Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt 5 năm học tại trường Đại Học Bách Khoa – ĐH Đà Nẵng, em đã học
hỏi và tích lũy được rất nhiều kiến thức quý giá, cũng như nhiều kinh nghiệm trong học
tập hay hoạt động ngoại khóa…Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các thầy
cô đã và đang công tác tại ngơi trường này, các thầy cơ trong khoa Hóa, đặc biệt là các
thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã dạy dỗ, chỉ bảo và nhiệt tình giúp đỡ em
trong suốt thời gian em ngồi trên ghế nhà trường.
Trong suốt quá trình em thực hiện đề tài này, em xin chân thành gởi lời cảm ơn
đến thầy giáo TS. Đặng Đức Long, thầy ThS. Tạ Ngọc Ly đã hướng dẫn tận tình, chỉ
bảo em, và cho em lời khuyên khi em vấp phải những khó khăn và có thể hoàn thành
được đề tài.
Em cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các cán bộ y tế của các cơ sở y tế trên
địa bàn Đà Nẵng cũng như các cán bộ ở phịng thí nghiệm của trường Đại học Duy Tân
đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong thời gian em đi thu nhận mẫu
và hồn thành được các hạng mục cần có trong đề tài. Em cũng xin cảm ơn chân thành
tới các thầy cơ phụ trách phịng thí nghiệm bộ mơn Công Nghệ Sinh Học trường Đại
Học Bách Khoa Đà Nẵng và các anh chị khóa trên đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để
giúp em hồn thành những thí nghiệm.
Con cũng xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, anh chị em trong nhà đã cố gắng tạo
mọi điều kiện thuận lợi, tốt nhất và động viên con trong những lúc khó khăn để con có
thể hồn thành tốt tất cả mọi việc trong suốt quá trình học tập. Mình cũng xin gửi lời
cảm ơn đến tất cả các bạn bè của mình đã ln ủng hộ và động viên mình.
Trong thời gian làm đồ án khơng tránh khỏi những thiếu sót, em mong thầy cơ
thơng cảm và bỏ qua cho em.
Đà Nẵng, ngày 04 tháng 06 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Trần Thị Bích Ngọc
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang i

Đồ án tốt nghiệp
Long

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

GVHD : TS.Đặng Đức

Trang ii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN

i

MỤC LỤC ii
DANH MỤC HÌNH VẼ vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii
TÓM TẮT LUẬN VĂN ix

ABSTRACT x
LỜI MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. Ung thư vú và các vấn đề liên quan.........................................................................3
1.1.1.Khái niệm ung thư vú............................................................................................3
1.1.2. Tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới và trong nước.................................3
1.1.3. Vấn đề chẩn đoán ung thư vú...............................................................................4
1.1.3.1. Chẩn đoán lâm sàng...........................................................................................4
1.1.3.2. Phương pháp chẩn đoán cận lâm sàng hiện nay.................................................5
1.2. Chỉ điểm sinh học ung thư và microRNA................................................................6
1.2.1. Chỉ điểm sinh học ( bio-maker) – chỉ điểm sinh học ung thư...............................6
1.2.1.1. Chỉ điểm sinh học ( bio-maker).........................................................................6
1.2.1.2. Chỉ điểm sinh học của ung thư..........................................................................7
1.2.2. Tổng quan về microRNA......................................................................................9
1.2.2.1. Khái niệm..........................................................................................................9
1.2.2.2. Cơ chế hình thành miRNA................................................................................9
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang iii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

1.2.2.3. Chức năng và vai trò của miRNA trong cơ thể...............................................10
1.2.2.4. Tác động của miRNA lên ung thư nói chung...................................................11
1.2.2.5. Đặc tính miRNA trong hệ thống máu..............................................................12
1.3. Giới thiệu một số miRNA dùng trong chẩn đoán ung thư vú.................................13
1.4. Giới thiệu một số phương pháp định lượng miRNA..............................................15
1.4.1. Phương pháp Microarray....................................................................................15
1.4.2. Giải chuỗi trình tự microRNA (miRNA sequencing hay miRNA-seq)...............16
1.4.3. Phương pháp qRT-PCR.......................................................................................16
1.4.3.1. Phản ứng PCR ( Polymerase Chain Reaction )................................................16
1.4.3.2. Phản ứng real time PCR...................................................................................17
1.4.3.3. Nguyên tắc thực hiện phản ứng realtime PCR bằng đầu dò Taqman...............18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

21

2.1. Mục đích nghiên cứu.............................................................................................21
2.2. Vật liệu và phương pháp tiến hành........................................................................21
2.2.1. Mẫu nghiên cứu..................................................................................................21
2.2.2. miRNA dùng trong nghiên cứu...........................................................................21
2.2.3. Quy trình thực hiện tổng qt............................................................................22
2.2.4. Hóa chất.............................................................................................................. 23
2.2.5. Dụng cụ và thiết bị..............................................................................................24
2.2.4.1. Dụng cụ...........................................................................................................24
2.2.4.2. Thiết bị.............................................................................................................24
2.3 Thu và tách chiết tổng small RNA từ huyết thanh..................................................24
2.3.1. Thu thập mẫu máu và li tâm tách huyết thanh....................................................24

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang iv


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

2.3.1.1. Mẫu thí nghiệm................................................................................................24
2.3.1.2. Phương pháp thực hiện....................................................................................25
2.3.1.3. Phương pháp bảo quản mẫu.............................................................................25
2.3.2. Thu nhận và tách chiết tổng small RNA từ huyết thanh......................................25
2.3.2.1. Mẫu thí nghiệm................................................................................................25
2.3.2.2.Phương pháp tiến hành.....................................................................................25
2.3.3. Kiểm tra nồng độ tổng small RNA sau khi tách chiết.........................................28
2.3.3.1. Mẫu thí nghiệm................................................................................................28
2.3.3.2. Phương pháp tiến hành....................................................................................28
2.3.3.3. Cách tiến hành.................................................................................................28
2.4. Thực hiện phản ứng định lượng realtime -PCR.....................................................29
2.4.1. Phương pháp tiến hành.......................................................................................29
2.4.2. Thiết kế mồi đặc hiệu sử dụng trong đề tài.........................................................30
2.4.3. Quy trình thực hiện phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA..................................32
2.4.4. Thực hiện phản ứng RT-PCR ( singleplex) cho 4 mục tiêu : miR-155, miR-195,
miR-16 và miR-21........................................................................................................34
2.5. Xử lí số liệu...........................................................................................................35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

36

3.1. Thống kê tình hình nhóm bệnh nhân có bệnh........................................................36
3.2. Kết quả đo nồng độ RNA......................................................................................37
3.3. Giai đoạn chạy phản ứng Reverse Transcription...................................................40
3.4. Kết quả chạy realtime –PCR..................................................................................41
3.4.1. Biểu đồ khuếch đại của realtime PCR cho các mẫu............................................41
3.4.2. Giá trị chu kì ngưỡng Ct.....................................................................................42
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang v


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

3.4.3. So sánh mức độ biểu hiện tương đối miRNA của 2 nhóm đối tượng..................43
3.4.4. Giá trị fold change của nhóm bị bệnh.................................................................45
3.4.5. Mối quan hệ giữa tình trạng bệnh nhân và giá trị fold change............................46
3.5. Kiểm chứng miR-16 – miRNA reference..............................................................48
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................51
4.1. Kết luận.................................................................................................................51
4.2. Kiến nghị...............................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO

53

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang vi

Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1 : Các loại ung thư vú........................................................................................3
Hình 1.2 : Tỉ lệ các loại ung thư của Việt Nam...............................................................4
Hình 1.3 : Các triệu chứng của bệnh ung thư vú.............................................................4
Hình 1.4 : Cơ chế hình thành miRNA..........................................................................10
Hình 1.5 : Cơ chế tác động của miRNA.......................................................................11
Hình 1.6 : Đường biểu diễn nhân bản ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống
phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kì nhiệt..............................18
Hình 1.7 : Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong các chu kì nhiệt...........19
Hình 2.1 : Hình ảnh ống nghiệm đựng máu..................................................................25
Hình 2.2 : Sơ đồ quy trình tách chiết thu tổng small RNA bằng mirVana

TM

PARISTM

KIT............................................................................................................................... 27
Hình 2.3 : Máy đo NanoDrop 2000..............................................................................28
Hình 2.4 : Phản ứng realtime-PCR 2 giai đoạn.............................................................30
Hình 2.5 : Cấu trúc mồi RT stem – loop.......................................................................31
Hình 2.6 : Cấu trúc tổ hợp mồi cho phản ứng RT-PCR định lượng miRNA.................31
Hình 2.7 : Sơ đồ quy trình thực hiện phản ứng phiên mã ngược..................................33
Hình 2.8 : Sơ đồ quy trình thực hiện phản ứng realtime-PCR......................................34

Hình 3.1 : Biểu đồ khuếch đại realtime PCR................................................................41
Hình 3.2 :Biểu đồ thể hiện giá trị Ct trung bình............................................................42
Hình 3.3 : Biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa giá trị RQ của các miRNA mục tiêu
và các mẫu.................................................................................................................... 45
Hình 3.4 : Biểu đồ khuếch đại của miR-16 ở 2 nhóm đối tượng...................................49
Hình 3.5 : Biểu đồ giá trị Ct của miR-16 qua từng mẫu...............................................49
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang vii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Thống kê một số chỉ điểm sinh học đối với mỗi loại ung thư.........................8
Bảng 2.1. Trình tự các miRNA dùng để định lượng.....................................................22
Bảng 3.1. Bảng thống kê tình hình bệnh nhân..............................................................36
Bảng 3.2. Bảng thống kê độ tuổi 2 nhóm bệnh.............................................................36
Bảng 3.3. Kết quả đo nồng độ RNA.............................................................................38
Bảng 3.4. Thống kê giá trị trung bình nồng độ RNA và A260/280 của 2 nhóm đối tượng 39
Bảng 3.5. Bảng tổng hợp giá trị Ct trung bình..............................................................43
Bảng 3.6. Bảng thống kê fold changes của các miRNA...............................................44
Bảng 3.7. Giá trị RQ của các mẫu bệnh.......................................................................46
Bảng 3.8. Bảng thống kê mối quan hệ tương quan giữa tình trạng bệnh nhân và giá trị
fold change của các miRNA mục tiêu...........................................................................47

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang viii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic acid
RNA : Rinonucleid acid
cDNA : complement DNA
mRNA : RNA thông tin
miRNA : microRNA
PCR : Polymerase Chain Reaction
qRT-PCR : quantification realtime- polymerase Chain Reaction
RT : Reverse Transcription
Ct : Cycle threshold
RQ : Relative Quantitation = fold change

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang ix


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Theo các kết quả nghiên cứu gần đây, các microRNA (miRNA) là một ứng cử
viên tốt trong vai trò là chất chỉ điểm sinh học trong việc phát hiện và chẩn đoán sớm
bệnh ung thư vú. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi khảo sát nồng độ của
miRNA trong huyết thanh với đối tượng là bệnh nhân là người Việt Nam, để từ đó xây
dựng cơ sở để áp dụng miRNA vào việc chẩn đoán ung thư vú trong tương lai. Nồng độ
tương đối của các miRNA : miR-155, miR-195, miR-21 và miR-16 của huyết thanh 26
bệnh nhân ung thư vú, và 8 người phụ nữ khỏe mạnh được đo bằng phương pháp dùng
Taqman MicroRNA Assay. Kết quả thu được cho thấy hầu hết, tất cả các mẫu đều tách
ra được tổng các RNA nhỏ (bao gồm các miRNA), tuy nhiên lượng tách ra không đều
nhau và chênh lệch khá lớn; sự biểu hiện của các miRNA : miR-155 và miR-21 trong
huyết thanh người bệnh có khuynh hướng giảm so với nhóm khỏe mạnh, cịn miR-195
thì lại thấy có sự tăng so với nhóm khỏe mạnh ( gấp 1,33 lần), nên miR-195 được xem là
miRNA có sự khác biệt rõ nhất. Nghiên cứu bước đầu này cho thấy có sự thay đổi nồng
độ miRNA trong 2 nhóm này khác nhau, chứng tỏ tiềm năng phát triển hướng chẩn
đoán mới cho bệnh ung thư vú bằng mức độ biểu hiện miRNA này trong huyết thanh
người.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang x


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

ABSTRACT

According to recent researches, microRNAs are good candidates as bio-marker in the
detection and diagnosis of breast cancer. In this study, we investigated the levels of
miRNAs in serum of Vietnamese patients for the first time in order to lay a foundation
of the diagnosis of breast cancer by miRNAs in the future. The relative concentrations of
the following miRNAs: miR-155, miR-195, miR-21 and miR-16 in serum of 26 patients
with breast cancer and 8 healthy woman strong as measured by TaqMan MicroRNA
assay. The results show that from most of the samples, total small RNAs (including
miRNAs) are isolated, however in different quantities and the differences are quite large.
The expressions of miR-155 and miR-21 in the serum of breast cancer patients tends to
decrease compared to the healthy group, and of miR-195 is increasing compared to
healthy group (about 1.33 times); so miR-195 is considered the most different miRNA
between the two groups. This initial study shows that there is a change in miRNA levels
in the two different groups, hence it is worth to investigate the new direction of
diagnosis of breast cancer using miRNA levels in human serum.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xi


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

LỜI MỞ ĐẦU
Hiện nay, sinh học phân tử là một trong những lĩnh vực được nghiên cứu, phát
triển và ứng dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở trong nước. Sinh học phân tử cũng
được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực công nghiệp, nơng nghiệp như là tạo ra nhiều
biến chủng có năng suất cao trong việc sản xuất các sản phẩm có ích cho con người, tạp

ra các sản phẩm biến đổi gen…; trong lĩnh vực y học, lĩnh vực này được ứng dụng rất
nhiều. dùng để chẩn đoán bệnh ( do virut, vi khuẩn gây ra), dùng trong các xét nghiệm
DNA, nghiên cứu trong việc điều trị bệnh…
Hiện nay, ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế
giới, Việt Nam ta cũng không ngoại lệ và ung thư vú – là ung thư thường gặp nhất ở nữ
(đặc biệt là phụ nữ ở các nước đang phát triển). Tuy nhiên, việc phát hiện bệnh này ở
trong nước thường phát hiện khá muộn nên việc điều trị gặp nhiều khó khăn. Hiện nay
việc chẩn đốn ung thư chủ yếu dựa trên những chỉ tiêu sinh hóa, kĩ thuật nội soi hoặc
thủ thuật xâm lấn…Những phương pháp này có hạn chế là thường chỉ phát hiện được
các khối u đã phát triển nên kết quả nhiều khi không kịp thời. Hơn nữa, các phương
pháp cổ điển này gây nhiều khó khăn về mặt tâm lý, gây đau khi chọc hút và có thể kích
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

thích di căn. Vì thế các phương pháp cổ điển này tuy chính xác nhưng khơng thích hợp
trong việc kiểm tra định kỳ, tầm sốt ung thư cho đơng đảo người dân.
Vì vậy, cần phải dùng phương pháp chẩn đốn bệnh khác có khả năng phát hiện
bệnh ở giai đoạn sớm, cho kết quả nhanh chóng và chính xác, mẫu xét nghiệm dễ lấy và
rẻ tiền. Cho nên, việc phát hiện các chỉ điểm sinh học phân tử gắn liền với việc phát sinh
và quá trình phát triển của ung thư là việc cần thiết để phát hiện nhanh chóng và theo dõi
điều trị căn bệnh này. Việc xác lập các chỉ điểm sinh học được kiểm nghiệm lâm sàng
như thế đang được nghiên cứu mạnh mẽ trên thế giới.
Việc ứng dụng sinh học phân tử vào chẩn đoán bệnh ung thư là rất thiết thực, và

có ý nghĩa thực tiễn, cho nên, em đã chọn đề tài “Nghiên cứu ứng dụng các chỉ thị
phân tử miRNA trong chẩn đoán bệnh ung thư vú” làm đề tài cho đồ án tốt nghiệp.
Mục tiêu đề tài là so sánh mức độ biểu hiện nồng độ các miRNA mục tiêu, sử
dụng các loại sau : miR-155, miR-195, miR-21 và miR-16 giữa nhóm đối tượng có bệnh
ung thư vú và nhóm khỏe mạnh, so sánh giữa những giai đoạn, tình hình phát triển bệnh
khác nhau. Từ đó, một phần nào cũng có thể đánh giá sự ảnh hưởng của miRNA lên sự
phát triển của bệnh ung thư vú.

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xiii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ung thư vú và các vấn đề liên quan
1.1.1.Khái niệm ung thư vú
Ung thư vú được định nghĩa là bất cứ một u (bướu) ác tính nào có trong vú. Sự
phát sinh ung thư vú, cũng giống như các dạng ung thư khác, là hậu quả của sự rối loạn
trong quá trình tái sản xuất tế bào[38].
Ung thư vú là loại bệnh trong đó các tế bào ác tính (ung thư) được phát hiện
trong các mơ của vú. Những tế bào này thường phát sinh từ các ống dẫn hoặc tiểu thùy ở
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xiv

Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

vú, sau đó có thể lây lan sang các mô, cơ quan và các bộ phận khác của cơ thể[39].U có
thể lan đến xương, phổi, và gan[38].

Hình 1.1 : Các loại ung thư vú [41].
1.1.2. Tình hình mắc bệnh ung thư vú trên thế giới và trong nước
Ung thư là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới, trong đó Việt Nam là
một trong những nước có tỉ lệ tử vong do ung thư cao nhất. Theo thống kê, trên tồn cầu
tính đến đầu năm 2002, số người mắc bệnh ung thư hiện đang sống trên 5 năm sau chẩn
đoán là 24.570.000 người, trong số này ung thư vú có khoảng 4,4 triệu người, đại trực
tràng là 2,83 triệu người và tiền liệt tuyến là 2,36 triệu người. Độ lưu hành này tuỳ thuộc
bởi nhiều yếu tố như địa dư (châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ…), mức sống (nước
giàu, nước nghèo) và loại ung thư [56,57].
Trong đó, ung thư vú : là loại ung thư thường gặp nhất ở nữ (chiếm khoảng 23%
tổng số các loại ung thư), đặc biệt phụ nữ ở các nước đang phát triển. Tỉ lệ ung thư vú
tăng cao ở tuổi 50, 60 và cao nhất ở độ tuổi 70. Dự báo tần suất mắc bệnh là 111/
100.000 dân vào những năm đầu của thế kỷ 21 [56].

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xv


Cài đặt máy PCR với thông
số : án tốt nghiệp

Đồ

GVHD : TS.Đặng Đức

Long
- Run mode: Standard
- Lượng thể tích phản ứng:
20µl
- Cài đặt chu trình nhiệt

Hình 1.2 : Tỉ lệ các loại ung thư của Việt Nam [42].
Theo Bộ Y tế, cứ 10 phụ nữ Việt thì một người có nguy cơ bị ung thư vú, tỷ lệ
được xem là quá cao. Trong đó, chỉ có 39,6% người bệnh được phát hiện trong giai đoạn
sớm, có tới 60,4% bệnh nhân đến bệnh viện khi bệnh đã ở giai đoạn muộn khiến việc
điều trị gặp nhiều khó khăn, nhất là trong bối cảnh nền y tế nước nhà chưa có nhiều đột
phá trong việc điều trị ung thư [58].
1.1.3. Vấn đề chẩn đốn ung thư vú
1.1.3.1. Chẩn đốn lâm sàng

Hình 1.3 : Các triệu chứng của bệnh ung thư vú [58].
Các yếu tố gây ra bệnh ung thư vú hiện nay chưa rõ ràng. Liên quan tới cả yếu tố
về môi trường cũng như di truyền. Một số yếu tố như tiền sử gia đình bị ung thư vú, bắt
đầu có kinh nguyệt sớm hoặc các yếu tố nguy cơ khác. Vì nguyên nhân ung thư vú vẫn
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xvi


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

xác định, nên bất kỳ ai cũng có nguy cơ mắc bệnh, đặc biệt là khi chúng ta đang ở độ
tuổi 40 trở lên [43].
Chẩn đoán lâm sàng dựa vào các dấu hiệu và triệu chứng sau : [43]


Một cục cứng không đau ở vú



Liên tục ngứa và phát ban xung quanh núm vú



Chảy máu hoặc tiết dịch bất thường từ núm vú



Da trên vú bị sưng và dày lên



Da trên vú bị trũng hay nhăn nheo



Núm vú bị kéo vào hoặc thụt vào
Với tỷ lệ chết do bệnh rất cao, việc điều trị rất phức tạp và đắt tiền nên tác động

của căn bệnh ung thư này đến đời sống xã hội trên tồn thế giới rất nghiêm trọng.
1.1.3.2. Phương pháp chẩn đốn cận lâm sàng hiện nay
Chẩn đoán xác định ung thư vú chủ yếu dựa vào bộ ba kinh điển: triệu chứng lâm
sàng, chụp X quang tuyến vú và xét nghiệm tế bào học [43].
- Triệu chứng lâm sàng : khối u vú thường không gây đau, một số trường hợp có
chảy dịch đầu vú (dịch máu hoặc dịch vàng chanh) u có mật độ cứng rắn, mặt gồ ghề,
ranh giới có thể rõ hoặc khơng. Trong những trường hợp đến muộn, u có thể xâm lấn
vào thành ngực làm hạn chế di động hoặc xâm nhiễm da tạo hình ảnh "sần da cam" hoặc
vỡ loét, đôi khi ung thư vú cũng biểu hiện như một viêm tấy lan toả vùng vú (ung thư vú
thể viêm) [43]. Trong nhiều trường hợp bệnh nhân thường có hạch nách cùng bên, hạch
có thể có các mức độ tổn thương từ mềm đến cứng hoặc xâm nhiễm dính vào xung
quanh tuỳ theo mức độ tiến triển bệnh. Trong mọi trường hợp đều phải lưu ý khám hạch
thượng đòn và tuyến vú đối bên [43].
- Chụp X quang tuyến vú: tổn thương điển hình có dạng hình sao nhiều chân, co
kéo tổ chức tuyến vú, có nhiều chấm vi can xi hố tập hợp thành đám [43].
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xvii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

- Xét nghiệm tế bào học: thường thấy các tế bào ung thư mất sự kết dính, đa hình
thái, tỷ lệ nhân/ngun sinh chất tăng, nhiều nhân quái nhân chia, bào tương kiềm
tính[43].
Khi cả ba phương pháp trong bộ ba kinh điển đều cho kết quả dương tính thì có thể

đi đến chẩn đốn xác định. Nếu một trong ba phương pháp này nghi ngờ, bác sỹ lâm
sàng có thể chỉ định sinh thiết kim, sinh thiết tức thì hoặc sinh thiết mở thường quy để
khẳng định chẩn đoán[43].
Các xét nghiệm đánh giá chung và đánh giá tình trạng di căn xa: xét nghiệm máu,
sinh hố, siêu âm, X-quang…
Những phương pháp này có hạn chế là thường chỉ phát hiện được các khối u đã
phát triển nên kết quả nhiều khi không kịp thời. Hơn nữa, các phương pháp cổ điển này
gây nhiều khó khăn về mặt tâm lý, gây đau khi chọc hút và có thể kích thích di căn. Vì
thế các phương pháp cổ điển này tuy chính xác nhưng khơng thích hợp trong việc kiểm
tra định kỳ, tầm soát ung thư cho đông đảo người dân.
Để giải quyết vấn đề này, việc tìm ra các chỉ điểm sinh học (bio-markers) gắn liền
với việc phát sinh và quá trình phát triển của ung thư để có thể chẩn đốn nhanh chóng,
thuận lợi và tương đối chính xác căn bệnh này đem lại hiệu quả to lớn trong việc phòng
chống, phát hiện và điều trị ung thư. Một phân tử chỉ điểm sinh học của ung thư lý tưởng
sẽ dễ lấy mẫu, được đo một cách chính xác, có độ nhạy cao và rẻ tiền. Việc xác lập các
chỉ điểm sinh học được kiểm nghiệm lâm sàng như thế đang được nghiên cứu mạnh mẽ
trên thế giới.
1.2. Chỉ điểm sinh học ung thư và microRNA
1.2.1. Chỉ điểm sinh học ( bio-maker) – chỉ điểm sinh học ung thư
1.2.1.1.Chỉ điểm sinh học ( bio-maker)
Bio-marker hay “dấu ấn sinh học” ( chỉ điểm sinh học ) là những phân tử biểu hiện
một dữ kiện sinh học. Bio-marker có thể đơn thuần là hóa chất, như glucose là dấu ấn
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xviii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

của bệnh tiểu đường, hoặc phân tử protein như các kháng thể (antibody) là dấu ấn của
bệnh nhiễm trùng, và gene hay DNA marker là dấu ấn cho các bệnh liên quan đến di
truyền[59].
Biomarker còn được gọi là “chữ ký” của một hiện tượng sinh học. Các nhà nghiên
cứu biomarker tin tưởng rằng chữ ký sinh học chứa đựng những bí ẩn về bệnh lý, cho
nên việc truy tìm chữ ký sinh học sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu
hiệu và lớn lao trong y học. Những ứng dụng này gồm các phương pháp chẩn đốn
chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch,
thần kinh...), hoặc các bệnh miễn nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi
trường. Biomarker cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc
[59].
1.2.1.2. Chỉ điểm sinh học của ung thư
Như đã nói ở trên, thì một trong những ứng dụng của bio-maker là sử dụng để
phát hiện và chẩn đoán các loại bệnh ung thư.
Chất chỉ điểm sinh học ung thư, được định nghĩa là các chất được xuất hiện và có
nồng độ thay đổi trong cơ thể khi cơ thể xuất hiện những tế bào ung thư. Chúng có thể là
các phân tử protein, acid nucleic, các hormone, một số enzyme hay kể cả một số tế bào
đặc biệt khác [44,45].
Dựa vào những thành tựu của kĩ thuật miễn dịch ghi dấu, người ta chia chất chỉ
điểm sinh học ung thư thành 2 loại : [45]
- Chỉ điểm tế bào : là các kháng nguyên tập trung trên bề mặt của màng tế bào như
trong bệnh Leucemi, các nội tiết tố và cơ quan thụ cảm nội tiết trong ung thư vú…[45].
- Chỉ điểm dịch thể : là những chất xuất hiện tập trung trong huyết thanh, nước tiểu
hoặc các dịch khác của cơ thể. Các chất này được tổng hợp và bài tiết từ các mô của
khối u, được giải phóng nhờ sự phân hủy tế bào khối u hoặc là sự phản ứng của cơ thể
đối với khối u [45].
Tiêu chuẩn của các chất làm chỉ điểm ung thư [44] :
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xix


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

- Khác biệt với các phân tử được tạo ra từ tổ chức lành tính bình thường, tức là
phải có tính đặc hiệu của tổ chức tế bào ung thư;
- Có tính đặc hiệu với cơ quan tổng hợp ra- cơ quan bị ung thư;
- Được giải phóng từ các tế bào khối u vào các dịch thể dễ thu nhận, như huyết
thanh, nước tiểu,…
- Nồng độ các chất đó phản ánh được tình trạng và tiến triển của bệnh, của khối u
( kích thước, sự phát triển, có hay khơng di căn, kết quả điểu trị..);
- Phát hiện được ngay cả khi có nồng độ rất thấp, có khả năng chẩn đốn, phát hiện
sớm ung thư;
- Có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
Một số chất chỉ điểm sinh học tương ứng với từng loại ung thư ( Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Thống kê một số chỉ điểm sinh học đối với mỗi loại ung thư [46]
STT

Loại ung thư

Chất chỉ điểm ung thư

1

Ung thư vú

CA 15-3, CEA, MCA, CA549, TPA

2

Ung thư buồng trứng

CA 125, CA 72 -4, CEA, AFP, hCG

3

Ung thư tử cung

CEA, SCCA

4

Ung thư tuyến tiền liệt

PSA, FPSA, PSA /FPSA, PAP, TPA

5

Ung thư tinh hoàn

AFP, NSE, βHCG

6

Ung thư đại tràng – trực tràng

CEA, CA 19-9

7

Ung thư tụy

CEA, CA 19-9, CA 72-4

8

Ung thư gan

AFP, CEA

9

Ung thư dạ dày

CA 72-4, CEA, AFP, CA 19-9

10

Ung thư thực quản

CEA, Cyfra 21-1

11

Ung thư tuyến giáp

CEA, NSE

12

Ung thư bàng quang

TPA, CEA, Cyfra 21-1

SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xx


Đồ án tốt nghiệp
Long
13

Ung thư phổi

GVHD : TS.Đặng Đức

CEA, NSE, SCC, TPA, Cyfra 21-1

CA 15-3 là chất chỉ điểm đặc hiệu cho ung thư vú, có độ đặc hiệu là 98% và độ
nhạy là 30% [46]. Và PSA là kháng nguyên đặc hiệu cho ung thư tuyến tiền liệt, có độ
đặc hiệu 91% và độ nhạy 21% [60]. Từ 2 chất chỉ điểm đặc hiệu cho 2 loại ung thư, thấy
rằng, tuy là chúng có độ đặc hiệu rất cao, đặc trưng cho từng loại ung thư riêng biệt, tuy
nhiên, độ nhạy của chúng rất thấp. Cho nên, cần tìm các loại chỉ điểm sinh học có độ
nhạy cao hơn với độ đặc hiệu tương đương.

Và theo nhiều nghiên cứu, thì các phân tử microRNA ( miRNA ) trong cơ thể
người được chứng minh có vai trị trong việc chẩn đốn và điều trị ung thư, dẫn đến nó
là một chất chỉ điểm sinh học trong việc phát hiện và chẩn đoán ung thư.
1.2.2. Tổng quan về microRNA
1.2.2.1. Khái niệm
MicroRNA (miRNA) là những phân tử RNA khơng mã hóa (noncoding RNA) có
kích thước nhỏ (từ 20 đến 25 nucleotide), có khả năng điều khiển sự biểu hiện của các
gene sau quá trình phiên mã bằng cách bám vào khu vực 3’ không dịch mã (3’-UTR) của
các RNA thông tin (mRNA) bị tác động [3,5].
1.2.2.2. Cơ chế hình thành miRNA
Trong nhân tế bào miRNA được phiên mã từ gene miRNA bởi enzyme RNA
polymerase II, tạo thành các phân tử RNA có cấu trúc “thân-vòng” (stem loop) nội phân
tử chiều dài khoảng 80 nucleotide, gọi là pri–miRNA. Pri-miRNA tiếp tục được xử lý
trong nhân tế bào bởi các enzyme cắt RNA họ RNase III, cụ thể là Drosha và
DGCR8/Pasha để cắt riêng cấu trúc “thân-vòng” để tạo ra các phân tử pre-miRNA. Các
phân tử pre-miRNAs được vận chuyển ra khỏi nhân tế bào ra tế bào chất nhờ protein
Exportin-5. Ở tế bào chất, một enzyme họ RNase III khác, Dicer, cắt phân tử premiRNA để tạo ra các phân tử microRNA “trưởng thành” có cấu trúc là các đoạn RNA
sợi đơi ngắn. Sau đó, các đoạn RNA sợi đơi này được giải xoắn bởi tác động của
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xxi


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

enzyme helicase, tạo thành sợi RNA đơn, để rồi kết hợp vào bộ máy ứng chế gene gây ra
bởi RNA (RISC) [2,3].

Hình 1.4 : Cơ chế hình thành miRNA [2,3].
1.2.2.3. Chức năng và vai trò của miRNA trong cơ thể
Kể từ khi được phát hiện vào năm 1993, lớp các phân tử miRNA đã dần dần được
chứng tỏ là tác nhân điều khiển quan trọng cho nhiều quá trình sinh học của sinh vật như
q trình phát triển, q trình tạo phơi, q trình chuyên biệt tế bào và hình thành các cơ
quan, quá trình điều khiển sự phát triển và chết đi của tế bào [9].
miRNA có thể điều tiết sự phân giải mRNA với sự hiện diện của phức hợp RISC
(RISC complex), trong trường hợp bổ sung hồn tồn, q trình này được gọi là RNAi.
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xxii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

Trong trường hợp bổ sung khơng hồn tồn với 3'UTR của mRNA, sự chuyển hoán sẽ bị
tiết giảm và bị chậm bớt [47].
Một loại phân tử miRNA có thể điều khiển ức chế sự biểu hiện của hàng chục
gene khác nhau, và trong cơ thể của sinh vật có thể có đến hàng trăm loại miRNA khác
nhau. miRNA có thể tác động lên gần 200 phiên bản RNA (RNA transcripts) và nhiều
miRNA có thể tác động ảnh hưởng điều tiết lên một Gene mã hố protein (proteincoding Gene) [2,47].

Hình 1.5 : Cơ chế tác động của miRNA[48].
Gần 70% các miRNA được phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình tạo
(sinh sản) mRNAs và các RNAs không sinh tổng hợp protein. Tuy nhiên, số cịn lại
được phát sinh độc lập, khơng phụ thuộc vào quá trình trên. Các chuyên gia ước lượng

rằng hơn 50% gene mã hóa protein của người đang bị kiểm soát bởi miRNA[47].
1.2.2.4. Tác động của miRNA lên ung thư nói chung
miRNA được chứng minh là một trong các yếu tố đóng vai trị bản lề trong q
trình tạo thành ung thư[9].
Hàng loạt các nghiên cứu trong thời gian qua đã ghi nhận vai trò của miRNA
trong mọi mặt của quá trình hình thành và phát triển của ung thư : từ quá trình phát triển
khối u, quá trình tự chết của tế bào (apoptosis), quá trình xâm lấn và di căn, cũng như
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xxiii


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

quá trình kháng thuốc của tế bào ung thư. MiRNA có thể đóng vai trò như là các gen
“gây ung thư’” (oncogene), hoặc một vài nhóm miRNA khác lại hoạt động như là các
gen ức chế khối u (tumor suppressor gene) [10,37]. Đã có nhiều bằng chứng về những
rối loạn về hoạt động của mỗi một nhóm miRNA có liên quan chặt chẽ với một loại ung
thư nhất định.
Ví dụ như các nghiên cứu về di truyền đã chỉ ra rằng cụm gene cho loại miRNA
là miR-15a và miR-16-1 bị xóa đi hay bị ức chế là nguyên nhân cho ung thư bạch cầu
lympho (chronic lymphocytic leukemia). Phân tử miRNA loại let-7 bị ức chế dẫn đến
ung thư phổi và ung thư vú. Hay miR-34a-b-c bị ức chế trong ung thư tụy, ung thư ruột
và ung thư vú. Hay như cụm miR-17~92 lại được kích thích trong ung thư tuyến lympho,
ung thư vú, phổi, ruột, dạ dày và tuyến tụy, v.v[4,14,15].
MiRNA có tiềm năng lớn để làm loại chất chỉ điểm ung thư lý tưởng vì những lý
do sau đây :

- Biểu hiện của các miRNA được chứng minh là bất thường trong bệnh ung thư
[18].
- Biểu hiện của nhiều miRNA được chứng minh gắn liền với bệnh lý, hoặc đặc
hiệu với mô và cơ quan nhất định [18].
- miRNA là các phân tử khá ổn định, đã được chứng minh để được bảo quản tốt
trong formalin, mô nhúng paraffin cũng như mẫu bệnh phẩm đơng lạnh [16,19].
Vì vậy, miRNA được xem là một hướng đi mới trong nghiên cứu chẩn đoán và
điều trị ung thư.
1.2.2.5. Đặc tính miRNA trong hệ thống máu
Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, có các miRNA liên quan đến ung thư lưu
chuyển trong hệ thống máu (trong huyết tương hoặc huyết thanh) có thể xác định rõ rang
và có thể phân định cho bệnh nhân ung thư và khỏe mạnh. Nghiên cứu đầu tiên theo
hướng này vào năm 2008, đã so sánh sự biểu hiện của các miRNA lưu chuyển trong
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xxiv


Đồ án tốt nghiệp
Long

GVHD : TS.Đặng Đức

bệnh nhân ung thư bạch huyết ( lymphoma) với mẫu đối chứng và đã chỉ ra rằng ung thư
làm thay đổi mức độ của các miRNA trong huyết thanh [7,12].
Một số tính chất của miRNA lưu thông trong hệ thống máu ( trong huyết tương
và huyết thanh): [16,17]
- Có thể được xác định rõ ràng, và giúp phân định chính xác giữ bệnh nhân ung thư
và khỏe mạnh;
- miRNA có độ bền rất tốt so với các phân tử mRNA ở trong mẫu máu hay các mẫu

sinh thiết tế bào;
- Hoạt tính khơng thay đổi đáng kể khi các mẫu huyết thanh hay huyết tương đi
qua q trình đơng đá, tan hay bị đun sơi, hay khi giữ ở nhiệt độ phịng.
Hơn nữa, các mẫu phẩm máu này rất dễ dàng thu nhận. Vì vậy, các miRNA trong hệ
thống máu có tiềm năng là phân tử chỉ thị sinh học lý tưởng trong việc nghiên cứu và
điều trị ung thư.
1.3. Giới thiệu một số miRNA dùng trong chẩn đoán ung thư vú
Một số miRNA lưu thông trong hệ thống máu đã được xác định có nồng độ khác
nhau giữa bệnh nhân ung thư vú so với những người khỏe mạnh. Thêm nữa, sự biểu hiện
của các microRNA được tăng cao trong mẫu bệnh đã hạ xuống nhiều sau phẫu thuật so
với trước khi mổ. Càng nhiều các nghiên cứu củng cố và chỉ ra rằng các miRNA lưu
chuyển trong huyết thanh có thể giúp đánh giá trong chẩn đoán ung thư vú và điều trị.
Tuy vậy, cho đến nay, vẫn chưa thể thống nhất được miRNA nào là đại diện tốt nhất cho
ung thư vú trong các miRNA được cho là có nồng độ thay đổi, bị mất kiểm soát trong
ung thư vú. Người ta cịn chưa biết liệu các miRNA tìm thấy ở nồng độ cao trong huyết
thanh của bệnh nhân ung thư vú có phải được tiết ra từ khối u, và các chức năng chính
của chúng là gì [21,22]. Hơn nữa, các nghiên cứu đã tiến hành còn hạn chế là số lượng
mẫu nghiên cứu khiêm tốn và chưa có sự thống nhất cụ thể về phương pháp tiến hành.
Một số kết quả nghiên cứu về sự liên quan giữa sự thay đổi của các miRNA với ung
thư thư vú như sau :
SVTH : Trần Thị Bích Ngọc – Lớp : 10SH

Trang xxv