Tài liệu Bài thuyết trình Kỹ thuật PCR và Ứng dụng trong Y học ppt

•
I. Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR
•
II. Nguyên lí hoạt động của PCR
•
III. Một số ứng dụng của PCR trong y học
•
Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR
trong việc lấy mẫu đem phân tích
•
1. Xác định quan hệ huyết thống
•
2. Xác định bệnh lao nhờ vsv
•
3. Xác định bệnh HIV, HBV, HCV, KST,
Dengue virus
•
4. Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định thành phần ,
cơ cấu ký sinh trùng sốt rét

I.Giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR
•
Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu
trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ
Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật
tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR)
vào năm 1985. PCR là phương pháp in
vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù
nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide
gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với

sự tham gia của DNA polymerase.

•
Phản ứng PCR được thực
hiện qua 3 giai đoạn trong 1
chu kì:
- Giai đoạn biến tính
(denaturation)
- Giai đoạn bắt cặp
(annealing)
- Giai đoạn kéo dài
(elongaction)
Chu kì này được lặp đi
lặp lại từ 20 - 40 lần và cho ra
các sản phẩm cuối cùng của
PCR là các đoạn DNA hoặc
RNA phiên bản. Số lượng các
bản sao này được tính theo
hàm số mũ.
Máy PCR


II.Nguyên lí hoạt động của PCR
1. Các thành phần tham gia vào
phản ứng PCR ( PCR mix):
•
- DNA khuôn
•
- Taq. DNA polymerase.
•

- d NTPs (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP).
•
- Primer ( oligonucleotide).
•
- PCR buffer.
2. Ba giai đoạn phản ứng PCR
thực hiện trên máy luân nhiệt
(Thermalcycles)
- Giai đoạn biến tính
(denaturation): 92 – 98 độ C
-
Giai đoạn bắt cặp (annealing)
45 thoi gian 20s-2phut
-
Giai đoạn kéo dài (elongaction)
nhiệt độ 68-72

Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy
mẫu đem phân tích
Các bệnh phẩm y học
↓
Ly trích pre - nucleic acide
↓
Ly trích acide nucleic tinh
khiết
↓
PCR ( RT - PCR)
↓
Phân tích phát hiện sản phẩm

PCR bằng quang phổ hay điện
di
Thực hiện xét nghiệm chẩn
đoán bằng PCR

Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR
•
1. Lấy mẫu: ADN có thể
tách chiết từ những mẫu
khác nhau, như máu tươi,
máu khô, tế bào niêm mạc,
nước xúc miệng, tóc, da,
phân, v.v... Mẫu có thể lấy
tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng
nghìn kilômet, mất nhiều
ngày, trong phong bì bình
thường, qua bưu điện, không
cần bảo quản lạnh.
Lấy mẫu đem phân tích

•
2. Tách chiết ADN: Nhiều
quy trình tách chiết ADN
khác nhau của thế giới đã
được nghiên cứu, thử
nghiệm và thích ứng với
điều kiện nước ta. Do vậy,
góp phần giảm giá thành,
tiết kiệm kinh phí. Với
mỗi loại mẫu có một quy

trình tách chiết thích hợp
riêng. Đảm bảo chất lượng
và số lượng ADN từ
những lượng mẫu nhỏ.
Tách chiết ADN

•
3. Nhân ADN đặc hiệu: Đây
là khâu quan trọng nhất của
quy trình. Các hỗn hợp hoá
chất khác nhau và các chu
trình nhiệt khác nhau đã
được thử nghiệm cho từng
cặp mồi. Trên cơ sở đó, đã
tối ưu hoá thành phần của
từng hỗn hợp, từng chu trình
nhiệt cho từng cặp mồi, dựa
vào những hoá chất sẵn có
trên thị trường trong nước
Nhân ADN đặc hiệu