Bài giảng Nghiên cứu sinh khả dụng của viên nén Capecitabine 500 mg trên chó bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS - TS. Chử Văn Mến

HỘI NGHỊ NỘI KHOA TỒN QUỐC LẦN THỨ XII 

 NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG CỦA VIÊN NÉN CAPECITABINE 500 MG 
TRÊN CHĨ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS
8000
VTB1
LTB1
6000

4000

2000

Plasma concentration (ng/mL)

0
0

2

4

6

8

10

12

Time (h)

TS. Chử Văn Mến

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


ĐẶT VẤN ĐỀ

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ưu điểm của phương pháp LC/MS/MS

•
•
•

Độ  nhạy  cao  thích  hợp  phân 
tích thuốc trong huyết tương
Thời  gian  phân  tích  ngắn  so 
với các phương pháp khác
Phân  tích  được  đồng  thời 
nhiều chất, cho độ đặc hiệu, 
độ chính xác cao

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


ĐẶT VẤN ĐỀ

Đề tài  “Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của  viên nén bao 
phim chứa capecitabine” với các mục tiêu:
1.  Xây  dựng  và  thẩm  định  được  phương  pháp  định  lượng 
Capecitabine trong huyết tương chó bằng sắc ký lỏng khối phổ.
2.  Đánh  giá  được  tương  đương  sinh  học  viên  nén  chứa 
capecitabine trên chó thực nghiêm.
̣

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC LẦN THỨ XII 

NGUYÊN VẬT LIỆU & 
PHƯƠNG PHÁP

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


VẬT LIỆU & THIẾT BỊ

Thi
ết Bịẩn: Capecitabine chuẩn
•• Ch
ất chu


VẬT LIỆU & THIẾT BỊ

Động vật thí nghiệm, thuốc 
thử, thuốc đối chứng
• Động vật thí nghiệm: chó giống đực, khỏe 
mạnh, cân năng 10 ­ 12 kg,
̣
•  Mẫu trắng: Huyết tương chó,
• Thuốc thử (T): viên nén Capecitabine 500 mg; do Cơng ty CP 
Dược­ TTB Y tế Bình Định ( BIDIPHAR) sản xuất,
• Thuốc đối chứng (R): viên nén bao phim Xeloda chứa 
Capecitabine 500 mg ( Roche, Thụy Sỹ)
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.  XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

• Khảo sát điều kiện sắc kí và khối phổ
­ Xác định các thơng số tối ưu cho MS/MS
­ Xác định các điều kiện sắc kí
• Khảo sát quy trình xử lí mẫu
­ Tủa protein
­ Kiềm hóa huyết tương

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
• Tính tương thích của hệ thống

• Tính chọn lọc ­ đặc hiệu
• Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
• Giới hạn định lượng dưới (LOQ) 
• Độ đúng­ độ chính xác
• Tỷ lệ thu hồi
• Độ ổn định
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3. ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC
Chó thực nghiệm

Giai đoạn 1

Giai đoạn 2

Nhóm 1

Thuốc thử T

Thuốc đối chiếu R

Nhóm 2

Thuốc đối chiếu R

Thuốc thử T

Xác định thơng số DĐH

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


HỘI NGHỊ NỘI KHOA TOÀN QUỐC LẦN THỨ XII 

KẾT QUẢ VÀ BÀN 
LUẬN

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KTQUVBNLUN

IUKINSCKí:
Thitbphõntớch:HthngLC/MS/MSXevoTQDWater
Ctscký:CtC18(50ì2,1mm;1,7àm),
Pha ng: MeCN CH3COONH4 5 mM (+0,1% acid formic)
Tcdũng:0,2mL/phỳt
Thtớchtiờm:5àL
IUKINKHIPH:

Trungtõmthnghimlõmsngvtngngsinhhc


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
THƠNG SỐ CỦA DETECTOR KHỐI PHỔ
 Chất phân tích

Capecitabin

IS (Felodipin)

ESI (+)
4
24

ESI (+)
4
20

Desolvation temperature (oC)

350

350

Desolvation gas (L/H)

850

850

Cone gas (L/H)

60

60

Collision energy (V)

12

10

Parent ion (Dalton)

360,05

384,10

Product ion (Dalton)

244,02

352,18

Thơng số
Chế độ ion hố
Capillary voltage (kV)
Cone voltage (V)


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
XỬ LÍ MẪU

0,5 mL huyết tương
20 µLdd chuẩn nội
vortex
Dung mơi 

lắc xốy  

hh ethyl acetat

hh đồng nhất
ly tâm (5 phút, 3000 vịng/phút)
2,2 mL dịch trong phía trên 
bốc hơi (N2, 40oC)
Cắn
0,5  µL pha động
Tiêm sắc kí
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
SỰ PHÙ HỢP CỦA HỆ THỐNG SẮC KÝ
AS

STT
 
1
2
3
4
5
6
TB
CV 
(%)

IS

Tỷ 
Đáp ứng lệAS/IS

Rt

Đáp ứng

Rt

0,65
0,65
0,65
0,65
0,65
0,65
0,65

2659435
2663505
2679414
2662085
2651727
2663414
2663263

0,81
0,81
0,81

0,81
0,81
0,81
0,81

2118422
2050961
2039668
2075831
2050238
2062857
2066330

1,255
1,299
1,314
1,282
1,293
1,291
1,289

0

0,3

0

1,4

1,5

Tính tương thích cao
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ĐỘ CHỌN LỌC­ ĐẶC HIỆU
Capecitabine

Tỷ lệ
STT
Blank/ 
Blank LLOQ
Blank
LLOQ 
1
2
3
4
5
6

169 28678
1566 36604
675 33302
150 31610
129 37901
100 30500
Đạt (<20%)

0,006
0,043
0,02
0,005
0,003
0,003

767
577
488
420
319
145

DHCL-LLOQ6 Smooth(Mn,1x2)

IS 
IS

Tỷ lệ
trắng/ IS

2143819 0,00036
2143819 0,00027
2143819 0,00023
2143819 0,0002
2143819 0,00015
2143819 0,00007
 Đạt (<5%)

100

MRM of 2 channels,ES+
360.05 > 244.02
3.992e+005

Capecitabin
0.65
30500

%

0

min

DHCL-LLOQ6 Smooth(Mn,1x2)

MRM of 2 channels,ES+
384.1 > 352.18
2.414e+007

Felodipin
0.81
2163493

100

%

0

0.20

Chọn lọc đặc hiệu cao
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

min


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG DƯỚI (LLOQ)
ZE Smooth(Mn,1x2)

MRM of 2 channels,ES+
360.05 > 244.02
2.608e+004

Capecitabin
0.65
2051

100

%
0

min

ZE Smooth(Mn,1x2)

MRM of 2 channels,ES+
384.1 > 352.18
2.084e+007

Felodipin
0.81
1807559

100
%

0

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

Đạt yêu cầu ở nồng độ 20 ng/ml
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học

min


KẾT QUẢ VÀ BÀN 
LUẬN
ĐƯỜNG CHUẨN
Nồng độ

Độ chính xác (% so với nồng độ lý thuyết)
CC1

CC2 

CC3

CC4

CC5

SC1
SC2
SC3
SC4
SC5
SC6
SC7
SC8

100,4
98,0
102,2
97,1
105,5
102,4
98,4
96,0

100,3
96,4
105,5
98,1
103,9
105,4
99,2
91,2

99,2

101,9
100,4
99,1
100,7
100,9
102,2
95,5

102,2
94,1
96,6
105,2
109,6
102,1
94,3
95,9

98,3
105,4
96,3
102,4
99,9
101,3
105,4
90,9

Kết luận

Đạ t

Đạ t

Đạ t

Đạ t

Đạ t

Độ chính xác cao
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ĐỘ ĐÚNG VÀ ĐỘ CHÍNH XÁC TRONG NGÀY
M ẫu

NC (%)

LLOQ (20 ng/mL) 19,9  ± 8,1
LQC(60 ng/mL)

65,3 ±13,9

Độ đúng(%)
100,2 ±8,0
108,9 ±13,9

MQC (2500 ng/mL) 2278,0 ±7,2

91,1 ±7,2

HQC (4000 ng/mL) 3728,7 ±3,0

93,2 ±3,0

Độ đúng, độ chính xác cao

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

ĐỘ NHIỄ M CHÉ O (CARRY­OVER)

Độ nhiễm chéo  Đạt/ Không  Độ nhiễm chéo  Đạt/ Không 
SST
của AS (%)
đạt
của IS (%)
đạt
1
2
3
4
5
6

1,59
5,03
3,11

1,82
1,03
1,44

Đạt
Đạt
Đạt
Đạt
Đạt
Đạt

0,03
0,02
0,03
0,03
0,02
0,03

Không bị nhiễm chéo
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học

Đạt
Đạt
Đạt
Đạt
Đạt
Đạt


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Ỷ LỆ THU HỒI 
LQC
STT
Nền  Huyết  
mẫu tương
1
117712 57276
2
116558 65040
3
129929 55932
4
123044 62706
5
115343 57783
TB 120517 59747
CV (%) 5,0
6,6
(%)
90,1
Trung 
bình 
(%)

MQC
Huyết  
Nền  mẫu
tương
5131660 2413374

4029828 2398583
6163489 2681405
4571135 2439185
5114416 2675348
5002106 2521579
15,8
5,7
91,7

HQC
Huyết  
Nền mẫu
tương
7639520 3723857
7486843 4468645
7751463 4419254
7849912 4036143
7574336 4613783
7660415 4252336
1,9
8,6
100,9
94,2 

Tỷ lệ thu hồi cao

IS
Huyết  
tương
2859490 1682482

2649467 1747210
3030079 1698576
2696481 1690586
2979224 1699737
2842948 1703718
5,9
1,5
109,0*

Nền mẫu


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ẢNH HƯỞNG CỦA NỀN MẪU

STT
1
2
3
4
5
6

MFAS
LQC
HQC
0,571
0,769
0,567
0,782

0,628
0,799
0,541
0,916
0,564
1,085
0,433
1,209
Trung bình

MFIS
LQC
HQC
0,993 0,868
0,928 0,882
0,904 0,904
0,846 0,966
0,860 1,123
0,844 1,156

CV (%) 

Ảnh hưởng thấp
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học

MFAS/MFIS
LQC
HQC
0,575
0,819

0,611
0,849
0,694
0,878
0,639
0,893
0,656
1,011
0,513
1,134
0,615
0,931
10,5

12,8


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
ĐỘ ỔN ĐỊNH 
AS (30 µg/mL)

IS (5 µg/mL)

STT

Ban đầu (0h)

Sau 5(h)

Ban đầu (0h)

Sau 5(h)

1
2
3

220818
30,013
31,757
31,549

220818
30,660
31,238
31,645

220818
4,756
4,760
4,731

220818
4,916
4,918
4,920

Trung bình

31,106

31,181

4,749

4,918

CV (%)

3,1

1,6

0,327

0,040

Độ lệch (%)

­

0,2

­

3,6

Kết luận

­

Đạ t

­

Đạ t

Độ ổn định cao
Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

8000
VTB1
LTB1
6000

Tương đương

4000

2000

Plasma concentration

0
0

2

4

6

8

10

12

Time (h)

Đường cong nồng độ thuốc trung bình theo thời gian của 24 cá 
thể chó sau khi uống thuốc thử T và thuốc chứng R 

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

CÁC THƠNG SỐ DĐH CỦA CAPECITABINE
         
Cmax  ± SD
AUC0­24  ± SD 
AUC0­∞   ± SD 
Tmax   ± SD
   Nhóm
(ng/ml)
(ng,h/ml)

(ng,h/ml)
(giờ)
 
6209,90 ± 2553,31 12632,40 ± 3851,64 12632,55 ± 3851,64 1,69 ± 0,29
Thử
 
Chứng

6033,20 ± 1960,53 12066,87 ± 3992,88 12067,00± 3992,96 1,63 ± 0,30

Trung tâm thử nghiệm lâm sàng và tương đương sinh học