Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium edta lên các vi khuẩn gram âm gây hơi thở hôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-----------------------------

PHAN THỊ NHƯ NGỌC

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA
NƯỚC SÚC MIỆNG CHỨA NISIN VÀ DISODIUM EDTA
LÊN CÁC VI KHUẨN GRAM ÂM GÂY HƠI THỞ HƠI

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học
Mã ngành:

604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học:

PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
………………………………………

Cán bộ chấm nhận xét 1:

……………………………………….
……………………………………….

Cán bộ chấm nhận xét 2:

……………………………………….
……………………………………….

Luận văn Thạc sĩ sẽ được bảo vệ tại “HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA”, ngày 11 tháng 01 năm 2013.


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: PHAN THỊ NHƯ NGỌC

MSHV: 10310613

Ngày, tháng, năm sinh : 26 – 12 – 1973

Nơi sinh: Đà Nẵng

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 604280

I. TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium
EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium
EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi, với các nghiệm thức kết hợp
giữa nisin (nồng độ thay đổi từ 6.3 µg/ml đến 43.8 µg/ml) và disodium EDTA
(nồng độ thay đổi từ 10mM đến 30mM). Xác định nghiệm thức tối ưu nhất.
Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1
lên hệ vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi trên 6 đối tượng thử nghiệm. So sánh
hiệu quả của nghiệm thức nisin- disodium EDTA với một sản phẩm nước súc
miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/2012
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 11/2012
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Tp. HCM, ngày

tháng

năm 2013

Nội dung và đề cương Luận văn Thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên ngành thơng
qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN
QUẢN LÝ CHUN NGÀNH


LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS - Cơ Nguyễn Thúy Hương đã tận tình
hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ cũng như tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian
thực hiện luận văn.
Xin được bày tỏ lịng biết ơn và cảm kích đối với sự giúp đỡ của các em sinh viên
bộ môn Công nghệ thực phẩm K2008, các em đã nhiệt tình cung cấp các mẫu thử
phục vụ cho thử nghiệm.
Tôi xin chân thành cám ơn bạn Tạ Thị Tuyến, Cao Xuân Yến đã giúp đỡ rất nhiều.
Cám ơn các bạn học viên cao học cùng thực hiện luận văn trong cùng khoảng thời
gian đã chia sẻ những kinh nghiệm q báu.
Cuối cùng, ln luôn ở bên cạnh và là động lực cho tôi đó là gia đình, Ba, Mẹ và
anh chị em. Tơi xin được gởi đến họ thành quả của quá trình học tập, đó chính là
cuốn Luận văn này.

Phan Thị Như Ngọc


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Tên đề tài:
Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và disodium EDTA lên
các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi.
Nội dung nghiên cứu:
1. Xác định công thức tối ưu phối hợp giữa nisin và disodium EDTA lên
hai chủng vi sinh vật Fusobacterium nucleatum và Klebsiella
pneumoniae bằng nghiên cứu in vitro.
2. Đánh giá sự giảm tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi khi sử dụng
công thức tối ưu nisin – disodium EDTA bằng khảo sát in vivo trên 6 đối
tượng.
3. So sánh hiệu quả in vivo của công thức tối ưu nisin – disodium EDTA
với một sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông
dụng trên thị trường.

Chúng tơi đã tiến hành các thí nghiệm để xác định đường kính vịng kháng khuẩn,
chọn ra nghiệm thức tối ưu in vitro và tiến hành nuôi cấy để xác định tổng số vi
khuẩn yếm khí trong các mẫu thử nghiệm in vivo.
Kết quả thí nghiệm thu được cho thấy cơng thức tối ưu đã thể hiện rõ hiệu quả của
nó trên 6 đối tượng được khảo sát:
-

Làm giảm từ 3.3 – 6.1 log10 tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi,

-

Hiệu quả diệt khuẩn trội hơn sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông
dụng trên thị trường (sản phẩm này đã được chứng nhận lâm sàng về khả
năng diệt vi khuẩn gây hôi miệng, mảng bám và viêm nướu),

-

Thể hiện rõ năng lực vượt trội in vitro trên hai chủng nghiên cứu so với
sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn thông dụng.


ABSTRACT
Thesis:
Evaluate the efficacy of a mouthrinse containing nisin and disodium EDTA
on Gram negative bacteria inducing malodour.
Content:
1. Determine the optimum formulation of nisin in combination with
disodium EDTA for antimicrobial activity on Fusobacterium nucleatum
and Klebsiella pneumoniae by in vitro evaluation.
2. Estimate the population reduction of anaerobic bacteria inducing

malodour during the treatment with the optimum nisin – disodium EDTA
formulation by in vivo evaluation on 6 human subjects.
3. Compare the in vivo antimicrobial efficacy of the optimum nisin –
disodium EDTA formulation with a popular clinical proven antibacterial
(inducing malodour) mouthrinse (randomly selected).
We implemented experiments in order to determine the diameter of inhibitory
cirles, the in vitro optimum formulation and tested in vivo samples for total of
viable anaerobic bacterial count.
The results showed that the optimum nisin – disodium EDTA formulation proved
its antibacterial efficacy (inducing malodour) for 6 human subjects in this
evaluation:
-

Reducing from 3.3 – 6.1 log10 total of viable anaerobic bacterial count,

-

Its antimicrobial efficacy is better than the controled antibacterial
mouthrinse (this product is clinical proven of antiseptic, antiplaque and
antigingivitis),

-

Proving the superior in vitro antimicrobial efficacy on two study
microorganisms in comparison with the controled antibacterial
mouthrinse.


i

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ………………………………………………….……………

1

CHƯƠNG 1 – TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bacteriocin
1.1.1. Giới thiệu ………………………………………………………

3

1.1.2. Bacteriocin – nhìn lại lịch sử …………………………………

3

1.1.3. Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB ………….

4

1.1.4. Ứng dụng của bacteriocin………………………………………

6

1.2. Nisin – bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis
1.2.1. Định nghĩa và giới thiệu………………………………………… 11
1.2.2. Đặc tính kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn của nisin…………….. 12
1.2.3. Đặc điểm hóa lý - Độ ổn định và độ hòa tan……………………

15

1.2.4. Cơ chế kháng khuẩn…………………………………………….

15

1.2.5. Ứng dụng………………………………………………………..

17

1.3. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ……………………………

18

1.4. Hệ vi sinh vật trong khoang miệng người khỏe mạnh và người bệnh

19

1.5. Các bệnh răng miệng…………………………………………………

22

1.6. Thành phần nước súc miệng………………………………………….

24

1.7. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài……………

27

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu………………………………………………………………

31

2.2. Công thức nước súc miệng đề nghị………………………………….

32

2.3. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu……………………………….

33

2.4. Mơ hình thí nghiệm ………………………………………………….

34

2.5. Lấy mẫu………………………………………………………………

35

2.6. Kiểm tra mẫu ………………………………………………………… 35


ii

2.7. Các phương pháp phân tích và nghiên cứu được áp dụng
2.7.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái của hai chủng vi sinh vật chỉ
thị …………………………………………………………….

36

2.7.2. Đếm khuẩn lạc…………………………………………………

36

2.7.3. Đo mật độ quang ………………………………………………

37

2.7.4. Xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa mật độ
quang và mật độ tế bào……………………………………….

37

2.7.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức nisin và disodium
EDTA…………………………………………………………..

38

2.7.6. Xác định tổng số vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi. ………….

39

2.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến khảo sát in vivo ..……………………….

40

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Một số thí nghiệm tiền đề tài…………………………………………

41

3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của phức nisin và disodium EDTA
trên hai chủng nghiên cứu…………………….………………………

45

3.3. Các kết quả khảo sát in vivo……..…………………………………...

51

3.4. So sánh hiệu quả chăm sóc răng miệng của nước súc miệng nisindisodium EDTA với nước súc miệng diệt khuẩn thị trường và đóng
góp cụ thể của đề tài………………………………………………… 60

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………

66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………

68

PHỤ LỤC………………………………………………………………..

74


iii

DANH MỤC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Dữ liệu nồng độ ức chế danh nghĩa ……..………………….…

14

Bảng 1.2. Hệ vi sinh vật trong miệng……………………………………

21

Bảng 2.1. Công thức nước súc miệng đề nghị cho khảo sát in vivo………

32

Bảng 2.2. Các công thức kháng khuẩn và tỉ lệ các thành phần…………..

33

Bảng 2.3. Cách chuẩn bị 10 ml các công thức kháng khuẩn từ dung dịch
gốc nisin và disodium EDTA 100mM…………………………

38

Bảng 3.1. Đường kính vịng kháng khuẩn trên chủng K. pneumoniae ..…

45

Bảng 3.2. Đường kính vịng kháng khuẩn trên chủng F. nucleatum……..

48

Bảng 3.3. Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) ở điều kiện
thường (không sử dụng nước súc miệng)………………………

52

Bảng 3.4. Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10
ngày sử dụng giả dược………………………………………….

53

Bảng 3.5. Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10
ngày sử dụng nước súc miệng chứa 25µg/ml nisin-20mM
disodium EDTA ………………………………………………

55

Bảng 3.6. Kết quả tổng số vi khuẩn yếm khí (CFU/ml x 106) trong 10
ngày sử dụng nước súc miệng diệt khuẩn thị trường …………..

57

Bảng 3.7. Đường kính vịng kháng khuẩn của nước súc miệng nisindisodium EDTA và nước súc miệng diệt khuẩn trên hai chủng
nghiên cứu………………………………………………………

61

Bảng 3.8. So sánh hiệu quả chăm sóc răng miệng giữa nisin- disodium
EDTA và nước súc miệng diệt khuẩn thị trường………………

62

iv

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Các mơ hình tạo lỗ ………………………………………………

16

Hình 1.2. Cấu trúc răng…………………………………………………….

28

Hình 2. Sơ đồ tổng quát nội dung nghiên cứu………………………………

40

Hình 3.1. Chủng Klebsiella pneumoniae qua kính hiển vi…………………

41

Hình 3.2a, b. Khuẩn lạc Klebsiella pneumoniae trên mơi trường Columbia
blood agar base và mơi trường Thioglycollate agar …………

41

Hình 3.3. Chủng Fusobacterium nucleatum qua kính hiển vi……………...

42

Hình 3.4. Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum trên mơi trường Columbia
blood agar base……………………………………………….

43

Hình 3.5. Khuẩn lạc Fusobacterium nucleatum trên mơi trường
Thioglycollate agar……………………………………………

43

Hình 3.6. Đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào
của chủng Klebsiella pneumoniae………………………………

44

Hình 3.7. Đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào
của chủng Fusobacterium nucleatum………………………….

44

Hình 3.8. Biến thiên đường kính vịng kháng khuẩn trên chủng Klebsiella
pneumoniae theo nồng độ nisin…………………………………

46

Hình 3.9. Biến thiên đường kính vịng kháng khuẩn trên chủng
Fusobacterium nucleatum theo nồng độ nisin …………………

49

v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic
LAB: Lactic acid bacteria, vi khuẩn sinh lactic acid
MRSA: Methicillin resistant Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus
kháng methicillin
GRAS: Generally regarded as safe , được xem là an tồn
UV: Ultra violet, tia cực tím
FDA: Food and Drug Association, Hiệp hội Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ
ATCC: American Type Culture Collection, bộ sưu tập giống vi sinh vật Hoa Kỳ
CFU: Colony form unit, đơn vị khuẩn lạc tạo thành
OD: Optical density, mật độ quang
NSM: Nước súc miệng


1

MỞ ĐẦU
Chứng hơi thở hôi là căn bệnh phổ biến có nhiều yếu tố nguyên nhân. Các mùi khó
chịu phát ra từ khoang miệng được cho là từ các thực phẩm nặng mùi, như tỏi và
hành; từ vài loại dược phẩm; từ cơ thể; từ các bệnh hệ thống; từ các nhiễm trùng
khác và từ vi khuẩn.
Vài con đường liên quan với chứng hơi thở hôi, bao gồm đường thở (mũi, xoang,
họng và phổi), đường tiêu hóa, và vài cơ quan như thận, gan. Mặc dù có rất nhiều
nguyên nhân liên quan đến chứng hơi thở hơi, ước tính khoảng 80 – 90% mùi hôi là
xuất phát từ miệng và vi khuẩn chịu trách nhiệm trực tiếp cho các khí có mùi khó
chịu này.

Các nhà nghiên cứu đã xác định được vài vi sinh vật sản sinh ra các mùi khó chịu và
giải thích thỏa đáng về các điều kiện cần thiết cho sự sinh tổng hợp mùi hơi, đó là:
vi khuẩn yếm khí, sự thiếu hụt oxy, pH kiềm và các chất nền có chứa sulfur.
Các sản phẩm hóa học từ sự phân hủy của vi khuẩn là hợp chất lưu huỳnh bay hơi
(volatile sulfur compounds - VSCs) có mùi hôi thối và được xác định là chịu trách
nhiệm cho hơi thở hôi. Các hợp chất lưu huỳnh bay hơi như hydrogen sulfide,
methyl mercaptan, dimethyl sulfide và dimethyl disulfide chiếm hơn 90% mùi của
sự phân hủy từ miệng.
Bằng phương pháp in vitro, McNamara và cộng sự (1972) đã chứng minh rằng sự
tạo thành mùi của sự phân hủy có liên quan với sự hoán chuyển trong quần thể vi
sinh vật từ sự trội hơn của Gram dương sang sự trội hơn của quần thể yếm khí Gram
âm. Khơng có vi sinh vật Gram dương nào sản sinh ra mùi khó chịu trong khi tất cả
vi sinh vật Gram âm (Fusobacterium polymorphum, Veillonella alcalescens,
Bacteroides fundiliformis, Klebsiella pneumoniae) lại sản sinh ra mùi phân hủy.
Trong một nghiên cứu tương tự, Solis-Gaffar và cộng sự (1980) đã tìm ra rằng chỉ
có các vi sinh vật Gram âm (Veillonella alcalescens, Fusobacterium nucleatum,
Bacteroides melanogenicus và Klebsiella pneumoniae) sản sinh ra hợp chất lưu
huỳnh bay hơi.


2

Một số nghiên cứu cho thấy rằng hợp chất lưu huỳnh bay hơi của chứng hơi miệng
góp phần vào sự phát sinh bệnh viêm nha chu. Điều trị chứng hơi thở hơi là phải
trực tiếp loại bỏ hay ít nhất làm giảm các vi sinh vật gây bệnh và các chất nền liên
kết.
NISIN đã được nghiên cứu rất nhiều về hiệu quả của nó đối với các vi khuẩn gây
bệnh răng miệng (xem phần 1.5.2). Điểm nổi bật hơn là khi sử dụng nisin cùng với
các chất kết hợp như disodium EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), calcium
EDTA, EGTA (ethyleneglycoltetraacetic acid), lactate, sodium hexametaphosphate,

alkyldiamine tetraacetates … thì sự kết hợp này làm tăng cả về độ rộng phổ lẫn hoạt
lực kháng khuẩn của nisin lên các vi khuẩn Gram âm.
Trên cơ sở đó, đề tài “Đánh giá ảnh hưởng của nước súc miệng chứa nisin và
disodium EDTA lên các vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi” hướng đến những mục
tiêu và nội dung sau:
Mục tiêu chung
Nghiên cứu này đưa ra công thức nước súc miệng chứa nisin, một chất chống khuẩn
bản chất sinh học (bacteriocin), và chất kết hợp (chelating agent/chelator) disodium
EDTA với mục tiêu đánh giá ảnh hưởng của công thức này lên các vi khuẩn Gram
âm (Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae) gây hơi thở hơi nói riêng và
gây bệnh răng miệng nói chung.
Nội dung
Nội dung 1: Nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của phức nisin và disodium
EDTA lên hệ vi khuẩn Gram âm gây hơi thở hôi.
Nội dung 2: Khảo sát in vivo ảnh hưởng của nghiệm thức tối ưu từ nội dung 1 lên hệ
vi khuẩn yếm khí gây hơi thở hôi. So sánh hiệu quả của công thức đề nghị với một
sản phẩm nước súc miệng diệt vi khuẩn gây hôi miệng thông dụng trên thị trường.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Bacteriocin

1.1.1.

Giới thiệu

Bacteriocin là một trong số các chất chống khuẩn sản sinh bởi lactic acid bacteria (LAB),
cùng với các thành phần chống khuẩn khác là các acid hữu cơ, hydrogen peroxide,
carbon dioxide, diacetyl và các enzyme ức chế. Bacteriocin là các peptide hoặc các
protein được tổng hợp ribosom và thường hoạt động chống lại các lồi có quan hệ gần.
Bacteriocin khác với các kháng sinh truyền thống trong cách thức chủ yếu là: chúng có
phổ kháng khuẩn tương đối hẹp và chỉ độc đối với các vi khuẩn có quan hệ gần với
chủng sản xuất. Những độc tố này được tìm thấy trong tất cả các dịng vi khuẩn chính và
gần đây, chúng cũng được biết là được sản xuất bởi một vài thành viên của cổ khuẩn
(Archaea).
Bacteriocin của LAB thường mang điện dương, chứa ít hơn 100 amino acid và có chứa
phần nhiều (hơn 30%) các amino acid kị nước. Điện dương của các peptide này đảm
bảo lực hút tĩnh điện với màng ngoài vi khuẩn tích điện âm, trong đó phần kị nước của
peptide sẽ tương tác với màng tế bào và xâm nhập vào màng đôi phospholipid.
Bacteriocin được xem như là peptide bảo vệ và vì thế được xếp vào nhóm tương tự như
độc tố nấm men, hay defensin của động vật có vú, cecropin của cơn trùng, tachyplesin
của cua, magainin của động vật lưỡng cư, pandanin của bọ cạp, và thionin của thực vật.
Phần lớn bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, nghĩa là chỉ có một số lồi xác
định, thường là những lồi có quan hệ phát sinh lồi gần với chủng sản xuất bị ảnh
hưởng. Tuy nhiên, vài bacteriocin bộc lộ phổ kháng khuẩn rộng hơn nhiều và còn mở
rộng ra đến động vật nguyên sinh, nấm men, nấm mốc và virus [38].
1.1.2.

Bacteriocin – nhìn lại lịch sử

Nghiên cứu về ức chế nội vi khuẩn (inter-bacterial), cũng tương tự như nhiều khía
cạnh cơ bản khác về vi sinh học, có thể tìm thấy sự liên quan về nguồn gốc của nó với
Louis Pasteur. Vào năm 1877, Pasteur cùng với cộng sự Joubert của ơng, đã tìm cách
kiểm sốt sự phát triển của anthrax bacillus, loài đã được báo cáo (cả in vivo và in
vitro) về hoạt tính ức chế khi kết hợp cùng nuôi cấy với Escherichia coli được phân
lập từ nước tiểu.

4

Phần lớn các thành công ban đầu trong việc xác định bản chất bacteriocin lại liên quan
đến bacteriocin của vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là colicin và phần nhiều các kiến thức
này là từ các cơng trình của Gratia và Fredericq.
Một quan sát bước ngoặt trong các khảo sát về bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
ghi lại rằng một vài hoạt tính ức chế của lactococci (streptococci nhóm N) đối với các
LAB khác là do một chất chống khuẩn có bản chất protein gọi là “chất ức chế nhóm N”
hay còn gọi là nisin [40].
1.1.3.

Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương LAB

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương đa dạng hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram
âm. Trải qua nhiều năm, nhiều phương pháp phân loại bacteriocin đã được đưa ra [37]:
Fredericq (1957) phân loại bacteriocin dựa trên đặc trưng hấp thu và các phân lớp
phụ phù hợp với đáp ứng miễn dịch.
Reeves (1965) thiết lập một hệ thống bao gồm 16 lớp bacteriocin dựa trên các loài
sản sinh ra chúng.
Bradley (1967) phân loại bacteriocin dựa trên trọng lượng phân tử.
Klaenhammer (1993) phân loại bacteriocin thành 4 lớp dựa trên cấu trúc, cơ chế
hoạt động, di truyền và đặc điểm hóa sinh (xem phần 1.1.3.1).
Cotter và cộng sự (2005) phân thành 2 lớp chính, mỗi lớp lại chia thành các phân
lớp phụ (xem phần 1.1.3.2).
Bacteriocin lớp I chứa lanthionine hay β-methyllanthionine gọi là lantibiotic. Chúng
phải trải qua quá trình chỉnh sửa sau dịch mã để sản sinh ra các peptide có kích thước
nhỏ hơn 5 kDa. Các lantibiotic nhóm A như nisin, epidermin và subtilin là các peptide
có hình dạng đinh ốc, thon dài, linh động với hoạt tính tạo lỗ, trong khi các lantibiotic

nhóm B, mà ví dụ tiêu biểu là mersacidin, thì nhỏ và đặc với các thành phần đặc trưng
nhắm vào màng vi khuẩn. Các lantibiotic nhóm B hoạt động bằng cách can thiệp vào
phản ứng enzyme của tế bào, như tổng hợp thành tế bào.
Các bacteriocin không chứa lanthionine (non-lanthionine bacteriocin) được xếp vào lớp
II. Các peptide này bền nhiệt và không trải qua chỉnh sửa sau dịch mã. Bacteriocin lớp
II chủ yếu hoạt động bằng cách gây ra sự thấm của màng và tiếp theo là rò rỉ các phân
tử của vi khuẩn mục tiêu.


5

Lớp phụ IIa là lớp phụ lớn nhất. Chúng hoạt động chống lại Listeria và có một trình tự
đầu N bảo tồn kết hợp không đặc trưng lên bề mặt đích. Giống như các lantibiotic
nhóm A, bacteriocin lớp phụ IIa tạo các lỗ trong màng nguyên sinh chất. Các ví dụ tiêu
biểu là pediocin và các bacteriocin tương tự pediocin (pediocin-like bacteriocin),
sakacin A, và leucocin A.
Bacteriocin lớp IIb như lacticin F và lactococcin G tạo các lỗ và có hai protein khác
nhau. Trong trường hợp của lacticin 3147, thì một protein đóng vai trị khử cực màng,
trong khi protein cịn lại thì có vai trị tạo lỗ.
Acidocin 1B, được xếp vào nhóm phụ IIc.
Các bacteriocin khơng tương tự pediocin (non-pediocin like bacteriocin) được xếp vào
nhóm phụ IId.
1.1.3.1.

Cách phân loại của Klaenhammer (1993)

Lớp I – bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã (post-translationally modified bacteriocin)
ví dụ lantibiotic
Các lantibiotic được chia thành dạng thẳng (nhóm A) và dạng cầu (nhóm B).
Lớp II – các bacteriocin nhỏ (<10 kDa), bền nhiệt hoạt động theo cơ chế màng

Lớp IIa: các peptide kháng Listeria
Lớp IIb: các peptide hai thành phần
Lớp IIc: các peptide hoạt hóa thiol (thiol-activated peptide)
Lớp III – các bacteriocin lớn (>30 kDa), không bền nhiệt
Lớp IV – các bacteriocin phức hợp bao gồm các bán lipid hay bán carbohydrate cơ bản
kết hợp với protein.
Gần đây, Kemperman và cộng sự (2003) đã đề nghị ghi nhận một lớp mới (lớp V) bao
gồm các peptide kháng khuẩn dạng vòng thắt từ đầu đến cuối, tổng hợp ribosom,
không chỉnh sửa sau dịch mã (ribosomally synthesized, non-modified head-to-tail
ligated cyclic antibacterial peptide) [40].
1.1.3.2.

Cách phân loại của Cotter (2005)


6

Nhóm

Đặc tính

I – Lantibiotic
Ia

Nhỏ (19-38 amino acids), thon dài, là các peptide mang điện dương, tạo lỗ

Ib

Peptide cầu, gây cản trở các enzyme chủ yếu

II – Bacteriocin không chứa lanthionine
IIa

Peptide tương tự pediocin (Pediocin-like peptide)

IIb

Bacteriocin 2 peptide, yêu cầu cả 2 peptide để thể hiện hoạt tính

IIc

Peptide vịng, đầu N và đầu C là các liên kết đồng hóa trị

IId

Peptide không tương tự pediocin (non-pediocin like peptide) đơn
[37]

1.1.4.

Ứng dụng của bacteriocin

Các ứng dụng được khảo sát cho đến nay của bacteriocin là trong ba lĩnh vực: thực
phẩm, y học và chăm sóc răng miệng. Bacteriocin chủ yếu được ứng dụng trong
thực phẩm là nisin. Nisin là chất bảo quản trong phomat tự nhiên; phomat chế biến
thanh trùng; sữa thanh trùng và các sản phẩm từ sữa; rau quả đóng hộp; thịt; cá và
động vật biển có vỏ (tơm, cua); thức uống có cồn; trong sản phẩm bột nướng có độ
ẩm cao; trứng dạng lỏng thanh trùng; nước xốt thịt bò; xốt salad; trong thực phẩm
chay được làm từ đậu nành và các rau củ khác; trong các sản phẩm rau củ lên men
(xem chi tiết trong phần 1.2.5).

Ứng dụng y học của bacteriocin:
Sử dụng thường xuyên các kháng sinh dẫn đến nguy cơ kháng kháng sinh của các
mầm bệnh trên người và động vật. Kháng kháng sinh và nổi trội hơn là các mầm
bệnh vi khuẩn đa kháng đã dẫn đến những nghiên cứu các chất kháng khuẩn thay thế
để chữa trị và ngăn ngừa các nguồn lây nhiễm trên cả người và động vật. Vì cơ chế
hoạt động của bacteriocin khác đáng kể so với các kháng sinh thông thường, chúng
được xem là cách tiếp cận mới đối với việc kiểm soát nguồn gây bệnh vi sinh vật.
Nghiên cứu về các peptide kháng khuẩn, với mối quan tâm đặc biệt về bacteriocin
của LAB, đang bước vào kỷ nguyên mới với những ứng dụng mới hơn là được sử
dụng làm chất bảo quản thực phẩm như lâu nay [37].


7

a. Nhiễm trùng da
Staphylococcus aureus và S. aureus kháng methicillin (MRSA) là các vi sinh
vật phổ biến nhất trong nhiễm trùng da. MRSA được báo cáo lần đầu tiên trong
những năm 1960 sau khi methicillin đã được dùng trong nhiều năm để điều trị
nhiễm trùng do S. aureus. Oxacillin, nafcillin, quinopristin-dalfopristin,
rifampicin, ciprofloxacillin, teichoplanin, cefazolin và cephalothin A cũng được
dùng để điều trị nhiễm trùng do S. aureus nhưng thành công rất giới hạn.
Mersacidin, một lantibiotic sản sinh bởi chủng Bacillus sp. HIL Y-85,54728, ức
chế sự phát triển của chủng MRSA in vivo trên chuột và có thể được xem là
phương pháp điều trị thay thế. Peptide này ức chế sự tổng hợp thành tế bào của
chủng MRSA với hiệu quả tương tự vancomycin. Mersacidin cũng có hoạt tính
chống lại Propionibacterium acnes và do đó có thể được sử dụng trong điều trị
mụn.
Lacticin 3147, một lantibiotic 2 peptide sản sinh bởi Lactococcus lactis subsp.
lactis, ức chế sự phát triển của chủng S. aureus, MRSA và chủng Enterococcus
faecalis kháng vancomycin.

Các nisin A và Z đang bước vào các thử nghiệm tiền lâm sàng cho việc chữa trị
enterococci kháng vancomycin.
Epidermin và gallidermin, cũng được phân loại là lantibiotic nhưng được sản
sinh bởi Staphylococcus gallinarum và Staphylococcus epidermidis, đã chứng
tỏ hiệu quả trong điều trị nhiễm trùng da. Epidermin và gallidermin cũng có hoạt
tính chống lại P. acnes. Bonelli và cộng sự (2006) đã đo hoạt tính chống khuẩn
của epidermin và gallidermin bằng cách xác định sự phóng thích potassium (K+)
khỏi màng trên các mơ hình họ xây dựng.
Nisin và IB-367, một peptide tương tự protegrin (protegrin-like peptide) mang
điện dương sản xuất bởi công ty Intrabiotics (Mountain View, California), gần
đây đã bước vào giai đoạn I thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiễm trùng mụn [37].
b. Viêm vú ở động vật cho sữa
Chứng viêm vú do vi khuẩn gây ra những thiệt hại kinh tế to lớn trong ngành
công nghiệp sữa. Các thử nghiệm đã được thực hiện bởi Taylor và cộng sự


8

(1949) cho thấy rằng dịch truyền nisin vào trong tuyến vú có hiệu quả trong việc
điều trị cả nhiễm do streptococcal và staphylococcal.
Broadbent và cộng sự (1989) trong thí nghiệm in vivo cho thấy rằng nisin ức
chế sự phát triển của một vài vi khuẩn Gram dương gây bệnh viêm vú.
Lacticin 3147 đã chứng tỏ hiệu quả trong việc điều trị viêm vú ở bò và cho thấy
hoạt lực chống lại staphylococci và streptococci vú.
Một bacteriocin sản sinh bởi Bacillus subtilis LFB112 ức chế sự phát triển của
S. aureus liên quan tới bệnh viêm vú.
Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus ST91KM sản sinh ra
bacteriocin (macedocin ST91KM) có hoạt tính chống lại Streptococcus
agalactiae, Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae, Streptococcus uberis,
Staphylococcus aureus và Staphylococcus epidermidis, bao gồm các chủng

kháng methicillin và oxacillin. Macedocin ST91KM vì thế có thể được sử dụng
như là một phương án thay thế trong việc điều trị bệnh viêm vú ở bò cho sữa
[37].
c. Viêm nhiễm do cấy ghép
Một vài trường hợp viêm nhiễm do các dụng cụ cấy ghép y sinh bị tạp nhiễm đã
được báo cáo.
Nisin, được hấp phụ lên một bề mặt được silan hóa, ngăn ngừa sự phát triển của
Listeria monocytogenes.
Trong một nghiên cứu độc lập, các nhà nghiên cứu đã phủ ống Teflon ® FEP
bằng nisin và chèn dụng cụ này vào tĩnh mạch cổ của cừu. Trong một thí nghiệm
tương tự, các ống thơng khí quản PVC được phủ và đặt vào đường thở trên của
ngựa. Các ống thơng khí quản phủ nisin đã ngăn ngừa sự tạo thành khuẩn lạc của
S. aureus, S. epidermidis và Streptococcus faecalis [37].
d. Nhiễm trùng đường hô hấp trên
Pseudomonas aeruginosa là tác nhân chính gây bệnh viêm phổi ở bệnh nhân xơ
nang và hơn 50% bệnh nhân xơ nang bị nhiễm trùng phổi. P. aeruginosa cũng
là một trong những nguồn gây bệnh viêm tai cấp/mãn tính. Viêm tai giữa là một
trong những bệnh thường gặp nhất ở trẻ dưới 2 tuổi. Thêm vào nhiễm trùng phổi


9

ở bệnh nhân xơ nang và nhiễm trùng tai, P. aeruginosa cũng liên quan với
nhiễm trùng vết thương bỏng, đặc biệt là ở những người bị suy giảm miễn dịch.
Nisin ức chế sự phát triển của S. pneumonia liên quan đến bệnh viêm tai giữa
trong các thử nghiệm in vivo. Peptide ST4SA, một bacteriocin lớp II, cho thấy
hoạt lực tốt hơn đối với các mầm bệnh viêm tai giữa do vi khuẩn Gram dương
khi so với các chất kháng khuẩn khác.
Peptide IB-367 gần đây trải qua giai đoạn I thử nghiệm an toàn trên người với
mục tiêu chống nhiễm trùng phổi cấp do P. aeruginosa, đặc biệt là trên các

bệnh nhân xơ nang [37].
e. Lao
Cuối thế kỷ 20, khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm Mycobacterium
tuberculosis và có nguy cơ của bệnh lao. Chỉ riêng 2007, hơn 13 triệu người
được chẩn đoán bị nhiễm lao và hơn 9 triệu trường hợp mới được báo cáo. Tổ
chức y tế thế giới báo cáo hơn 1.8 triệu cái chết là do M. tuberculosis (WHO
2009). Bacteriocin lớp II có hoạt tính chống lại M. tuberculosis. Theo các thử
nghiệm in vivo, một phức hợp bacteriocin–liposome làm tăng tỉ lệ sống của
động vật khi cho tiếp xúc với mầm bệnh [37].
f. Nhiễm trùng hệ thống
S. aureus, Listeria monocytogenes và P. aeruginosa thường liên quan đến nhiễm
trùng hệ thống.
Clostridium perfringens, Salmonella spp., S. aureus, Helicobacter
(Campylobacter) spp., E. coli và L. monocytogenes là những vi khuẩn phổ biến
gây rối loạn dạ dày-ruột và ngộ độc thực phẩm. L. monocytogenes đặc biệt
nguy hiểm đối với trẻ em, phụ nữ mang thai, những người bị tổn thương hệ miễn
dịch và người lớn tuổi. Mầm bệnh thường đi vào ruột và gắn với các tế bào biểu
mơ ở đó chúng được giữ lại bởi sự thực bào. Hemolysin được vi khuẩn tiết ra
gây ra sự tan của màng thể thực bào. Listeria sống sót từ sự đại thực bào và đi
xuyên qua rào chắn máu/não gây ra bệnh viêm màng não.
Listeria kháng với các β-lactam, monolactam và cephalosporin, bao gồm
cefotaxime và ceftazidime.


10

Các bacteriocin lớp II có hoạt tính chống lại L. monocytogenes và có thể được
sử dụng để điều trị listeriosis. Pediocin PA-1, sản sinh bởi Pediococcus
acidilactici, bộc lộ hoạt lực chống khuẩn in vivo chống lại các chủng L.
monocytogenes khác nhau. Thêm vào đó, pediocin PA-1 khơng ức chế các vi

khuẩn đường ruột khác trong dạ dày.
Clostridium botulinum gây ra bệnh thần kinh mất cảm giác được biết như là
chứng ngộ độc thịt. Độc tố thần kinh ức chế sự phóng thích acetylcholine từ đầu
nối các cơ thần kinh, gây ra sự mất cảm giác.
Nisin đã chứng tỏ hiệu quả ức chế C. botulinum và Clostridium
tyrobutyricum.
Nisin cũng chứng tỏ hiệu quả chống lại Clostridium difficile và có thể được sử
dụng trong điều trị tiêu chảy [37].
g. Loét dạ dày
Sự xâm nhập của Helicobacter pylori trong dạ dày gây ra các rối loạn như viêm
dạ dày mãn tính, loét hệ tiêu hóa, lympho mơ và ung thư dạ dày.
Nisin và Lacticins A164 và BH5 ức chế sự phát triển của H. pylori in vitro và
do đó có thể được sử dụng để điều trị loét hệ tiêu hóa.
Nisin, được sản xuất bởi công ty AMBI (Purchase, New York), và IB-367, một
peptide tương tự protegrin (protegrin-like peptide) mang điện dương từ công ty
Intrabiotics (Mountain View, California), đã thành công vượt qua giai đoạn I (an
toàn) thử nghiệm lâm sàng. Cả hai peptide này đang được xem xét cho việc điều
trị loét bao tử gây ra bởi H. Pylori [37].
h. Viêm và dị ứng
Phospholipase A2 đóng vai trị điều hịa lưu lượng arachidonic acid, dẫn đến sự
tạo thành chất môi giới của sự viêm và dị ứng, bao gồm các prostaglandin,
leukotriene và hydroxyeicosatetraenoic acid. Các lantibiotic duramycin,
duramycin B và C, và cinnamycin ức chế phospholipase A2 gián tiếp bằng cách
cô lập chất nền phosphatidylethanolamine, vì thế nó có thể được sử dụng làm
thuốc chống viêm [37].


11

i. Cao huyết áp

Enzyme chuyển đổi angiotensin (angiotensin-converting enzyme) xúc tác sự
chuyển đổi angiotensin I thành angiotensin II và phân hủy bradykinin, có liên
quan tới điều hịa áp suất máu và cân bằng dịch thể. Các lantibiotic tương tự
cinnamycin (cinnamycin-like lantibiotic) và ancovenin, một lantibiotic nhóm B,
có khả năng ức chế angiotensin-converting enzyme. Lantibiotic vì thế có tiềm
năng trong điều trị cao huyết áp [37].
j. Nhiễm trùng đường niệu-sinh dục
Bacteriocin (subtilosin A) có tiềm năng trong điều trị nhiễm trùng đường niệusinh dục [37].
Trong lĩnh vực chăm sóc răng miệng, bacteriocin (chủ yếu là nisin) đã chứng tỏ tiềm
năng trong điều trị các bệnh về răng miệng thông qua rất nhiều nghiên cứu (xem
phần 1.5.2).
1.2.

Nisin – bacteriocin của vi khuẩn Lactococcus lactis

1.2.1.

Định nghĩa và giới thiệu

Nisin là một lantibiotic, thuộc nhóm I, loại A và là lantibiotic được nghiên cứu kỹ
nhất cho đến nay. Nisin đóng vai trị như là một hệ thống mơ hình cho những nghiên
cứu các mối quan hệ chức năng/cấu trúc bacteriocin chỉnh sửa sau dịch mã, tổ chức
gen và các đặc điểm hóa sinh [40].
Nisin là một protein (polypeptide) có đặc tính kháng khuẩn khối lượng phân tử thấp
được sản sinh tự nhiên bởi các chủng Lactococcus lactis subsp. lactis (gọi chung là
L.lactis). Lúc này nó được mơ tả là chất độc hiện diện trong sữa và có ảnh hưởng bất
lợi lên sản phẩm phomat trong quá trình lên men [10].
LAB bacteriocin đầu tiên, nisin, được phát hiện lần đầu vào năm 1928, khi Rogers L.A.
quan sát sự trao đổi chất của Streptococcus lactis (ngày nay được phân loại lại là
Lactococcus lactis) ức chế đối với các LAB khác [38]. Nó là chất bảo quản tự nhiên

được tìm thấy trong sữa nồng độ thấp và phomat, hồn tồn khơng độc và khơng gây
dị ứng đối với người [3].
Bước ngoặt đáng chú ý trong lịch sử và sự phát triển của nó là với vai trị là chất bảo
quản thực phẩm. Nghiên cứu đầu tiên về tiềm năng của nó như là chất bảo quản thực


12

phẩm được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự (1951) và các nghiên cứu sử dụng nó
làm chất bảo quản trong phomat chế biến vào năm 1952.
Sự phát triển nisin ở dạng sản phẩm thương mại (có tên là Nisaplin) được thực hiện
bởi Aplin và Barrett vào năm 1957. Nisaplin chứa 2.5% nisin A, lên men môi trường
sữa bởi chủng sản xuất nisin – L.lactis subsp. lactis [10].
Nisin được chứng minh là chất không độc bởi các nghiên cứu khác nhau từ năm
1962. Cấu trúc phân tử được làm sáng tỏ vào năm 1971. Nisin là một peptide 5 vòng
gồm 34 amino acid trong đó có 13 amino acid được chỉnh sửa sau dịch mã, phân tử
lượng 3,354 Daltons [2]. FDA duyệt cho phép sử dụng nisin như là chất bảo quản có
nguồn gốc sinh học vào năm 1988 [38].
Với việc được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia trên thế giới
và trong hơn 50 năm, nisin đang dẫn đầu trong lĩnh vực bacteriocin, khơng chỉ liên
quan đến các kiến thức được tích lũy về đặc trưng hóa học và cơ sở di truyền mà cịn vì
qui mơ và các ứng dụng thực tế khác nhau của nó [40].
Các ứng dụng thương mại rộng rãi của nisin dẫn đến mối quan tâm đáng kể đối với các
bacteriocin khác từ các vi sinh vật được xem là an toàn (generally regarded as safe GRAS) [38].
1.2.2.

Đặc tính kháng khuẩn và phổ kháng khuẩn

Nisin là chất kháng khuẩn có khả năng kháng rộng các vi khuẩn Gram dương. Nisin
cho thấy khả năng tiêu diệt một phạm vi rộng các vi sinh vật bao gồm Actinomyces,

Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus,
Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Propionibacterium, Streptococcus và
Staphylococcus. Nó cũng có hoạt tính kháng các vi khuẩn Gram âm như
Camphylobacter, Haemophilus, Helicobacter, Neisseria, Escherichia coli và
Salmonella trong điều kiện hỗ trợ là màng ngồi bị phá hủy do đó nisin được sử dụng
kết hợp với các chất khác [38].
Phổ kháng khuẩn của Ambicin N (một Nisin thương mại) đã được lập bằng cách thử
nghiệm định lượng nồng độ ức chế danh nghĩa đối với các vi khuẩn Gram dương và
Gram âm quan trọng trong miệng (nominal inhibitory concentration). Các chất chống
mảng bám như cetyl pyridinium chloride, chlorhexidine và triclosan cũng được thử


13

nghiệm để so sánh. Kết quả được trình bày trong bảng 1.1. Kết quả từ bảng cho thấy
nisin có hoạt lực vượt trội [15].


14

Bảng 1.1. Dữ liệu nồng độ ức chế danh nghĩa
Vi sinh vật
Strep. agalactiae

Cetyl
pyridinium
chloride
(ppm)
0.78

Chlorhexidine
(ppm)

Triclosan
(ppm)

Ambicin N
(ppm)

0.41

4.96

0.22

Strep. sanguis

2.12

0.86

0.88

0.23

Strep. mutans

3.10

3.94

1.11

0.43

Strep. milleri

4.58

1.58

1.08

0.14

Strep. mitis

2.23

1.50

3.94

0.33

Strep. mitior

1.22

4.55

4.23

0.05

Strep. salivarius

2.36

1.44

4.05

0.18

Strep. pyogenes

0.78

0.16

4.35

0.009

Staph. aureus

0.66

0.54

0.09

0.13

G. vaginalis

0.3

1.3

0.41

0.22

Lacto odontolyticus

0.83

1.88

7.49

0.02

Act. odontolyticus

1.23

3.37

3.02

0.12

Act. israelii

8.15

4.11

3.19

0.53

Act. naeslundii

4.61

2.01

1.98

>12.8

Act. actinomycetem

1.02

0.53

1.69

0.02

Fuso. nucleatum

0.82

0.64

1.6

0.048

Bact. intermedius

4.68

2.49

3.72

0.91

Peptostrepto. micros

4.96

8.46

6.76

>1.28

Porph. gingivalis

0.94

2.36

4.00

>1.28

Bact. ureolyticus

0.56

0.69

7.65

0.035

Candida albicans

1.39

1.71

1.00

>1.28

Candida kefyr

0.61

0.42

0.46

>1.28

Candida tropicalis

0.48

0.98

0.35

>1.28

[15]