Tài liệu Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật ppt

1

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật
Nguyễn Hoàng Lộc
Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế

1. Các hợp chất thứ cấp thực vật
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm
có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình
thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ.
Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là
sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ
cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002).
Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên
tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein,
nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vậ
- - (họ
Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần
giống nhau. Đôi khi toàn câ
- -
(họ
Taxaceae).
dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin...), một số khác tác dụng
dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994).
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung
môi. Giống như những
, ví dụ monoterpene
chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị
isoprene (Lee 2001).
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic

glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược
phẩm (Lee 2001).

2. Nuôi cấy tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá
trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào
vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các
hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực
nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung
2

cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật
nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004).
Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp
từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt
quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao
như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy
tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy
nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài
trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên
ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ
cấp (Lee 2001).
Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn
trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ
dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn
trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu
nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền
phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của
tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng
cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994).

Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm
là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé
nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn
dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ
xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù
thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự
với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng.

3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật
Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp
nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa
về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị
có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công
nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế
bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để
nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu
cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp
sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp
chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với
khí hậu và điều kiện đất trồng; (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất
thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng); (3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho
nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; (4) với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của
3

tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên
cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật
cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999).
Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều
kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu
được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác

nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi
cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi
ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy
thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các
chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004).
Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH
môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và
ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều
(Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích
lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều
kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố
cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là
một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài
hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó
phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên
(Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được
sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn
lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau
3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L.
Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng
hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số
hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng
lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ.
Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả
trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung
phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra
rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích
lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi
cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004).

Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp
trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ
thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ
máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm
hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học
và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các
4

hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất
cao (DiCosmo và Tallevi, 1985).

4. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học
Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính
toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng
các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa.
Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề
đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của
điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn
để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công
nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực
vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Bảng 2 giới
thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế
bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004).
Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả
năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm
1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử
nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng
taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có
tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác
(Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm

mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị
hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng
này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ
thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị
ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm
(Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu
sử dụng ngày càng tăng trong y học.
Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp
ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay,
việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng
dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-
Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác
lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu
quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu
sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại
Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn
gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi
trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol.
Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của
cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được
5

sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt
động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana
bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được
nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn
lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm
imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng
độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate
và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin.

Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai
trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ
tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung
vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày
nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng
hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi
phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.
Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ
của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato
(1981) C. japonica. Sau
đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10
-8
M
gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa
1994).
Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử
dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn
tiêu hóa, bệnh đái đường,
sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích
thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P. ginseng để phân lập saponins và
sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công
nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung
nghiên cứu nhiều nhất.
Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách
gây nhiễm chủng A
4
của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một
spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm
lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ

không biến nạp chủng A
4
8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng
của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy
bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần
so với đối chứng.
Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của
cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình
tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi
trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho
tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối