NGHIÊN cứu tạo CHẾ PHẨM VI SINH hữu ÍCH DÙNG TRONG sản XUẤT RAU SẠCH

BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC
2014


16

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI SINH HỮU ÍCH
DÙNG TRONG SẢN XUẤT RAU SẠCH

CN. Nguyễn Thị Huyền, TS. Lê Thị Loan
Trường Đại học Yersin Đà lạt

Tóm tắt
Các chủng Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium đều có khả năng phân giải tốt cellulose và đối kháng mạnh
với nấm Fusarium. Số lượng tế bào có trong sinh khối thu được từ quy trình nuôi cấy đạt cao nhất là vi khuẩn B.
pumillus (4.3.10
11
CFU/gam). Đánh giá qua thực nghiệm trên một số loại rau cho thấy sinh khối cả ba chủng vi khuẩn và
nấm Tricoderma đều có ảnh hưởng tốt đến sự nảy mầm và phát triển của các cây rau cải ngọt, rau roman, cải bẹ xanh
và rút ngắn thời gian thu hoạch cây rau roman xuống còn 21 ngày. Tỉ lệ bổ sung sinh khối 0.33% là tốt nhất ở các chủng
nghiên cứu lên sự nảy mầm và phát triển của các cây rau và tốt nhất là sinh khối vi khuẩn B. pumillus.
Abstract
Culturing useful biologicals products in producing fresh vegetable
Trichodema, B. subtilis, B. megaterium can resolve cellulose and strongly resist Fusarium fungi. The number of
cells in the biomass obtained by the culture process bacteria reach the highest of B. pumillus (4.3.10
11

CFU/gram).Experimentally evaluating a number of vegetables showed all biomass of three strains of bacteria and fungi
Tricoderma have a good impact on the germination and growth of the fresh vegetables, roman vegetables, mustard and
shorten time to harvest roman vegetables to 21 days. Additional biomass ratio 0.33% is the best in the race researched on
seed germination and growth of plants ,vegetables and the best is microbial biomass B. pumillus.

Mở đầu
Trước đ}y, để tăng năng suất v{ sản lượng trong
trồng trọt, người d}n thường sử dụng ph}n bón hóa
học v{ thuốc trừ s}u bệnh có nguồn gốc hóa học. Tuy
nhiên, việc sử dụng n{y chỉ đem lại lợi ích trước mắt
m{ không bảo đảm th}m canh c}y trồng bền vững, vì
c|c sản phẩm có nguồn gốc từ chất hóa học l{m cho
đất đai ng{y c{ng tho|i hóa, dinh dưỡng bị mất c}n
đối, mất c}n bằng hệ sinh th|i trong đất, hệ vi sinh
vật trong đất bị ph| hủy, tồn dư c|c chất độc hại
trong đất c{ng nhiều dẫn đến ph|t sinh một số dịch
hại không dự b|o trước, từ đó ảnh hưởng rất lớn đến
sức khỏe con người v{ g}y ô nhiễm môi trường.
Việc sử dụng chế phẩm sinh học nhất l{ ph}n
bón hữu cơ vi sinh trong canh t|c c}y trồng đang l{
xu hướng của Việt Nam nói riêng v{ thế giới nói
chung nhằm bảo đảm an to{n sinh học, an to{n thực
phẩm v{ an to{n môi trường m{ vẫn đảm bảo năng
suất, chất lượng cho trồng trọt, hướng đến một nền
nông nghiệp sạch, ph|t triển bền vững.
Nhận thấy tầm quan trọng v{ lợi ích của ph}n
bón vi sinh mang lại, chúng tôi thực hiện đề t{i:
“Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh hữu ích dùng
trong sản xuất rau sạch” nhằm hướng tới x}y dựng
quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh ở quy mô công
nghiệp dùng cho sản xuất c}y rau sạch, an to{n.
1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
1.1. Nội dung nghiên cứu
- Khảo s|t một số đặc điểm sinh học của c|c

chủng vi sinh vật: Trichoderma, B. subtilis, B.
megaterium và B. pumillus.
- Nuôi cấy thu sinh khối c|c chủng vi sinh vật
nghiên cứu.
- Bước đầu thử nghiệm trên một số đối tượng
c}y rau ở quy mô thí nghiệm.
1.2. Phương pháp nghiên cứu
1.2.1. Phương ph|p quan s|t hình th|i tế b{o
nấm: Dùng phương ph|p nuôi cấy phòng ẩm.
1.2.2. Phương ph|p quan s|t hình th|i tế b{o vi khuẩn
 Tiến hành làm tiêu bản trên một phiến kính
sạch và nhuộm Gram. Những tế bào bắt màu tím
thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (+); Những tế bào
bắt màu hồng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm (-)
1.2.3. Kiểm tra khả năng ph}n giải cellulose của c|c
chủng vi sinh vật bằng c|ch đo đường kính vòng thủy ph}n.
1.2.4. Kiểm tra khả năng kh|ng nấm bệnh
Fusarium của các chủng nghiên cứu
1.2.5. Phương ph|p nuôi cấy thu sinh khối các
chủng nghiên cứu; Theo sơ đồ sau:
Hoàn nguyên Nhân giống cấp I
Nhân giống cấp II Thu hồi sản phẩm
Kiểm tra độ sống Thử nghiệm.
1.2.6. Phương ph|p kiểm tra độ sống theo
phương ph|p Koch.
BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC
2014


17

1.2.7. Đ|nh gi| ảnh hưởng của Trichoderma, B.
subtilis, B. megaterium và B. pumilus lên sự sinh
trưởng v{ ph|t triển của một số loại rau: rau roman,
rau cải ngọt, hạt cải bẹ xanh
C|ch bố trí thí nghiệm:
- C|c loại c}y được trồng trên c|c khay có kích
thước như nhau v{ chứa cùng một loại đất với trọng
lượng như nhau l{ 3kg đất v{ được chia th{nh c|c lô
như sau:

 Lô đối chứng: Là lô trồng không có chế phẩm
vi sinh chỉ có đất.
 Lô thử nghiệm 1: Trong đất trồng có chứa
sinh khối c|c chủng vi sinh vật nghiên cứu được trộn
đều theo tỉ lệ: 0,33%; 1% v{ 1,66%.
Mỗi lô trồng 5 c}y rau v{ lặp lại trên 3 khay.
- Theo dõi sự sinh trưởng v{ ph|t triển của c}y
bằng c|ch đo chiều d{i của th}n, l|, số l| v{ mô tả
hình d|ng c}y theo thời gian ph|t triển.
- Quan s|t sự ph|t triển của bộ rễ c}y rau.
1.2.8. Phương ph|p xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương ph|p thống kê sinh
học, so sánh và phân tích kết quả. Các số liệu được
biểu thị dưới dạng trung bình, biểu đồ v{ được xử lý
theo phần mềm SPSS và phần mềm Microsoft Excel.
2. Kết quả và bàn luận

Bảng 2.1. Đường kính vòng phân giải cellulose
của Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B.

pumilus

Tên chủng
Đường kính vòng phân giải
(cm)
Trichoderma
2
B. subtilis
5,7
B. megaterium
2
B. pumilus
0

Celulose l{ một cơ chất không ho{ tan, khó
phân giải, là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế
bào thực vật. Việc tổng hợp cellulose có quy mô
phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất
kh|c. Do đó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò
đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn
Cacbon, cải tạo cấu trúc đất, tăng độ tho|ng khí, độ
phì nhiêu, m{u mỡ cho đất. Trong qu| trình đó
chúng tạo ra c|c chất dinh dưỡng dễ tiêu trong đất
cung cấp cho c}y, một v{i chất có khả năng kích
thích sinh trưởng của c}y trồng.
a b c d
e f g h
i j

Hình 2.1. Hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế

bào của các chủng vi sinh vật
a. Khuẩn lạc Tricoderma; b: Bào tử Tricoderma;
c. Khuẩn lạc B. subtilis; d. Bào tử B. subtilis;
e. Khuẩn lạc B. megaterium; f. Bào tử B.megaterium;
g. Khuẩn lạc B .pumilus; h. Bào tử B.pumilus;
i. Khuẩn lạc nấm Fusarium; j. Bào tử Fusarium.

BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC
2014


18

Kết quả bảng 2.1 cho thấy c|c chủng
Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium đều có khả
năng thủy ph}n CMC, trong đó chủng B. subtilis có
khả năng thủy ph}n tốt nhất với đường kính vòng
ph}n giải l{ 5,7 cm, riêng vi khuẩn B. pumilus không
có hoạt tính cellulase nên không tạo th{nh vòng ph}n
giải CMC.







Hình 2.2. Vòng thủy phân CMC của các chủng vi
sinh vật
a. Trichoderma; b. B. subtilis;

c. B. megaterium; d: B. pumilus
Bảng 2.2. Khả năng đối kháng của Trichoderma
với nấm Fusarium
Tên chủng
Tricho-
derma
Fusa
rium
Trichoderma +
Fusarium
Trichoderm
a
+
+
- Trichoderma: +
- Fusarium: -
B. subtilis
+
+
- B. subtilis: +
- Fusarium: -
B.
megaterium
+
+
- B. megaterium: -
- Fusarium: +
B. pumilus
+
+

- B. pumilus : +
- Fusarium: -
Ghi chú: (+) : Phát triển tốt; (-) : Không phát triển
Kết quả bảng 2.3 cho thấy, khi cấy kiểm tra riêng
rẽ từng chủng Tricoderma, B. subtilis, B. pumilus, B.
megaterium và Fusarium trên môi trường thạch đặc
trưng quan s|t thấy mỗi chủng đều ph|t triển tốt trên
môi trường thạch.Tuy nhiên khi nuôi cấy chung từng
chủng nghiên cứu với nấm gây bệnh Fusarium, nhận
thấy:
- Chỉ có nấm Tricoderma, B. subtilis, B. pumilus
ph|t triển, không thấy khuẩn lạc của Fusarium trong
môi trường thạch PGA v{ môi trường thạch YE. Điều
đó chứng tỏ trong nấm Tricoderma đ~ tiết ra một loại
enzym có khả năng l{m tan v|ch tế b{o của nấm g}y
bệnh Fusarium, sau đó chúng có thể tấn công v{o bên
trong lo{i nấm n{y v{ tiêu thụ chúng nên Fusarium
không ph|t triển được [13].
- Tương tự, vi khuẩn B. subtilis vẫn ph|t triển
được vì vi khuẩn n{y có nhiều đặc điểm ưu việt về
khả năng tiết c|c hệ enzym ngoại b{o v{ những chất
kh|ng khuẩn, nhất l{ chúng còn có khả năng tổng
hợp hơn 20 loại kh|ng sinh kh|c nhau trong đó đặc
biệt kh|ng sinh Bacilysocin l{ loại kh|ng sinh có bản
chất phospholipid có tính kh|ng khuẩn mạnh với
nấm [3],[4], do đó đ~ ức chế hoặc tiêu diệt được nấm
Fusarium nên không tìm thấy sự có mặt của loại nấm
n{y trên môi trường khi nuôi cấy chung với nhau.
- Đối với vi khuẩn B .pumilus cũng có khả năng
lấn |t được sự ph|t triển của nấm Fusarium vì ngoài

chức năng thúc đẩy Rhizobacteria l{m tăng trưởng
thực vật trong vùng rễ của c}y, B. pumilus cũng cảm
ứng tính kh|ng của c}y để chống lại bệnh nấm có thể
g}y thiệt hại cho c}y [2] vì vậy không tìm thấy nấm
Fusarium trong môi trường.
Trong bốn chủng khảo s|t, chỉ có vi khuẩn B.
megaterium không có khả năng lấn |t nấm Fusarium
nên chúng vẫn ph|t triển trong môi trường. Điều n{y
có thể l{ do những hoạt chất sinh học do vi khuẩn B.
megaterium tiết ra không phù hợp hoặc chưa đủ
mạnh để ức chế sự ph|t triển của nấm Fusarium.

a b c d
a
b
c
Hình 2.3.
a. Nấm Tricoderma;
b. Nấm Fusarium;
c. Nấm Tricoderma
ph|t triển trên môi
trường PGA từ dung
dịch nuôi cấy chung
2 chủng trên.

Hình 2.4.
a. Vi khuẩn B. subtilis;
b.Nấm Fusarium;
c.Vi khuẩn B. subtilis
phát triển từ dung

dịch nuôi cấy chung 2
chủng trên


b
c
a
a
c
b
Hình 2.5.
a. Vi khuẩn B.
megaterium;
b. Nấm Fusarium;
c. Nấm Fusarium
ph|t triển trong môi
trường thạch dinh
dưỡng từ dung dịch
nuôi cấy chung 2
chủng trên

BẢN TIN KHOA HỌC VÀ GIÁO DỤC
2014


19

2.3. Sơ đồ nuôi cấy thu sinh khối nấm
Trichoderma



2.4. Sơ đồ nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn B.
subtilis, B. megaterium và B. pumilus




c
a
b
Hình 2.6.
a. Vi khuẩn B.
pumilus;
b.Nấm Fusarium;
c. Vi khuẩn B.

pumilus ph|t triển
trong môi trường
PGA thạch từ môi
trường nuôi cấy
chung 2 chủng trên

Chủng giống Trichoderma

Ho{n nguyên ở 30
o
C/24 giờ
Kiểm tra độ sống

Nh}n giống cấp I ở 30
o
C/ 5-7 ngày
Nh}n giống cấp II ở 30
o
C/ 5-7 ngày
Nh}n giống thu sinh khối ở 30
o
C/5-7 ngày
Thu sinh khối
Thử nghiệm


2.5. Kết quả kiểm tra độ sống
Sau khi nuôi cấy thu được sinh khối c|c
chủng nghiên cứu, tiến h{nh kiểm tra số lượng tế
b{o có trong 1gam sinh khối, kết quả được trình

bày qua bảng 2.3:
Bảng 2.3. Kết quả kiểm tra độ sống nấm
Trichoderma, B. subtilis, B. megaterium và B.
pumilus


Tên chủng
Số lượng tế bào
(CFU/gam)
GTTB
(CFU/gam)
L1
L2
L3
Trichoderma
9 . 10
8

16 . 10
8

11 . 10
8

12 . 10
8

B. subtilis
3. 10
11

2.10
11

4 . 10
11

3 . 10
11

B. Megaterium
5 10
10

5 . 10
10

6 . 10
10

5.3 . 10
10

B. pumilus
4 . 10
11

5 . 10
11

4 . 10
11

4.3 . 10
11



Kết quả bảng 2.3 cho thấy sinh khối thu
được từ 3 loạt theo sơ đồ sản xuất trên có số
lượng tế b{o trong 1gam sinh khối thu được đạt
chỉ tiêu kỹ thuật (>10
6
CFU/gam) (Theo một số tiêu
chuẩn Việt Nam v{ tiêu chuẩn ng{nh về ph}n
bón)[1]. Trong đó đạt cao nhất l{ vi khuẩn B.
pumilus và B. subtilis (10
11
CFU/gam) v{ thấp nhất
là Trichoderma chỉ đạt 10
8
CFU/gam. Điều đó cho
thấy việc chọn môi trường v{ c|c điều kiện nuôi
cấy phù hợp sẽ giúp đạt hiệu quả cao khi thu sinh
khối, nhưng đối với nấm Trichoderma tỏ ra chưa
phù hợp nên độ sống sinh khối vẫn chưa cao.

(Phần còn lại đăng tiếp trong số 06 (7/2014)