp. niger B2 ...............................................................................................44
Hình 9. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase trong canh trường.....45
Hình 10. Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase bán tinh sạch .................47
Hình 11. Ảnh hưởng của việc bổ sung nước lên q trình bóc vỏ tiêu ...........................49
Hình 12. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu........................50
Hình 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ ngâm đến q trình bóc vỏ tiêu. ...............................51
Hình 14. Hàm lượng đường khử và hoạt độ các enzyme trong dịch nước ngâm tiêu .....52
1

Hình 15. Ảnh hưởng của hoạt độ pectinase bổ sung đến q trình bóc vỏ tiêu ..............54
Hình 16. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến q trình bóc vỏ tiêu .........................54
Hình 17. Hiệu suất bóc vỏ tiêu trên quy mơ pilot ...........................................................55
Hình 18. Hàm lượng piperine của sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm và
một số sản phẩm tiêu sọ phổ biến trên thị trường .............................................57
Hình 19. Tiêu xanh nguyên liệu (a) và sản phẩm tiêu sau khi bóc vỏ ............................57

2


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

PTN

: Phịng thí nghiệm

WA

: Water Agar

PE
PME
PG

: Pectin esterase
: Pectin Methyl
Esterase
: Polygalacturonase

EC.

: Enzyme Code

TE

: Trans-elyminase

PL

: Pectin lyase

GLS

: Galacturonic acid

RHA

: Rhamnose

UI
DNS
OD

: Unit International
: Dinitro Salicylic
Acid
: Optical Density

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

NT

: Nghiệm thức

3


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT
Đơn vị: Khoa Khoa học Tự nhiên

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger và thử
nghiệm bóc vỏ tiêu (Piper nigrum L.)
- Mã số:
- Chủ nhiệm: ThS. Trần Ngọc Hùng
- Đơn vị chủ trì: Khoa Khoa học Tự nhiên
-

Thời gian thực hiện: 01/2018 - 01/2019
2. Mục tiêu:

-

Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột.

-

Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm.
3. Tính mới và sáng tạo:
Enzyme pectinase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lãnh vực khác nhau như sản
xuất nước ép, rượu; ly trích dược chất; xử lý môi trường... Trong lĩnh vực chế biến thực
phẩm, enzyme pectinase giúp tăng hiệu quả sản xuất, chế biến của các sản phẩm nông sản
như trà, cà phê, hồ tiêu.
Tiêu trắng là sản phẩm được nhiều thị trường lớn ưa chuộng. Việc sản xuất tiêu trắng
chủ yếu là sản xuất thủ công và bán công nghiệp từ tiêu xanh hoặc tiêu đen theo phương
pháp ngâm nước. Quá trình này thường kéo dài từ 10 - 12 ngày, làm cho tiêu sau khi xát
vỏ thường sậm màu, mùi rất khó chịu và phải khử màu khử, mùi bằng hóa chất. Lượng
nước ngâm tiêu trong quy trình chế biến cũng là một nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Đề
tài nghiên cứu khả năng sử dụng enzyme pectinase được nuôi thu nhận từ việc nuôi cấy
bán rắn chủng Aspergillus niger B2 để rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu. Theo đó, giúp nâng
cao hiệu quả trong chế biến tiêu sọ và giảm áp lực xử lý môi trường của xí nghiệp chế
biến tiêu sọ.


4. Kết quả nghiên cứu:
Kết quả sàng lọc 9 chủng Aspergillus niger cho thấy, chủng Aspergillus niger B2 có
khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất trên môi trường bán rắn chứa 12 % bột
cùi bưởi, lượng dịch khoáng bổ sung chiếm 40 %, pH 5,5. Sau 5 ngày, hoạt độ pectinase
trong canh trường đạt 4,82 UI/g. Trên quy mơ sản xuất thử 10 kg/mẻ, chế phẩm có hoạt độ
pectinase đạt 91,3 % so với khi nuôi cấy trong các bình tam giác.
Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự giải phóng enzyme cellulase và pectinase nội sinh
từ vỏ tiêu khi ngâm tiêu với nước trong khoảng 24 giờ. Trong trường hợp khơng bổ sung
enzyme pectinase, hiệu quả bóc vỏ tiêu đạt cao nhất khi bổ sung nước với tỷ lệ tiêu/nước
là 1/1, sau 48 giờ ngâm ở nhiệt độ 35 oC, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 92,20 %. Trên quy mô
thử nghiệm với khối lượg 5 kg, tiêu được ngâm nước 24 giờ, bổ sung enzyme pectinase
với hoạt độ 4 UI/ 50 g tiêu, ủ ở nhiệt độ 40 oC trong thời gian 4 giờ, hiệu suất bóc vỏ tiêu

đạt 93,20 %. Hàm lượng piperine trong sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm đạt 6,58 %, cao hơn
so với một số sản phẩm phổ biến trên thị trường hiện nay. Kết quả thử nghiệm là cơ sở
bước đầu để chúng tơi xây dựng một quy trình sản xuất tiêu sọ hoàn chỉnh.
5. Sản phẩm:
03 bài báo khoa học và hướng dẫn 02 nhóm SV CNKH
- Bài báo đăng trên tạp chí Phát triển Khoa học và Kỹ thuật, số chuyên san KHTN:
Trần Ngọc Hùng, Nghiên cứu nâng cao hiệu quả bóc vỏ tiêu đen (Piper nigrum L.),
Tạp chí Phát triển Khoa học và Kỹ thuật, số chuyên san KHTN, Tập 5, Số T20, 2017,
tr. 50-57.
- Bài báo đăng trên tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc
Như, Trương Ngọc Loan, Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng bóc vỏ
của tiêu đen (Piper nigrum L.), Tạp chí đại học Thủ Dầu Một, Số 6(25), 2015, tr. 4034.
- Bài báo đăng trên tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc
Như, Nguyễn Anh Dũng, Mai T. Ngọc Lan Thanh, Nghiên cứu thu nhận chế


phẩm pectinase từ Aspergillus niger nuôi cấy trên môi trường bán
rắn chứa cùi bưởi để nâng cao hiệu quả bóc vỏ tiêu, Tạp chí
đại học Thủ Dầu Một, Số 5(30), 2016, tr. 82-89.

- Hướng dẫn sinh viên thực hiện đề tài NCKH năm 2014-2015: Nghiên cứu sử dụng vi
nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. để bóc vỏ tiêu xanh. Sinh viên thực hiện
chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: giỏi
- Hướng dẫn sinh viên thực hiện đề tài NCKH năm 2015-2016: Khảo sát một số yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng bóc vỏ của tiêu đen (Piper nigrum L.). Sinh viên thực hiện
chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: tốt
- Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase trên quy mơ pilot.
- Sản phẩm tiêu trắng sau bóc vỏ: 1 kg
- Báo cáo tổng thuật tài liệu và báo cáo tổng kết đề tài.
6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

Kết quả đề tài có thể giúp sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase trên quy mô
pilot. Chế phẩm được định hướng để ứng dụng trong chế biến tiêu sọ hoặc chế biến cà
phê.
Ngày tháng năm
Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ và tên)
Đơn vị chủ trì
hữ ký, họ và tên)


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
Project title: Studying to produce the nitrogen solution from red worm (Perionys
excavatus) for add to feed chickend.
Code number:
Coordinator: MS. Tran Ngoc Hung
Implementing institution: Deparment of Natural Science
Duration: from January/2018 to January/2019
2. Objective(s):
- Study on producing the semi-purified pectinase preparation, powder form.
- Experiment the capability of the preparation in taking off the husk of pepper
3. Creativeness and innovativeness:
Pectinase enzyme are probably applied in many fields, such as production of fruit
juice, wine; extraction of pharmaceutical substrate; environmental treatment... In food
process, pectinase enzyme help increase effective of agro-product process such as tea,
coffee, pepper.
The white pepper are liked by the market of developed countries. Production of
white pepper is mainly manual or semi-industrial from the fresh pepper or black pepper by
the immersing way. This way often takes 10 - 12 days, making the sheeling pepper have a
dark colour, unpleasant smell. This way also require a large of water that is a harzard cause
environmental pollution. The experimental subject used pectinase enzyme receiving from

culturing the Aspergillus niger B2 on the semi-solid medium to shorten the time of
shelling pepper. Accordingly, the result of subject help increase the effective of white
pepper process and decrease the pressure of environmental treatment at self enterprise.
4. Research results:
The result of screening 9 strains of Aspergillus niger showed B2 strain synthesis
pectinase enzyme with the highest yield on the semi-solid medium containing 12 % of
pomelo pulp; 40 % of mineral solution, pH 5.5. After 5 days, the pectinase yield in
cultured gets 4.82 UI/g. At the 10 kg/batch of scale, pectinase activity of the preparation
gets 91.3 % in comparison with the flask scale.


The results showed having eliminating of cellulose and pectinase enzyme from the
self peel pepper in 24 hours of immersing. Our research gave two solutions to improve
these disadvantages gradually. 1) Shelling yield that immersed in water with the ratio 1:1
in weight at 35 oC in 48 hours, gets 92.2 %. 2) When adding pectinase at activity 4 UI/
50gr pepper, hydrolyzing at 40 oC in 4 hours, the effective of removing the husk of the
pepper reaches 93.2 percents after 28 hours, the content of piperine of white pepper
reaches 6.58 %.
5. Products:
- A article in Jounal of Science and Technology Development: Tran Ngoc Hung, Study
on improving the effectiveness of taking off the husk of black pepper (Piper nigrum
L.), Jounal of Science and Technology Development, Vol. 5, No. T20, 2017, pp. 50-56.
- A article in Jounal of Thu Dau Mot University: Tran Ngoc Hung, Tran Thi Ngoc Nhu,
Truong Ngoc Loan, Study on effect of some factors on taking off the husk of the black
pepper (Piper nigrum L.), Jounal of Thu Dau Mot University, No. 6 (25), 2015, pp.
50-57.
- A article in Jounal of Thu Dau Mot University: Tran Ngoc Hung, Tran Thi Ngoc Nhu,
Nguyan Anh Dung, Mai T. Ngoc Lan Thanh, Research on producing pectinase from
Aspergillus niger on solid state medium containing grape fruit pulp for improving
pepper peeling, Jounal of Thu Dau Mot University, No. 5(30), 2016, pp. 82-89.

- Guiding students carry out the scientific subject in 2015: Study on the using
Trichoderma sp. and Aspergillus sp. to taking off the husk of fresh pepper. Main
responsibility student: Tran Thi Ngoc Nhu; Rank: good
- Guiding students carry out the scientific subject in 2016: Study on effect of some
factors on taking off the husk of the black pepper (Piper nigrum L.), Main
responsibility student: Tran Thi Ngoc Nhu; Rank: excellent
- Process of production of the rich-pectinase preparation on the pilot scale.
- The peeling pepper product: 1 kg.
- The special subject report, the documentary report and the summary report.
6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability:
The experimental results could help produce the rich-pectinase preparation on the
pilot scale. The preparation is used for apply in the white pepper process or the coffee
process.


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết
Trên thị trường thế giới, giá xuất khẩu tiêu đen khoảng 7.399 USD/tấn, tiêu trắng
trên 10.648 USD/tấn. So với 2013, giá tiêu đen tăng 17,56 % so với giá tiêu trắng ở
nước ta, tiêu trắng được sản xuất với lượng thấp hơn rất nhiều so với tiêu đen, trong
khi ở các nước khác, xu hướng chung là phát triển sản xuất và chế biến tiêu trắng.
Tiêu trắng được tiêu thụ chủ yếu ở các nước phát triển như ở Châu Âu, Châu Mỹ,
Châu Á ưa chuộng, do màu sắc hấp dẫn, mùi thơm nồng và ít tạp nhiễm vi sinh vật
nên tiêu trắng được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm ở nhiều nước (Trần
Bình Định, 2012; Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam, 2014). Hiện nay, việc sản xuất tiêu trắng
chủ yếu là sản xuất thủ công và bán công nghiệp từ tiêu xanh hoặc tiêu đen theo
phương pháp ngâm nước. Quá trình này thường ngâm dài ngày, từ 10 - 12 ngày, và
thay nước nhiều lần đến khi vỏ tiêu thối mũn mới đem xát vỏ. Vì vậy sau khi xát vỏ,
tiêu thường sậm màu, mùi rất khó chịu và phải khử màu, khử mùi bằng hóa chất. Việc
phân rã vỏ tiêu chủ yếu là phân rã tự nhiên, chỉ tiêu vi sinh của tiêu trắng thường

không đạt tiêu chuẩn, do vậy phải sấy tiêu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài để khử
khuẩn gây tổn thất các hợp chất thơm bay hơi, làm giảm chất lượng sản phẩm (Trung
tâm Khuyến nông quốc gia, 2012). Trong khi đó, nhiều nghiên cứu đã cho thấy
enzyme pectinase có khả năng thủy phân tốt thành phần pectin trong vỏ tiêu, giúp q
trình bóc vỏ diễn ra nhanh hơn. Ngồi ra, enzyme cịn được sử dụng nhiều trong các
quy trình chế biến nước giải khát, nâng cao hiệu quả chế biến cà phê.
Enzyme pectinase được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ vi khuẩn Bacillus
hoặc các loại nấm mốc. Trên môi trường bán rắn, vi khuẩn Bacillus lại sinh tổng hợp
pectinase không cao. Trong khi đó, ni cấy lỏng lại u cầu nhiều thiết bị và dễ
nhiễm tạp. So với các nguồn thu nhận pectinase khác, Aspergillus niger có khả năng
sản xuất pectinase với hoạt tính cao, rất dễ ni cấy, chúng phát triển tốt trên nhiều
loại phế phụ liệu nông nghiệp giàu pectin. Với nguồn giống là các chủng Aspergillus
niger được phân lập tại địa phương, trên các cơ chất giàu pectin, chúng tôi đề xuất đề
tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger và thử nghiệm
bóc vỏ tiêu (Pepper nigrum L.).


2. Mục tiêu đề tài
- Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột.
- Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm.
3. Đối tượng nghiên cứu:
- Hồ tiêu (Pepper nigrum L.) : Tiêu già được thu hái, loại cuống, hạt lép và phơi
nắng cho đến khi độ ẩm còn khoảng 20 %. Dung trọng tiêu khoảng 570g/lít.
- Các chủng nấm Aspergillus niger được phân lập trên các phế liệu giàu pectin như
cùi bưởi, cỏ cam, vỏ chanh... do PTN bộ môn sinh học, trường đại học Thủ Dầu Một cung
cấp.
4. Phạm vi nghiên cứu:
- Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme pectinase từ
Aspergillus niger ở quy mơ thí nghiệm.
- Nghiên cứu các điều kiện để nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm enzyme

pectinase.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát về nấm Aspergillus
1.1.1. Phân loại Aspergillus
Aspergillus là một trong những chi có tên là lâu đời nhất của nấm. Đến năm 1926,
Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nổi tiếng nhất và nghiên cứu
nhiều nhất. Phân loại Aspergillus thuộc giới Fungi, ngành Deuteromycota, bộ Eurotiales,
họ Trichocomaceae, chi Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài cho đến đã được
báo cáo là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ hội trong cơ thể người, nhiều loài gây bệnh
cho thực vật. Nhiều loài được con người ứng dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các
enzyme như Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus
clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae... (Bùi Xuân Đồng,
2002; Cao Ngọc Điệp, 2005).
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hồn chỉnh, khơng màu,
màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của
khuẩn lạc. Nhiều khuẩn ty của Aspergillus phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất
dinh dưỡng và khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một
khuẩn lạc mới.
Trong q trình sinh sản vơ tính, khuẩn ty của nấm Aspergillus hình thành một cọng
mang túi bào tử và bào tử đính với cọng mang túi bào tử khơng vách ngăn và không xuất
phát từ tế bào. Túi hay bọng là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn liền với thể bình.
Thể bình có thể có cấu trúc bậc 1 hay bậc 2, thể bình là cấu trúc đa nhân, trên đầu thể bình
tạo thành một chuỗi bào tử đính. Những bào tử non ở phía trong và càng xa thì càng già;
bào tử trưởng thành sẽ phóng thích vào khơng khí và nảy mầm.
Ngồi hình thức sinh sản vơ tính Aspergillus cịn có hình thức sinh sản hữu tính.
Hình thức này chỉ được phát hiện ở một vài loài, chúng tạo thành những bộ phận sinh dục

là túi đực và túi noãn (Bùi Xuân Đồng, 2002; Cao Ngọc Điệp, 2005).


Hình 1. Khuẩn lạc Aspergillus trên mơi trường PGA sau 3 ngày. a) Aspergillus T4;
b) Aspergillus oryzae; c) Aspergillus niger B2; d) cấu trúc bào tử và cọng mang bào tử
đính của chủng Aspergillus B2 trên mơi trường WA sau 3 ngày, quan sát ở vật kính 40X.
1.1.3.

Đặc điểm dinh dưỡng
Nấm Aspergillus sinh trưởng không cần ánh sáng, nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát

triển là từ 2 - 5 oC, tối ưu từ 22 - 27 oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được
là 35o - 40 oC. Oxy cũng cần cho sự phát triển của chúng vì chúng là nhóm hiếu khí bắt
buộc, sự phát triển sẽ ngưng khi khơng có oxy và tất nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự
phát triển.
Theo Alexopoulos và Mims (1979), nguồn dưỡng chất cần thiết cho Aspergillus
được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các
nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối
ammoni, ... sẽ được nấm hấp thu dễ dàng. Nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp, nấm
Aspergillus sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân
tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Cao Ngọc Điệp, 2005).


1.1.4.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Aspergillus
Trong công nghệ sản xuất enzyme (amylase, glucoamylase, pectinase, protease,

cellulase), công nghiệp chế biến thực phẩm, sản xuất acid hữu cơ (acid citric, acid
gluconic), loài Aspergillus niger và Aspergillus oryzae được sử dụng rất phổ biến. Nhiều

lồi thuộc chi nấm Aspergillus này có hoạt tính biến đổi sinh học, một số lồi tạo thành
độc tố (mycotoxin). Đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố aflatoxin gây ung
thư gan như loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus versicolor tạo
thành sterigmatocystin. Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các
lồi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae có hoạt tính amylase và glucoamylase để phân
giải tinh bột sắn. Aspergillus oryzae được nghiên cứu để thu nhận enzyme protease sử
dụng trong sản xuất nước chấm và khử lông da súc vật. Aspergillus niger được thu nhận
và sử dụng sản xuất enzyme pectinase, amylase để xử lí nguyên liệu nguồn gốc từ thực
vật. Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx, bglucosidase hay cellobiase, ngoài ra nhiều nghiên cứu cịn sử dụng một số chủng thuộc
lồi Aspergillus niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi (Nguyễn Đức Lượng,
2002).
1.2. Giới thiệu về enzyme pectinase
1.2.1.

Phân loại enzyme pectinase
Người ta chia pectinase ra làm hai nhóm:
Nhóm 1: enzyme thủy phân có sự tham gia của nước
- Pectin esterase (PE) hay pectin methyl esterase (PME): EC. 3.1.11.1, xúc tác sự

khử ester hố nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzyme này hoạt động đặc
hiệu với nhóm methyl este của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị
este hoá.
- Enzyme polygalacturonase (PG):
Xúc tác thuỷ phân liên kết a-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic),
gồm 2 loại:
+ PG cắt nội mạch: Endo-PG (EC. 3.2.1.15), còn gọi là poly (1,4-a-D- galacturonide)
glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết a-1,4-glycosid trong phân tử acid
pectic.
+ PG cắt ngoại mạch: Exo-PG (EC. 3.2.1.67), còn gọi là poly (1,4-a-Dgalacturonide) galacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết a-1,4-glycosid

của acid pectic từ đầu không khử.
PG cắt mạch pectin và có thêm nhóm CH3 của C6 có tên là polymethyl
galacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết a-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có
mức độ ester hố cao (Mahejibin Khan, 2013).
Nhóm 2: enzyme pectinase khơng có sự tham gia của nước: cắt đứt liên kết glycosid
Chúng thuộc nhóm enzyme phân cắt. Tên chung của nhóm là Trans-elyminase (TE)
(Gummadi, 2003). Bao gồm:
- Pectate lyase (EC. 4.2.2.2)
- Exo-pectate lyase (EC. 4.2.2.9)
- Endo-pectate lyase (EC. 4.2.2.10)
1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và xúc tác của enzyme pectinase
Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm của quá trình
này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol... đây là một nhóm enzyme được
ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease.
Cơ chế hoạt động của enzyme pectinase: Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase
chứa một vùng có 8 - 10 vịng xoắn kép p quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một
khe liên kết với cơ chất. Người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzyme
này có chứa 2 acid amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine
nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme. Nhiệt độ tối
ưu của enzyme pectinase thường khoảng 45 - 55 oC.
Hoạt động của enzyme liên quan đến việc thủy phân các nhóm methoxyl và acetyl
của các đơn vị galacturonate. Các gen mã hóa PE đã được phân lập từ Aspergillus niger,
Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae. Nhìn chung, hoạt động của PE là khơng mong
muốn trong nhiều q trình chế biến thực phẩm khác nhau do chúng tạo ra methanol. Do
đó, hoạt động của chúng được hạn chế để cho phép hoạt động khử polymer, làm thuận lợi
cho quá trình phân hủy pectin và nâng cao khả năng tách chiết, hóa lỏng, làm mềm và q
trình lọc. Enzyme polymethylgalacturonase thủy phân trực tiếp liên kết a-1,4 glycoside
của các phân tử pectin methyl hóa cao.
Polygalacturonase (PGs) thủy phân liên kết a-1,4 glycoside giữa các đơn phân

galacturon trong khung sườn. Cùng với rhamnosegalacturonase, chúng thuộc nhóm 28
enzyme thủy phân. PGs được chia thành 4 loại dựa theo cách thức hoạt động:
Endo-polygalacturonase thủy phân ngẫu nhiên liên kết a-1,4 glycoside của chuỗi


polysaccharide, tạo ra sản phẩm là các phân tử acid galacturonic và các oligomer, làm
giảm nhanh độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, tốc độ và tỷ lệ thủy phân giảm nhanh khi
gia tăng mức độ methyl hóa của phân tử. Endopolygalacturonase của cả A. niger và A.
aculaetus có một khe trong trung tâm hoạt động thích ứng cho các oligomer có 7 hoặc 8
đơn vị acid galacturonic. Cấu trúc các tiểu phần của enzyme và các dạng năng lượng kết
hợp cũng dự báo được các kiểu sản phẩm oligo-galacturonic acid với mức độ polymer hóa
từ 7 - 21 đơn phân (Mahejibin Khan, 2013).
Exopolygalacturonase

I

thủy

phân

D-galacturonic

từ

đầu

khơng

khử.

Exopolygalacturonase II thủy giải phóng di-galacturonate từ đầu không khử của phân tử
pectin. Các enzyme này không làm giảm nhanh độ nhớt của cung dịch.
Hơn 100 trình tự amino acid của nhóm 28 enzyme thủy phân đường đã được cập
nhật ở Genbank và cơ sở dữ liệu trình tự SWISS-PROT. Cấu trúc ba chiều của
rhamnosegalacturonans A từ Aspergillus aculeatus; PG A từ Erwinia carotovora; PG II
của Aspergillus niger đã được mô tả. Tất cả các PGs đề có chứa các cấu trúc xoắn p song
song phía bên phải, từ 7 - 12 cuộn xoắn và 3 - 4 phiến p xếp song song. So sánh trình tự
amino acid của nhóm 28 enzyme thủy phân đường cho thấy các enzyme này đều có chứa
các cầu nối disulfit để ổn định cấu trúc phân tử. Do đó, sự bảo tồn Cysteine tương ứng với
các cầu nối disulfit trong bộ khung của các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật
(Markovic and Janecek, 2001). PG vi khuẩn từ Erwinia carotovora có 2 cầu nối S-S,
Cys41-Cys62 và Cys115-Cys125, nhưng lại khơng có sự bảo tồn Cysteine ở vị trí tương
ứng trong tất cả các PG từ vi khuẩn. Mặt khác, Cysteine trong tất cả các PG từ nấm lại
được bảo tồn chặt chẽ. PG II từ Aspergillus niger có 4 cầu nối disulfit: Cys30-Cys45,
Cys203-Cys219, Cys 329-Cys334 và Cys353-Cys362. Mặc dù 2 cầu nối đầu tiên có mặt
trong tất cả các PG từ nấm, nhưng Cys329 được thay bằng Valine và Cys334 được thay
bằng Alanine trong các PG của nấm men. Cầu nối S-S thứ tư lại không xuất hiện trong các
PG của Claviceps purpurea và Chondrostereum perpureum. Các nhóm chức của amino
acid thơm là đặc điểm riêng của các enzyme PG, chúng có thể liên quan trong việc liên kết
với cơ chất khơng chỉ trong các PG mà cịn trong cả các enzyme thủy phân glycoside khác
amylase.
Cấu trúc của PG chịu nhiệt từ Thermotoga maritime cho thấy rằng promotor có dạng
tetramer bền ở nhiệt độ cao. Mặc dù toàn bộ dạng cuộn gập của Exo-PG từ T. maritime
tương đồng với nhóm 28 enzyme thủy phân glycoside nhưng xoắn p dài hơn. Phía trong
kị nước của xoắn p được bảo vệ khỏi dung môi. Điều này trái ngược với cấu trúc của


nhóm 28 enzyme thủy phân glycoside, chúng thường có cấu trúc mũ xoắn ở đầu C, một
vòng được giữ bằng cầu nối S-S hoặc có sự hiện diện một vịng kém kị nước che chắn
phía trong xoắn p khỏi dung môi (Pijning et al, 2009).

Pectin lyase (PLs) thủy phân trực tiếp pectin bằng cơ chế tách p tạo thành sản phẩm
là các oligogalacturonic chưa bão hòa. Hoạt động của các PL địi hỏi sự có mặt của ion Ca.
Các enzyme này phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật gây bệnh thực vật, trong đó chúng
đóng vai trị quan trọng như một tác nhân gây hại. PL cũng được tìm thấy trong các chủng
thuộc chi Bacillus và một số vi khuẩn chịu nhiệt. Cấu trúc không gian của nhiều PL ngoại
bào khác nhau đã được mô tả. Pectate lyase (Pel) C và Pel E từ Erwinia chrysanthemi và
Pel từ Bacillus subtilis khác nhau về kích thước và hình dáng các vòng nhưng giống nhau
về cấu trúc cơ bản và cấu trúc khác thường gọi là xoắn p, trong đó, chuỗi p gấp vào một
cấu trúc siêu xoắn bên phải. Cấu trúc tinh thể của pectin lyase A từ 2 chủng Aspergillus
niger N400 và 4M-147 cho thấy PL A được cuộn gập trong các phiến p và có nhiều đặc
điểm cấu trúc của PL vi khuẩn. Khe gắn cơ chất của 2 PL A Aspergillus niger được tạo
thành từ các nhóm thơm và tích điện âm. Phân tích trình tự protein và so sánh với các
pectinase khác cho thấy có sự tương đồng tùy theo nguồn gốc và hoạt tính enzyme tự
nhiên. Phân tích các doman cho thấy sự tồn tại của các nhóm pectinase khác nhau dựa
theo sự có mặt của

các doman riêng biệt (Yadav et al, 2009).
GLS: galacturonic acid; RHA: rhamnose (Mahejibin Khan, 2013)
Exopoly
galacturonase

Galactose

RHA

Hình 2. Mơ hình hoạt động thủy phân của enzyme pectinase.

Ferulic
acid

Arabinogalactanase
Arabinose Arabinose
Endopoly

Arabinose

Pectin acetyl
esterase
Exoarabanase
Rhamno-

Ferulic
Methyl
Pectin
lyase
Arabinose
■*---------Endoarabanase
acid


1.2.3.

Nguồn thu nhận enzyme pectinase
Enzyme pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao, nấm và vi sinh vật.
Trong thực vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme pectin esterase,

enzyme này thường nằm trong phần vỏ tế bào đặc biệt trong giai đoạn đầu của quả chín. Ở
thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá.
Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzyme pectin esterase. Việc ly trích PME cũng
được tiến hành trên nhiều loại quả như cà chua, cà rốt đen, quả bơ. Mặc dù vậy, việc sử

dụng vi sinh vật làm nguồn sản xuất enzyme pectinase đang rất được quan tâm. Hiện có
hơn 50 % tổng lượng enzyme công nghiệp được sản xuất từ nấm men, nấm mốc, 1/3 được
tổng hợp từ nguồn vi khuẩn và phần còn lại thu nhận từ thực vật và động vật (Trần Thanh
Trúc, 2013). Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp pectinase chủ yếu là vi sinh vật hiếu
khí, tiêu biểu là các nhóm sau:
Nấm mốc: Penicillium glaucum, P. ehrlichii, P. chrysogenum, P. expanam, P.
cilrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A. terrus, A. saitoi, A. aureus, A.
oryzae, A. wentii, Fusarium moniliforme,...
Nấm men: Saccharomyces fragilis.
Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Flavobacterium pectinovorum,
Klebsiella aerogenes...
Các loài vi sinh vật này thường có trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác
của thực vật. Khi quả bị hư hỏng, hoặc thực vật chết, chúng sẽ cùng các loài vi sinh vật
khác phá hủy nhanh quả và các bộ phận của thực vật. Người ta thường thu pectinase từ
canh trường bề mặt hoặc từ canh trường bề sâu của nấm mốc.
1.2.4.

Đặc điểm enzyme pectinase của Aspergillus
Trên môi trường Czapeck có bổ sung cơ chất cảm ứng là bột từ cùi vỏ cam, nấm

Aspergillus niger tổng hợp enzyme pectinase có trong lượng phân tử 30 kDa, enzyme này
hoạt động tốt nhất tại pH 7,0, nhiệt độ tương ứng là 55 oC (Ishtiaq Ahmed, 2016)
Enzyme PME thu nhận từ Aspergillus niger có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa,
hằng số Km là 0,6014 ± 0,0379 mg/mL, pH tối ưu khoảng 5,0 tương ứng với nhiệt độ 38 40 oC. Trên môi trường bán rắn, PME được tạo ra nhiều khi nuôi cấy A. niger ở nhiệt độ
35,5 oC, pH 4,0, độ ẩm canh trường đạt khoảng 57,4 % (Trần Thanh Trúc, 2013).
Có 5 loại endopolygalacturonase và 1 loại exopolygalacturonase được tìm thấy trong
pectinase K2B 078, một chế phẩm pectinase thương mại từ A. niger, 2 enzyme trong số


nhóm này là PG I và PG II hiện diện trong hầu hết các sản phẩm pectinase. Phân tích thư

viện bộ gen của A. niger N400 cho thấy sự hiện diện của nhóm gen mã hóa
endopolygalacturonase trong A. niger. Phân tích phân tử đã tách được gen mã hóa cho loại
PG thứ 3, pgaC. Đặc điểm cấu trúc của các gen pga trong các lồi Aspergillus khác nhau
có tính bảo tồn cao. Điều này phản ánh qua kích thước tương đồng của các enzyme được
mã hóa (362 - 383 amino acid) và cách tổ chức intron-exon. Các gen pga cũng được tìm
thấy ở Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Penicilium sp. và một số loài
nấm gây bệnh thực vật.
Pectinase từ Aspergillus niger là một nguồn cung dồi dào và được sản xuất trên quy
mơ lớn. Có 60 gen tổng hợp pectinase đã được khám phá trong toàn bộ bộ gen 33,9
megabase của Aspergillus niger (Pel H. J. et al, 2007).
Những nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Umesh-Kumar đã cho thấy q trình sinh
tổng hợp endo-polygalacturonase diễn ra trong suốt giai đoạn tăng trưởng trên môi trường
rắn. Một chủng chọn lọc chịu được nhiệt độ cao sau khi gây đột biến bằng UV có màu
vàng trong mơi trường ni cấy lỏng và tiết ra một lượng pectinase dồi dào suốt giai đoạn
tăng trưởng.
1.2.5.

Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng

hợp pectinase
Các loại nấm mốc trong tự nhiên có khả năng thích ứng cao với điều kiện sống. Với
mỗi nguồn cơ chất nhất định, chúng sẽ sinh tổng hợp enzyme tương thích, đặc hiệu với cơ
chất đó, nhằm chuyển cơ chất từ dạng khó hấp thu thành dạng đơn giản, có thể hấp thu
được. Mơi trường nuôi cấy giàu pectin là động lực để các chủng nấm Aspergillus tiết ra
enzyme pectinase. Tác động của các cơ chất cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao khi ở một nồng
độ thích hợp. Đối với bột cùi vỏ cam, nồng độ cảm ứng thích hợp nhất cho q trình sinh
tổng hợp là 4 %, pH 5,5 (Ishtiaq Ahmed, 2016). Trong trái cây, đặc biệt là các loại phế liệu
của ngành chế biến rau quả có chứa nhiều pectin với mức độ ester hóa đa dạng. Đây chính
là nguồn ngun liệu dồi dào cho việc nuôi cấy Aspergillus thu nhận enzyme pectinase.
Bảng 1. Thành phần pectin và mức độ ester hóa của một số loại nguyên liệu (Aehle,

2004)
Nguyên liệu Hàm lượng pectin (%)
Táo
0,5 + 1,6
Nho
0,1 + 1,4

Mức độ ester hoá (DE) %
80 + 92
50 + 65


Vỏ trái cây có múi
Lê
Dứa

3,5 + 5,5
0,7 + 0,9
0,04 + 0,1

65
50 + 70
22 + 40

Dâu tây
Bưởi

0,5 + 0,7
8,1 + 10,9

20 + 60
69 + 78

1.2.6.

Ứng dụng của enzyme pectinase
Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là: pectinase acid

và pectinase kiềm.
Trong công nghiệp thực phẩm: pectinase làm mềm mô thực vật, làm giảm độ nhớt
nâng cao hiệu quả thu nhận dịch nước ép, làm tăng hiệu quả lọc rượu. Theo Hours, bổ
sung pectinase ở tỷ lệ 1.000 - 2.000 UI/ lít, trong thời gian 1 - 3 giờ sẽ nâng cao hiệu quả
tinh lọc các loại nước ép táo (Baumann et al, 1981; Fogarty et al, 1983; Hours et al,
1983).
Pectinase cịn được sử dụng trong q trình ngâm đay, gai để tách sợi cellulose linen,
ramie nhưng không phá hủy sợi, ứng dụng trong chế biến trà, ca cao, nước táo, các loại
nước giải khát khác, ly trích dược liệu (Baracet et al, 1991).
Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến
các loại trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được ly trích chủ
yếu từ vi khuẩn được dùng trong chế biến các loài cây có sợi, trong cơng nghiệp giấy, xử lí
nước thải có chứa pectin, lên men trà, cà phê (Dương Thanh Tuân, 2012).
Dùng làm mềm mô thực vật (maceration) và cô lập protoplast: Trong chu trình sinh
sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền thống để đưa
nhiều tổ hợp các đặc tính mong muốn vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương
pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast (tế bào trần) cô lập từ tế bào
soma (tế bào sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai.
Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzyme pectinase, sau đó tiếp
tục xử lí với enzyme cellulase để chuyển mô này thành protoplast. Nồng độ của enzyme là
pectinase 0,5 % (w/v) và cellulase 5 % (w/v), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N.
Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy: Việc làm giấy là một quá trình lọc liên

tục các huyền phù và những phần mịn của sợi, các chất độn vô cơ như đất sét, CaCO3 để
tạo thành các phiến giấy. Vì vậy quá trình lọc sẽ ngày càng bị hạn chế do việc thoát nước


qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm. Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung
lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những
chất độn đi qua. Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp
thẩm tích vào bột giấy để giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và
làm tăng tốc độ thoát nước. Ngày nay, công nghiệp giấy và bột giặt đã bắt đầu đùng
enzyme pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá trình sản xuất (Nguyễn Đức
Lượng, 2004).
Ứng dụng trong lên men trà và cà phê: Pectinase đóng vai trị quan trọng trong lên
men trà, cà phê. Trong quá trình lên men cà phê, người ta dùng các vi sinh vật phân giải
pectin để loại bỏ lớp vỏ nhớt khỏi hạt cà phê (3/4 lớp vỏ nhớt này là pectin). Enzyme
thương mại được phun vào hạt với liều lượng 2 - 10 g/tấn ở 15 - 20 oC. Khi được xử lí với
enzyme pectinase, giai đọan lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm
từ 40 - 80 giờ cịn khoảng 20 giờ. Do việc xử lí cà phê với enzyme thương mại thì đắt và
khơng kinh tế nên người ta dùng lớp vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh
enzyme pectinase. Việc xử lí enzyme thúc đẩy q trình lên men mặc dù liều lượng của
enzyme phải được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà. Việc thêm enzyme
pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà bằng cách phân hủy pectin trà. Bổ sung 6
% enzyme pectinase (chế phẩm Viscozyme L) giúp rút ngắn quy trình sản xuất 14 giờ,
tăng hàm lượng các chất hòa tan 30,15 % (Huỳnh Thị Nhã và cộng sự, 2016).
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc sử dụng pectinase
để nâng cao hiệu quả sản xuất tiêu sọ. Enzyme pectinase kết hợp với cellulose giúp rút
ngắn thời gian bóc vỏ tiêu, hạn chế được mùi hơi và lượng nước thải ra môi trường.
1.3. Giới thiệu về hồ tiêu
1.3.1.

Đặc điểm chung của cây tiêu

Hồ tiêu thuộc bộ Piperales, họ Piperaceae, chi Piper, loài Piper nigrum là một loại

cây leo, bám vào các cây khác bằng rễ có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, đã du nhập vào
Việt Nam khá lâu, mang nhiều đặc trưng của cây trồng miền nhiệt đới. Cây tiêu thích hợp
với khí hậu vùng xích đạo và nhiệt đới, nhiệt độ trung bình 22 - 28 oC, lượng mưa cần
thiết từ 2.000 - 3.000 mm/năm, phân bố đều trong tháng 7 và 8, sau đó là 3 - 5 tháng
khơng mưa ở giai đoạn ra hoa và thu hoạch. Hồ tiêu có thể trồng được trên nhiều vùng đất
nhưng đất thích hợp phải là đất tơi xốp, nhiều mùn, pH 5,5 - 7,0 thoát nước tốt. Ở Việt
Nam, các vùng đất nâu đỏ bazan rất phù hợp cho việc trồng tiêu. Mật độ trồng thích hợp
nhất của hồ tiêu từ 2.000 - 2.500 nọc/ha. Đất dốc cần bố trí hàng tiêu theo đường đồng


mức để giảm bớt rửa trơi dinh dưỡng và xói mịn đất. Cây hồ tiêu có nguồn gốc từ tán
rừng thưa nên ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầu sinh lý của cây tiêu hơn là trực xạ.
Trồng tiêu trên cây trụ sống vừa tạo được độ che bóng cho vườn tiêu vừa đảm bảo trụ cho
tiêu leo bám (Hoàng thị Sản, 2009).
Mùa vụ và vùng trồng mùa thu hoạch tiêu khác nhau ở từng nước, tùy thuộc vào điều
kiện khí hậu. So với các quốc gia khác thì SriLanka, Ấn Độ và Thái Lan là các nước có
thời gian thu hoạch tiêu lâu nhất. Tại Ấn Độ, thời điểm thu hoạch tiêu bắt đầu từ tháng 11
và kéo dài cho đến tháng 3 năm sau. Ở Indonesia, thời gian thu hoạch từ tháng 7 đến tháng
10. Ở Brazil, thời gian thu hoạch kéo dài từ tháng 8 đến tháng 10. Ở Việt Nam, thu hoạch
tiêu bắt đầu từ tháng 3 và kết thúc vào tháng 5.
1.3.2.

Vai trò của tiêu đối với đời sống
Hạt tiêu là một trong những loại gia vị có hương vị mạnh và thơm. Người ta thường

thêm tiêu đen xay hoặc hạt tiêu thơ vào các món ăn để tăng thêm hương vị. Tiêu đen được
sử dụng như một biện pháp để điều trị các vấn đề sức khỏe như ho, đau họng hay cảm
lạnh. Bên cạnh đó, hạt tiêu cịn đem đến cho bạn nhiều lợi ích sức khỏe khác. Giúp ngăn

ngừa bệnh ung thư vú, hỗ trợ giảm cân, điều trị một số bệnh về dạ dày như chống khó tiêu,
đầy hơi, táo bón, giúp da mịn màng, giúp cơ thể tăng năng lượng chống trầm cảm. Hạt tiêu
cũng rất giàu chất chống oxy hóa, chẳng hạn như beta carotene, giúp tăng cường hệ miễn
dịch và ngăn ngừa sự hủy hoại của các tế bào, gây ra các căn bệnh ung thư và tim mạch.
Hạt tiêu đen rất giàu canxi, magie, phospho, kali, còn chứa sắt, natri và một lượng nhỏ flo,
selen, mangan, đồng và kẽm trong hạt tiêu đen có vitamin K, A, C, niacin, folate, choline
và betaine (Hồng Xuân, 2014)
1.3.3. Giá trị kinh tế của hồ tiêu
Hạt tiêu là một trong những sản phẩm nơng sản xuất khẩu chính của Việt Nam.
Trong 39 nước sản xuất hồ tiêu trên thế giới, Việt Nam có diện tích hồ tiêu đứng thứ 3, sau
Ấn Độ (195.900 ha), Indonesia (103.900 ha). Năm 2011, diện tích hồ tiêu Việt Nam đạt
55.800 ha, trong đó Bắc Trung bộ khoảng 3.400 ha, duyên hải Nam Trung bộ khoảng
1.400 ha, Tây Nguyên 22.600 ha, Đồng Bằng Sơng Cửu Long 600 ha và Đơng Nam bộ có
diện tích trồng lớn nhất với 27.700 ha. Những tỉnh có diện tích trồng hồ tiêu lớn nhất nước
là Bình Phước với 10.000 ha, Đồng Nai và Đăk Nông mỗi tỉnh 8.000 ha.
Mặc dù diện tích chỉ chiếm khoảng 9 % diện tích hồ tiêu thế giới, tuy nhiên sản
lượng hồ tiêu Việt Nam đạt khoảng 30 % sản lượng hồ tiêu toàn thế giới. Năm 2011, sản
lượng hồ tiêu của ta đạt 112.000 tấn, trong khi các nước có diện tích hồ tiêu lớn như Ấn


Độ sản lượng chỉ đạt 51.000 tấn, Indonesia 56.000 tấn. Ở Việt Nam, Tây Nguyên là nơi có
năng suất hồ tiêu cao nhất nước với 3,13 tấn/ha, trong đó tại tỉnh Gia Lai năng suất đạt
4,52 tấn/ha, cao hơn 82,3 % năng suất bình quân cả nước. Nhìn chung, những địa phương
và hộ trồng tiêu ở Việt Nam đạt hiệu quả kinh tế cao, phần lớn tập trung ở những nơi có
điều kiện tự nhiên thuận lợi, có sự đầu tư và ứng dụng các thiết bị kĩ thuật vào sản xuất và
chế biến. Ở Gia Lai, Đồng Nai và Bình Phước, một số vườn tiêu cho năng suất rất cao (từ
5 - 7 tấn/ha/vụ). Đặc biệt có hộ đạt trên 10 tấn/ha/vụ ở những vườn tiêu đã trồng và khai
thác từ 9 - 10 năm.
Theo số liệu của Hiệp hội Hồ Tiêu, năm 2008, Việt Nam xuất khẩu 90.000 tấn,
chiếm khoảng 35 % sản lượng tiêu của thế giới, nhưng chủ yếu là tiêu đen chiếm 90 %,

còn lại là tiêu trắng nên giá trị kinh tế không cao. Trên thị trường thế giới giá tiêu trắng
xuất khẩu vào khoảng 5.112 USD/tấn cao xấp xỉ 1,6 lần tiêu đen. Tiêu đen được tiêu thụ
chủ yếu ở các nước đang phát triển trong khi đó tiêu trắng được thị trường các nước phát
triển như châu Âu, châu Mỹ, Châu Á ưa chuộng do có màu sắc hấp dẫn, mùi thơm nồng
và ít tạp nhiễm vi sinh vật. Vì thế, tiêu trắng ngày càng được sử dụng rộng rãi trong chế
biến thực phẩm ở nhiều nước.
Theo Vietnamnet, năm 2013, hạt tiêu Việt Nam hiện đã xuất khẩu tới hơn 80 quốc
gia trên thế giới, với kim ngạch kỉ lục 889 triệu USD, sản lượng đạt 134.000 tấn vào năm
2013. Tháng 11 năm 2014, khối lượng tiêu xuất khẩu đạt 6.000 tấn, với giá trị 54 triệu
USD, đưa khối lượng xuất khẩu tiêu 11 tháng đầu năm lên tới 151.000 tấn, với giá trị 1,16
tỷ USD, tăng 18,1% về khối lượng và tăng 35,7% về giá trị so với cùng kỳ năm 2013. Tuy
nhiên, trong vài năm trở lại đây, xuất khẩu hồ tiêu của Việt Nam đang phải đối mặt với
nhiều khó khăn. Trong năm 2016, sản lượng tiêu Việt Nam xuất khẩu sang Mỹ đã giảm 6
% so với năm trước đó, chỉ đạt 48.040 tấn tiêu đen và 5.860 tấn tiêu trắng (Vietnamexport,
2017).
Theo Tổng Cục Hải Quan Việt Nam, trong 2 tháng đầu năm 2016, Việt Nam đã xuất
khẩu được 1.882 tấn tiêu trắng, tăng 5,7 % về khối lượng và 2,2 % về giá trị so với cùng kì
năm 2015. Trong đó, Mỹ là thị trường xuất khẩu tiêu trắng lớn nhất của Việt Nam, chiếm
tới 16,1 % về khối lượng (Mascopex, 2016).
1.3.4. Thành phần hóa học của hạt tiêu
Trong hồ tiêu có 1,5 - 2,2 % tinh dầu, gồm các terpen (phellandren, pinen, limonen)
nên có mùi thơm dịu và một ít hợp chất có oxy, tập trung ở vỏ quả giữa; alcaloid (2 - 5 %)
thành phần chính là piperin (5 - 8 %) và (2,2 - 6 %) chavixin. Trong tiêu có 8 % chất béo,