Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ lactobacillus acidophilus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-------------------

NGUYỄN THỊ VÂN LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE TỪ
LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống
Mã số: 605402

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA–ĐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học : T.S TRẦN BÍCH LAM
Cán bộ chấm nhận xét 1 : PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU
Cán bộ chấm nhận xét 2 : PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG
Tp. HCM ngày 30 tháng 01 năm 2013.
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS. TSKH LƯU DUẨN ...................... : Chủ tịch Hội đồng
2. PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU .... : Phản biện 1
3. PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN ............. : Phản biện 2
4. TS. TRẦN BÍCH LAM ........................ : Ủy viên
5. TS. LẠI QUỐC ĐẠT ........................... : Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa.

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ VÂN LINH

MSHV: 11110205

Ngày, tháng, năm sinh: 14/01/1988

Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống

Mã số : 605402

I. TÊN ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE TỪ LACTOBACILLUS
ACIDOPHILUS.

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Xác định phương pháp kết tủa lactase thô.
 Tinh chế chế phẩm lactase.
 Khảo sát tính chất của chế phẩm lactase tinh chế.
 Khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi của chế phẩm lactase tinh
chế.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/01/2013
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS. TRẦN BÍCH LAM

Tp. HCM, ngày 24 tháng 01 năm 2013
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)

ii


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Trần Bích Lam. Cơ đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên những lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo
mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hồn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ thực phẩm đã
truyền đạt kiến thức, cũng như kinh nghiệm quý báu trong suốt những năm học tại
trường.

Em xin thành cảm ơn Chị Phượng, các bạn ở Phịng thí nghiệm Vi sinh đã tạo
điều kiện, chia sẻ và động viên trong thời gian thực hiện luận văn.
Con xin cảm ơn nội, ba và cô hai đã luôn yêu thương và là chỗ dựa vững chắc
về mọi mặt trong cuộc sống.
Xin cảm ơn các thành viên trong Lớp Cao học thực phẩm 2010, 2011, các bạn
sinh viên khóa 08 – Cơng nghệ thực phẩm, cũng như các anh chị và bạn bè thân
quen đã luôn chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc
sống.

TP. Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 01 năm 2013
NGUYỄN THỊ VÂN LINH

iii


TĨM TẮT LUẬN VĂN

Trong luận văn này, chúng tơi nghiên cứu việc thu nhận và làm sạch enzyme
lactase do tế bào Lactobacillus acidophilussinh tổng hợp, bước đầu thủy phân
lactose trong sữa tươi. Kết quả thu được như sau:
1- Khảo sát hiệu quả kết tủa lactase từ dịch bào thu được sau khi xử lý siêu âm
loại bỏ xác vi sinh vật của các tác nhân muối trung tính và dung môi hữu cơ,
kết quả, isopropanol kết tủa hiệu quả nhất với hiệu suất thu hồi 89,93%, độ tinh
sạch 4,46 lần. Chế phẩm lactase thơ có hoạt tính riêng đạt 14,005 ± 0,384 U/mg
protein.
2- Chế phẩm lactase thơ sau đó được tinh chế bằng hệ thống sắc ký loại trừ kích
thước – sắc ký thẩm thấu gel. Kết quả, chế phẩm lactase tinh chất có hoạt tính
riêng đạt 44,928 U/mg protein, hiệu suất thu hồi đạt 58,57% so với mẫu
enzyme thô thu được sau khi xử lý sóng siêu âm và độ tinh sạch đạt 14,31 lần.
Lactase tinh chế khi tiến hành chạy điện di SDS-PAGE xác định được có trọng

lượng phân tử là 40kDa.
3- Chế phẩm lactase tinh chế được dùng để xác định tính chất. Kết quả, lactase
tinh chế có nhiệt độ tối ưu ở khoảng 40oC, pH tối ưu khoảng 7,5. Khi tiến hành
khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm kết quả ở nhiệt độ 35, 40oC sau khi ủ 3 giờ
hoạt tính cịn lại đạt 50%, trong khi đó ở 50oC thì hoạt tính cịn lại chỉ có 10%.
Khi xác định hằng số Km và Vmax, kết quả giá trị của Km và Vmax lần lượt là 2,3
µmol/phút và 0,73 mM.
4- Khảo sát sơ bộ khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi, chế phẩm có khả
năng thủy phân khoảng 68% lactose trong 10ml sữa với tỷ lệ chế phẩm 5ml
(tương ứng hoạt tính tổng 2,995U) trong thời gian thủy phân 3 giờ.

iv


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân tơi và được thực hiện dưới sự hướng
dẫn khoa học của T.S Trần Bích Lam.
Các số liệu, những kết luận nghiên cứu trong luận văn là trung thực và không
trùng lặp với các đề tài khác cũng như chưa từng được công bố dưới bất cứ hình
thức nào, các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.
Học viên thực hiên
NGUYỄN THỊ VÂN LINH

v


MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................ vi

DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ ix
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................x
GIỚI THIỆU ..............................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .....................................................................................2
1.1. LACTASE .....................................................................................................2
1.1.1. Đặc điểm .................................................................................................2
1.1.2. Cơ chế xúc tác .........................................................................................3
1.1.3. Nguồn thu nhận lactase ...........................................................................5
1.1.4. Cấu trúc của enzyme lactase .................................................................10
1.2. LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS............................................................11
1.3. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ENZYME .....................................................14
1.4. TINH SẠCH LACTASE BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ ............................17
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU .......................................................................20
1.6. ỨNG DỤNG CỦA CHẾ PHẨM LACTASE ..............................................21
1.6.1. Ứng dụng trong công nghiệp sữa và các sản phẩm từ sữa ...................21
1.6.2. Ứng dụng trong công nghiệp tận dụng whey........................................23
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................25
2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT.......................................................................25
2.1.1. Giống vi sinh vật ...................................................................................25
2.1.2. Môi trường nuôi cấy .............................................................................25
2.1.3. Hóa chất ................................................................................................26
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................26
2.2. QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE ..........................27
2.3. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU ...............................................................................28
2.4. THUYẾT MINH QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE .
.....................................................................................................................29
2.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu ............................................................................29
2.4.2. Phá vỡ tế bào L. acidophilus giải phóng lactase ...................................29

vi

2.4.3. Thu dịch bào .........................................................................................30
2.4.4. Kết tủa protein enzyme .........................................................................30
2.4.5. Tinh chế protein lactase ........................................................................30
2.5. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM................................................................................31
2.5.1. Khảo sát phương pháp thu enzyme thô.................................................31
2.5.2. Xác định phương pháp tinh chế: ...........................................................33
2.5.3. Xác định tính chất của chế phẩm lactase: .............................................34
2.5.4. Khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi ............................36
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ..........................................................37
2.6.1. Định lượng Protein hòa tan bằng phương pháp Lowry ........................37
2.6.2. Xác định hoạt tính của lactase bằng cơ chất ONPG .............................38
2.6.3. Phương pháp xác định hàm lượng lactose trong sữa ............................40
2.7. CƠNG THỨC TÍNH TỐN .......................................................................41
2.7.1. Cơng thức xác định hoạt tính lactase của enzyme tự do .......................41
2.7.2. Cơng thức xác định hoạt tính riêng enzyme lactase .............................42
2.7.3. Hiệu suất thu hồi protein enzyme: ........................................................42
2.7.4. Độ tinh sạch của chế phẩm ...................................................................42
2.7.5. Hàm lượng lactose trong 1ml sữa .........................................................42
2.7.6. Hiệu suất lactose thủy phân ..................................................................42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................43
3.1. NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU .......................................................................43
3.2. KHẢO SÁT TÁC NHÂN KẾT TỦA PROTEIN ENZYME ......................43
3.2.1. Kết tủa bằng NaCl.................................................................................43
3.2.2. Kết tủa bằng (NH4)2SO4........................................................................45
3.2.3. Kết tủa bằng acetone .............................................................................47
3.2.4. Kết tủa bằng ethanol .............................................................................50
3.2.5. Kết tủa bằng Isopropanol ......................................................................52
3.2.6. Kết luận chung ......................................................................................54

3.3. TINH SẠCH CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ ..............................................55
3.4. XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM ............................................58

vii


3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme .......................58
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme ...............................60
3.4.3. Độ bền nhiệt của chế phẩm ...................................................................61
3.5. TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA CHẾ PHẨM ...........................................62
3.6. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LACTOSE TRONG SỮA TƯƠI .
.....................................................................................................................63
3.6.1. Khảo sát tỷ lệ lượng chế phẩm và thể tích sữa .....................................63
3.6.2. Khảo sát thời gian thủy phân lactose trong sữa tươi.............................64
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................................65
4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................65
4.2. KIẾN NGHỊ .................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................66
PHỤ LỤC
PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

viii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Cấu trúc của một số oligosaccharide được tạo thành với xúc tác của
lactase trên cơ chất lactose ..........................................................................................4
Bảng 1.2: Nguồn lactase từ vi sinh vật .......................................................................5
Bảng 1.3: Đặc điểm của lactase từ các vi sinh vật ......................................................8
Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của lactase từ những nguồn vi sinh vật khác nhau ..........8

Bảng 1.5: Tính chất của lactase...................................................................................8
Bảng 1.6: Tính chất sinh lý và hóa lý của Lactobacillus acidophilus ......................12
Bảng 2.1: Thành phần MT1 ......................................................................................25
Bảng 2.2: Thành phần MT3 ......................................................................................26
Bảng 2.3: Các bước xác định hoạt tính lactase .........................................................40
Bảng 3.1: Kết quả tinh sạch lactase bằng sodium chloride .......................................44
Bảng 3.2: Kết quả tinh sạch lactse bằng muối ammonium sulfate ...........................45
Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch enzyme lactase bằng tác nhân acetone ........................48
Bảng 3.4: Kết quả tinh sạch enzyme lactase bằng tác nhân ethanol .........................50
Bảng 3.5: Kết quả tinh sạch enzyme lactase bằng tác nhân isopropanol ..................52
Bảng 3.6: Kết quả xác định hoạt tính những phân đoạn thu được sau khi tiến hành
xử lý sắc ký thẩm thấu gel mẫu enzyme thô .............................................................56
Bảng 3.7: Kết quả tinh sạch enzyme qua các công đoạn kết tủa và sắc ký thẩm thấu
gel ..............................................................................................................................56
Bảng 3.8: Tương quan giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng ............................62

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sự thủy phân lactose bằng lactase...............................................................2
Hình 1.2: Cơ chế thủy phân lactose bởi lactase ..........................................................3
Hình 1.3: Phản ứng chuyển galactosyl xúc tác bởi lactase .........................................4
Hình 1.4: Cấu trúc của enzyme lactase từ E. coli .....................................................11
Hình 1.5: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ..........................................12
Hình 1.6: Hình biểu diễn độ hòa tan của protein vào nồng độ muối trung tính .......16
Hình 2.1: Sự phân giải ONPG dưới tác dụng của lactase .........................................39
Hình 3.1: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của các tác nhân NaCl
...................................................................................................................................44
Hình 3.2: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của các tác nhân

(NH4)2SO4 .................................................................................................................46
Hình 3.3: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của tác nhân acetone 48
Hình 3.4: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của tác nhân ethanol 51
Hình 3.5: Biểu đồ biễu diễn hiệu quả kết tủa protein enzyme của tác nhân
isopropanol ................................................................................................................53
Hình 3.6: Biểu đồ so sánh hiệu quả kết tủa protein enzyme của các tác nhân ở điều
kiện mà mỗi tác nhân kết tủa hiệu quả nhất ..............................................................54
Hình 3.7: Kết quả phân tích hỗn hợp protein bằng sắc thẩm thấu gel gel ................55
Hình 3.8: Khối lượng phân tử của phân đoạn có thời gian lưu 6 – 8 phút................57
Hình 3.9: Kết quả điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tinh sạch .................................58
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính lactase ........................59
Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính lactase ................................................60
Hình 3.12: Độ bền hoạt tính của lactase tinh sạch theo thời gian ở những nhiệt độ
khác nhau...................................................................................................................61
Hình 3.13: Đồ thị xác định Km và Vmax theo phương pháp Lineaweaver Burk ........62
Hình 3.14: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose sữa tươi theo lượng enzyme
lactase sử dụng ..........................................................................................................63
Hình 3.15: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose theo thời gian..............................64

x


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013

GIỚI THIỆU
Trên thế giới, tồn tại một nhóm người khơng có khả năng tiêu thụ lactose, dẫn
đến việc họ khơng có khả năng sử dụng những sản phẩm chứa lactose như sữa và
những sản phẩm chế biến từ sữa (phô mai, yogurt, sữa chua…). Lý do chủ yếu do họ
thiếu enzyme lactase trong màng nhầy của ruột non, đây là một enzyme có khả năng
thủy phân lactose thành các đường đơn glucose và galactose. Khi họ sử dụng sản phẩm

sữa sẽ làm cho họ bị đau bụng, tiêu chảy, co thắt ruột hoặc đầy hơi không tiêu. Vấn đề
này có thể giải quyết, khắc phục nếu như lactose trong sản phẩm bị thủy phân thành
glucose và galactose. Ngoài ra, hàng năm ngành công nghiệp phô mai trên thế giới thải
bỏ khoảng gần 15 triệu tấn nước whey. Trong khi nước whey là một nguồn nguyên
liệu có giá trị lactose cao, có thể chuyển hóa thành syrup ứng dụng trong công nghiệp
chế biến sữa, bánh kẹo, nước giải khát [9,24,46].
Những vấn đề như trên sẽ có thể được giải quyết bằng cách sử dụng enzyme
lactase phân giải lactose trong sữa và những sản phẩm từ sữa thành glucose và
galactose mà cơ thể có thể hấp thụ được, đồng thời tận dụng nước whey sản xuất sản
phẩm có giá trị gia tăng [9,24,46].
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu tiến hành tách chiết tạo chế
phẩm lactase từ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
cũng như y học. Nhưng ở Việt Nam hiện vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thu nhận và
tinh sạch lactase, chỉ có ở lĩnh vực cơng nghệ sinh học đã nghiên cứu về tái tổ hợp gen,
tạo giống vi sinh vật sinh tổng hợp lactase hàm lượng cao.
Dưới những lợi ích mà lactase đem lại khơng chỉ cho sức khỏe con người, mà
cịn trong cơng nghệ chế biến thực phẩm và mơi trường, đồng thời tình hình nghiên
cứu lactase tinh sạch ở Việt Nam. Cho nên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thu nhận
và làm sạch lactase, với chế phẩm tinh chế thu được sẽ được xác định tính chất và
bước đầu khảo sát khả năng thủy phân lactose trong sữa tươi

1


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013

CHƯƠNG 1:
1.1.

TỔNG QUAN

LACTASE

1.1.1. Đặc điểm
Lactase là tên gọi thông thường của -D-galactosidase (-D-galactoside
galactohydrolase, EC 3.2.1.23) có khả năng thủy phân lactose thành các đường đơn
galactose và glucose (Gekas V, López-Leiva M; 1985). Ngồi ra, lactase cịn có khả
năng xúc tác phản ứng transglycosyl tạo galacto-oligosaccharides (Prenosil J.E và
cộng sự, 1987).
Lactase thủy phân các liên kết O-glycosyl tại các phần glycone của cơ chất
(hình 1.1). Một số tác động có thể làm thay đổi hoạt tính của enzyme như sự thay thế
nhóm hydroxylmethyl trên carbon số 6 bởi nhóm methyl hoặc một ngun tử hydro.
Kết

quả

làm

cho

enzyme

này

có

hoạt

tính

trên

-L-arabinoside

và

-D-fucoside. Ngồi ra, lactase có thể bị mất hoạt tính nếu cơ chất bị methyl hóa ở
carbon số 2, 3, 4, hoặc 6; mất cấu trúc vịng pyranose; hoặc cấu hình thay đổi từ β sang
α. Khi thay thế oxy bằng lưu huỳnh cũng làm enzyme mất hoạt tính nhưng khơng mất
liên kết ái lực.

Hình 1.1: Sự thủy phân lactose bằng lactase
Hoạt tính của lactase ở người giảm sau khi cai sữa, và điều này làm cho một số
người giảm khả năng tiêu thụ lactose. Vì vậy, lactase đã được ứng dụng trong ngành

2


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
dược nhằm hỗ trợ q trình tiêu hóa lactose và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
sản xuất sữa và những sản phẩm từ sữa nghèo lactose.
1.1.2. Cơ chế xúc tác
Lactase thủy phân lactose theo hai cơ chế [5,9]:
Thủy phân lactose tạo thành glucose và galactose:
Sử dụng enzyme thủy phân lactose là một trong những kỹ thuật sinh học quan
trọng nhất trong công nghiệp thực phẩm.
Vào năm 1994, Jacobson đã sử dụng enzyme lactase thu nhận từ Escherichia
coli để giải thích cơ chế thủy phân lactose thành glucose và galactose. Các nhà nghiên
cứu đã giả định trung tâm hoạt động của lactase chứa cysteine và histidine có chức
năng tương ứng là nhóm cho proton và nhận proton. Cysteine chứa nhóm sulphydryl

sẽ hoạt động như nhóm cho proton và histidine chứa vòng imidazole sẽ hoạt động như
tâm ái nhân để thuận tiện phân cắt liên kết glycoside trong quá trình thủy phân liên kết
β-glycoside của lactose (Mahoney 1998, Zhow and Chen 2001).
Với khả năng thủy phân lactose thành glucose và galactose, lactase đã có những
ứng dụng rất quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong công nghiệp chế
biến sữa và những sản phẩm từ sữa.

β-galactosidase

β-linkage
Lactose

Galactose

Glucose

Hình 1.2: Cơ chế thủy phân lactose bởi lactase (© Dr. Noel Sturm 2003)
Phản ứng chuyển nhóm galactosyl tạo oligosaccharide
Trong q trình thủy phân lactose, enzyme lactase cịn có khả năng gắn nhóm
glactosyl vào các phân tử đường, kết quả tạo ra những phân tử oligosaccharide. Nguồn
3


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
thu nhận enzyme, bản chất enzyme và nồng độ cơ chất sẽ quyết định số lượng cũng
như bản chất oligosaccharide hình thành thơng qua phản ứng chuyển nhóm galactosyl.
Nếu như nồng độ cơ chất sử dụng cao hơn và / hoặc giảm lượng nước sử dụng sẽ làm
tăng hiệu suất tạo oligosaccharide (Mahoney, 1998). Hiện tại, cơ chế của phản ứng này
vẫn chưa được biết rõ nhưng có lẽ liên quan đến việc các phân tử galactose liên kết 1,4
được chuyển thành liên kết 1,6 (Huber và cộng sự, 1976).

Các phân tử oligosaccharide có mặt trong thực phẩm có nhiều tác động có lợi
đến sức khỏe người tiêu dùng. Các phân tử oligosaccharide sẽ thúc đẩy sự phát triển và
tập hợp vi khuẩn có lợi (Hsu và cộng sự 2005). Hơn thế nữa, oligosaccharide cịn có
khả năng giảm hàm lượng cholesterol trong máu, thúc đẩy việc hấp thụ calci trong
thức ăn và thúc đẩy tổng hợp các vitamin nhóm B (Onishi và cộng sự 1995).

– Glucose
β-galactosidase
Lactose

β-6’galactosyllactose

Hình 1.3: Phản ứng chuyển galactosyl xúc tác bởi lactase
Bảng 1.1: Cấu trúc của một số oligosaccharide được tạo thành với xúc tác của lactase
trên cơ chất lactose (Nguồn: Mahoney 1998)
β-D-Gal (16)-D-Glc
β-D-Gal (16)-D-Gal
Disaccharide
β-D-Gal (13)-D-Glc
β-D-Gal (12)-D-Glc
β-D-Gal (13)-D-Gal
β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Glc
β-D-Gal (16)-β-D-Gal (14)-D-Glc
Trisaccharides β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-D-Gal
β-D-Gal (13)-β-D-Gal (14)-D-Glc
β-D-Gal (14)-β-D-Gal (14)-D-Glc
β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-β-D-Gal
Tetrasaccharide
(14)-D-Glc
Pentasaccharide β-D-Gal (16)-β-D-Gal (16)-β-D-Gal

Allolactose
Galactobiose

6’ digalactosyl-glucose
6’ galactosyl-lactose
6’ galactotriose
3’ galactosyl-lactose
4’ galactosyl-lactose
6’ digalactosyl-lactose
6’ trigalactosyl-lactose
4


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
(16)-β-D-Gal (14)-D-Glc
*Gal, Galactose
*Glc, Glucose
1.1.3. Nguồn thu nhận lactase
Lactase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên do có nhiều chức năng như vai trị
chức năng của nó như vai trị trong tiêu hóa, thối hóa lysosomal, vai trị trong q
trình dị hóa. Tuy nhiên, lactase được tìm thấy phổ biến ở thực vật, ruột động vật có vú
và ở các vi sinh vật như nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
Nguồn từ động thực vật:
Enzyme lactase được tìm thấy nhiều trong mơ thực vật, có vai trị nhất định liên
quan đến quá trình sinh học như tăng trưởng của cây, chín trái và thủy phân lactose.
Những nghiên cứu sinh học phân tử đã làm sáng tỏ vai trò của lactase đối với sự sinh
trưởng của cây và chín trái. Lactase có vai trị quan trọng đối với q trình chín của
trái hồng vì làm giảm đáng kể nồng độ galactosyl trong vách tế bào và thủy phân liên
kết với pectin. Enzyme lactase từ đu đủ thủy phân vách tế bào và làm mềm trái trong

suốt q trình chín (Lazan và cộng sự, 2004). Hầu như pH tối ưu cho enzyme lactase
từ thực vật nằm ở khoảng pH acid. Enzyme lactase tách từ quả hạnh có pH tối ưu 5,5,
nhiệt độ tối ưu 500C, duy trì được 89% hoạt tính sau 2 tháng lưu giữ ở 4oC.
Ở động vật hữu nhũ, enzyme lactase nằm trong đường tiêu hóa, đặc biệt nhiều ở
những động vật mới sinh ra (Husain, 2010).
Nguồn gốc từ vi sinh vật:
Trong ruột, enzyme này có vị trí tại các vi nhung mao của tế bào nhầy. Ở vi
sinh vật, các enzyme này là enzyme nội bào ở vi khuẩn, nấm men và có thể là nội bào
hoặc ngoại bào ở nấm sợi.

5


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
Bảng 1.2: Nguồn lactase từ vi sinh vật (Panesar và cộng sự, 2010)
Nguồn gốc

Vi sinh vật
Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii
Arthrobacter sp.
Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans,
Bacillus subtilis, Bacillus megaterum, Bacillus stearothermophilus
Bacteriodes polypragmatus
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis
Clostridium acetobutylicum,
Clostridium thermosulfurogens
Corynebacterium murisepticum
Enterobacter agglomerans, E. cloaceae
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae

L. acidophilus, L.bulgaricus, L. helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis,

Vi khuẩn

L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii
Leuconostoc citrovorum
Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento
Propioionibacterium shermanii
Pseudomonas fluorescens
Pseudoalteromonas haloplanktis
Streptococcus

cremoris,

Streptococcus

lactis,

Streptococcus

thermophius
Sulfolobus solfatarius
Thermoanaerobacter sp.
Thermus rubus, Thermus aquaticus
Trichoderma reesei
Vibrio cholera
Xanthomonas campestris
Nấm mốc

Alternaria alternate, Alternaria palmi

6


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
Aspergillus foelidis, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus fonsecaeus,
Aspergillus carbonarius, Aspergillus oryzae
Auerobasidium pullulans
Curvularia inaequalis
Fusarium monilliforme, Fusarium oxysporum
Mucor meihei, Muco pusillus
Neurospora crassa
Penicillum canescens, Penicillum chrysogenum, Penicillumexpansum
Saccharopolyspora rectivergula
Scopulariapsis sp.
Streptomyces violaceus
Bullera singularis
Candida pseudotropicalis
Nấm men

Saccharomyces anamensis, Saccharomyces lactis, Saccharomyces
fragilis
Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus


Lactase thu từ các nguồn khác nhau có đặc tính và cấu trúc riêng (trọng lượng
phân tử, chiều dài chuỗi amino acid, vị trí các trung tâm hoạt động, pH và nhiệt độ
hoạt động tối ưu (bảng 1.5)). Lựa chọn nguồn lactase phù hợp phụ thuộc vào điều kiện
phản ứng thủy phân lactose. Enzyme thương mại thường có pH acid (pH tối ưu < 5) sử
dụng trong xử lý chế biến whey chua, hoặc pH trung tính (pH tối ưu 5,5–7,0) sử dụng
trong sữa hay whey ngọt. Hoạt tính của các lactase phụ thuộc sự hiện diện của các ion.

Lactase từ nấm sợi có hoạt tính mà khơng cần các ion làm cofactor, lactase từ nấm
men cần có các ion như Mn2+, Mg2+, Na+, K+ làm cofactor. Ion Ca2+ và các kim loại
nặng ức chế hoạt tính của tất cả các lactase.

7


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
Bảng 1.3: Đặc điểm của lactase từ các vi sinh vật
Loại enzyme pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu

Vi sinh vật
Nấm sợi

Aspergillus niger
Aspergillus oryzae

Ngoại bào

3,0–4,0
5,0

55–60
50–55

Nấm men

Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces fragilis

Nội bào

6,5–7,0
6,6

30–35
30–35

Nội bào

7,2
6,2
6,5
6,0

40
55
66
65

Escherichia coli
Lactobacillus thermophilus
Vi khuẩn
Leuconostoc citrovorum
Bacillus circulans

Bảng 1.4: Tính chất hóa lý của lactase từ những nguồn vi sinh vật khác nhau (Zhou và
Chen, 2001)
Nguồn gốc
enzyem

K. lactis

E.coli

E.coli

A.niger

Khối lượng phân
tử (Da)

117618

116351

118016

119160

Độ dài (AA)

1025

1023

1031

1006

Proton donor

Glu482

Glu461

Glu449

Glu200

Nucleophile/base

Glu551

Glu537

Glu512

Glu298

Bảng 1.5: Tính chất của lactase (Gikas và López-Leiva 1985, Mahoney 1985)
Nguồn gốc
enzyem

pHopt

Topt

Khối lượng phân tử
(kDa)

A.niger

3,0 –
4,0

55 – 60

124

A.oryzae

5,0

50 – 55

90

K.fragils

6,9 –
7,3

37

201

K+, Mn2+,
Mg2+

Ca2+, Na+

K.lactis

7,2

35

135

K+, Mg2+

Ca2+, Na+

E.coli

6,2 –
7,1

40

540

K+, Na+

Coenzyme

Inhibitors

8

Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013

L.thermophilus

3,4 –
4,3

55 – 57

C.inaegualis

6,0

30 – 55

B.circulans

6,8

60 – 65

Bacillus sp.

6,5 –
7,5

65
42 – 45

L.bulgaricus
S.thermophilus

530

7,1

55

500 – 600

K+, Mg2+

Ca2+

Trong thương mại, lactase được sản xuất từ các vi sinh vật có hiệu suất cao hơn
từ thực vật và động vật, và nó được xem là an toàn khi sử dụng trong thực phẩm. Có
thể sử dụng lactase từ các nguồn khác bằng cách nhân bản chúng trong các tế bào chủ.
Hai loại lactase thường dùng trong các q trình chế biến cơng nghiệp là enzyme có
hoạt tính ổn định nhiệt và enzyme hoạt động lạnh. Enzyme hoạt tính ổn định nhiệt có
ưu điểm là sử dụng được ở nhiệt độ cao và trong điều kiện này các vi sinh vật không
mong muốn sẽ bị ức chế. Enzyme hoạt động lạnh được sử dụng trong các quá trình chế
biến sản phẩm từ sữa ở điều kiện ơn hịa để ổn định và duy trì các thành phần dinh
dưỡng. Ngoài ra, enzyme này cũng được sử dụng trong y học, hóa học và phân tích.
Nguồn lactase từ nấm mốc: Enzyme lactase từ nấm mốc có pH tối ưu nằm
trong khoảng acid từ 2,5 đến 5,4, do đó có hiệu quả nhất khi thủy phân lactose trong
các sản phẩm có tính acid như whey. Enzyme lactase từ nguồn này thường là enzyme
chịu nhiệt. Tuy nhiên, enzyme này dễ bị ức chế ngược do sản phẩm mà chủ yếu là
galactose. Nấm mốc thường sử dụng lactose với tỷ lệ rất thấp, với hai cơ chế chuyển

hóa lactose là thủy phân ngoại bào và hấp thu các monomer và hấp thu luôn
disaccharide. Enzyme lactase từ Aspergillus oryzae được tinh sạch bằng dung môi 2propanol trên DEAE-Sephadex A-50 và Sephadex G-200, có pH tối ưu với Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) là 4,5 còn lactose là 4,8. Khoảng pH hoạt
động từ 4,0 đến 9,0, nhiệt độ tối ưu 46oC. Hằng số Michaelis với ONPG là 7,2 x 10-4M
và 1,8 × 10-2M với lactose. Hg2+, Cu2+, sodium lauryl sulfate và N-bromo-succinimide
là những thành phần kìm hãm hoạt tính lactase (Husain, 2010).

9


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
Nguồn lactase từ nấm men: Enzyme lactase của nấm men có hoạt tính cao
trong đệm ở khoảng pH 6,0 đến 7,0 (Genari và cộng sự, 2003). Nấm men K. lactis là
nguồn quan trọng để sản xuất lactase thương mại. Enzyme lactase từ nguồn này được
ứng dụng rộng rãi để thủy phân lactose trong sữa, tạo ra nhiều sản phẩm từ sữa mà
người khơng dung nạp lactose có thể sử dụng được. Nguồn lactase từ K. lactis đã được
thương mại hóa dưới các tên Maxilact (DSM Food Specialties, Delft, The
Netherlands) và Lactase (SNAM Progetti, Italy), còn Lactozym (Novo, NordiskA/S,
Bagsvaerd, Denmark) là sản phẩm thương mại từ K. fragilis (Panesar, 2010).
Nguồn lactase từ vi khuẩn: Enzyme lactase từ vi khuẩn được ứng dụng rộng
rãi trong thủy phân lactose vì dễ lên men, hoạt tính enzyme cao và ổn định. Tuy nhiên,
khả năng sinh tổng hợp enzyme lactase từ nguồn vi khuẩn thấp hơn 10 lần so với nấm
men. Điều này có thể cải thiện thơng qua q trình tối ưu thành phần môi trường và
điều kiện lên men hay sử dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Üstok, 2007).
1.1.4. Cấu trúc của enzyme lactase
Theo Matthews (2005) nghiên cứu về enzyme lactase nguồn gốc từ vi khuẩn E.
coli thì enzyme này bao gồm bốn chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi 1023 amino acid,
monomer A-D. Mỗi monomer gồm 5 vùng được Matthews thể hiện qua 5 màu: xanh
dương, xanh lá cây, vàng, lục lam và đỏ (hình 1.4). Vùng 1 là nơi gắn Mg2+. Vùng 2 là
nơi gắn Na+. Hai ion này cần cho sự hoạt động mạnh của enzyme lactase. Vùng 3 có
cấu trúc ống đan (barrel) α/β hoặc gấp khúc “TIM” gắn với vị trí hoạt động ở C cuối

của ống đan (Matthews, 2005).

10


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013

Hình 1.4: Cấu trúc của enzyme lactase từ E. coli (Matthews, 2005)
Bốn monomer này nằm trên bốn gốc vuông. Ba giao diện riêng biệt được hình
thành giữa những cặp monomer khác nhau. Thứ nhất là giao diện “long” giữa các
monomer đối xứng qua trục hoành như A và B, C và D với khoảng cách 4000 Ao2.
Thứ hai là giao diện “activating” giữa các monomer đối xứng qua trục tung như A và
D, B và C với khoảng cách 4600 A . Thứ ba là giao diện nhỏ hơn giữa A và C, B và D
với khoảng cách 230 Ao2 (Matthews, 2005).
1.2.

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS
Phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey thì L. acidophilus thuộc:
 Ngành: Firicules
 Lớp: Bacilli
 Bộ: Lactobacillales
 Họ: Lactobacillaceae
 Giống: Lactobacillus

11


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
Đặc điểm chung: vi khuẩn hình que gram dương, dạng đơn, dạng đôi hoặc

dạng chuỗi ngắn, rộng khoảng 0,6 – 0,9µm, dài khoảng 1,5 – 6µm. Khơng có tiêm
mao, không chuyển động và không sinh bào tử và không chịu được nồng độ muối.

Hình 1.5: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (Sciencephotolibrary)
Vi sinh vật không chứa cytochrome nên không phản ứng với benzen. Thêm vào
đó, vì là vi sinh vật vi hiếu khi, nên sự sinh trưởng trên bề mặt môi trường rắn được
gia tăng bằng cách giảm lượng khơng khí hoặc giảm áp suất oxy và tăng 5 – 10% CO2.
Bảng 1.6: Tính chất sinh lý và hóa lý của Lactobacillus acidophilus (Kurmann và
Rasic, Mital và Garg)
Sinh lý
Vi hiếu khí

Thành phần thành tế bào
Loại Peptidoglycan

Lys-D Asp

Thành phần phospholipid / teichoic acid

Glycerol

Thành phần base của DNA (mol % G+C)

34 – 37

Đồng phân acid lactic
Chuyển hóa đường

DL
Lên men đồng hình

Hầu hết các giống của L. acidophilus có thể lên men amygdalin, cellobiose,
fructose, galactose, glucose, lactose, maltose, mannose, salicin, sucrose, trehalose và
aesculine. Thực tế, lactose là loại đường duy nhất có mặt trong sữa, hiện vẫn chưa có
báo cáo về việc L. acidophilus sử dụng sucrose hiệu quả hơn lactose hay không. Hơn
12


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
thế nữa, glucose và fructose có thể được L. acidophilus sử dụng, ngược lại galactose
thì mức độ sử dụng khơng rõ rệt. Glucose có thể được chuyển hóa theo con đường
Embden-Meyerhof-Parnas và acid lactic là sản phẩm chính của quá trình (lên men
đồng hình). Hiệu suất sản sinh acid lactic là 1,8mol/mol glucose, kèm theo một lượng
nhỏ những cơ chất khác. Acetaldehyde là sản phẩm từ quá trình chuyển hóa lactose,
mặc dù trong một số ví dụ thì nó được tạo ra từ q trình chuyển hóa những cơ chất
chứa nitrogen, như là threonine, hoạt tính threonin aldolase rất cao cũng được phát
hiện ở L. acidophilus.
Điều kiện sinh trưởng: Nhiệt độ tối ưu khoảng 35 – 40oC, có khả năng chịu
được nồng độ acid thay đổi từ 0,3% – 1,9%, pH tối ưu nằm khoảng 5,5 – 6. L.
acidophilus đòi hỏi điều kiện sinh trưởng phức tạp. Để vi khuẩn L.acidophilus sinh
trưởng và phát triển, môi trường cần cung cấp nguồn carbon, protein, vitamin B, dẫn
xuất acid nucleic, acid béo tự do khơng bão hịa, nguồn khống (magie, mangan, sắt)
và hàm lượng oxy thấp. Ngồi ra, sự có mặt của các nhóm thiol trong whey protein có
khả năng hỗ trợ sự sinh trưởng của L.acidophilus, ngược lại pepton và trypsin lại kích
thích việc sản sinh acid. Thêm nước ép cà chua (như nguồn đường đơn giản, khoáng,
và vitamin B) vào sữa gầy để thúc đẩy sự gia tăng sinh trưởng và hoạt tính của L.
acidophilus (như cải thiện khả năng sử dụng đường và pH thấp hơn). Vì lẽ đó, những
chất dinh dưỡng quan trọng này nên có mặt trong môi trường để tạo điều kiện sinh
trưởng tốt nhất cho giống L. acidophilus, trong những nghiên cứu gần đây về môi
trường tối ưu của L. acidophilus, Tail landier và cộng sự đã kết luận rằng điều kiện tối

ưu là pH 6,0, 30oC, 40 g/L glucose, 20 g/L peptone, 20 g/L dịch chiết nấm men, 5 g/L
natri acetate và 3 g/L natri citrate.
Những lợi ích khi sử dụng giống Lactobacillus acidophilus:
 Giống lactobacilli thường được sử dụng trong công nghiệp như là những
probiotic.
 Thủy phân lactose trong điều kiện ôn hịa, thích hợp sử dụng đối với những
sản phẩm từ sữa.

13


Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013
 Khơng có hoặc ít gây ra phản ứng phụ.
 Đây là giống vi sinh vật an toàn khi sử dụng vì thế enzyme có nguồn từ
chúng có thể sử dụng mà không cần quá tinh sạch (Vasiljevic and Jelen
2002).
 Chúng có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản sinh ra acid,
hydro peroxide và bacteriocins (Chang và cộng sự 2001).
 Có thể chịu được giá trị pH thấp (Vinderola and Reinheimer 2003).
1.3.

PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ENZYME [10]
Kết tủa là một phương pháp để tách protein ra khỏi hỗn hợp. Phương pháp kết

tủa vẫn là một quá trình quan trọng khi thu nhận và tinh sạch protein ở quy mơ phịng
thí nghiệm và cơng nghiệp và đóng vai trị quan trọng trong việc xử lý mẫu trước khi
sử dụng phương pháp sắc ký. Hiệu quả của việc chạy sắc ký phụ thuộc rất lớn vào
những bước ban đầu liên quan đến quá trình kết tủa (Englard and Seifer 1990). Chức
năng chính của q trình kết tủa là làm giàu nồng độ protein cần tách chiết. Protein kết
tủa từ một thể tích lớn của dung dịch thơ ban đầu có thể hịa tan lại sau đó bằng một

lượng đệm nhỏ hơn. Quá trình này cũng dễ dàng khi thực hiện ở quy mô lớn, thiết bị
sử dụng đơn giản, khơng đắt tiền và khơng làm biến tính những sản phẩm có hoạt tính
sinh học (Glatz 1990). Để kết tủa protein cần thu nhận có thể bổ sung một lượng lớn
muối như ammonium sulfate, hoặc dùng polymer như polyehtylene glycol (PEG),
hoặc dung môi hữu cơ ái nước như acetone hoặc ethanol (Scopes, 1994). Tuy nhiên
phương pháp sử dụng muối hoặc dung môi hữu cơ là hay sử dụng nhất.
Dựa trên khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, người ta
sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta được một
số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngồi muối (NH4)2SO4
ra, người ta cịn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme. Phương pháp kết
tủa thường làm enzyme biến tính rất nhanh. Vì thế, trước khi tiến hành kết tủa, người
ta phải tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme.

14