Ứng dụng kỹ thuật real time PCR để phát hiện đa hình đơn nucleotid rs2856718 của gen HLA DQ trên bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan

•KT

4» HỄ?


LÙI CẢM ƠN
Khoa luận tốt nghiệp ỉả một trong nhùng cột mốc đáng nhớ nhất, đánh

dau cho qua tnnli học tập va nghiên cửu cua sinh viên tại trường đại hục. Đê

hốn thảnh khỗ luận nãy. ngồi sự nị lực cua ban thán, em dà nhận được rất

nhiều sự giúp đờ từ phía các thầy cơ. gia dính và bạn be.
Với lòng lành trọng vả biết
thành tới:
Ban Giám Hỉịu. Phong Quan fý Dào tụo Dụi học. Khoa Kỹ thuật >*

học, Trung tám lighten cừĩt Gene JỄ Protein - Trưởng Dại học Y Hà Nội.
Bệnh viện K trung ương (cư sư 3) đả tạo mụi diều kiện thuận lợi giup em

hoãn thành khoa luận.
Em xin chân thảnh câm ơn GS. TS Tạ Thành I 'ản. Giảm dốc trung tàm

nghiên cứu Gene & Protein, người Thầy dà lụo điều kiện cho em thực hiện
khõa luận tai trung tám.
Dặc biệt em xin gưi lòi cam ơn chân thành nhất tới TS. Nguyễn Trọng

Tuệ. người dã trực tiếp hướng dẫn. tận tinh dạy bao va tụo mọi điều kiện giúp
đờ cho em trong suốt quá trinh thực hiện khóa luận náy.
Em xin căm (TJ1 ES. Nguyền Thu Thúy, là người đà hướng dàn. chia sc

cho em những kỳ thuật vá kinh nglũèm hừu ich trong quá trinh thực hiện khóa

luận, cũng cãc thầy cô vả anh chi tại trung tâm nghiên cửu Gen & Protein, cảc

thầy cô khoa Kỳ thuật Y học, Trường Đụi học Y Hà Nội. đà tạo diêu kiện
thuôn lợi cho em trong suờt quá trinh học tập và hoãn thành khóa luận nãy.
Cuồi cùng, em xin gửi lởi cam ơn lới bổ mẹ. ngưởi thán, bạn bê dà

quan tàm dộng vén em trong suốt quã trinli hục tập và nghiên cứu.

Hà NỘI. ngày

thủng

nảm 202ỉ

Nguyễn Thị Thúy

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


LỊI CAM DOAN
Kinh girl: Phịng Qn ụ Dào tạo l)ạỉ học - Trường Dại học Y Hà NỘI

Hội dồng chấm khóa luận tốt nghiệp

Em tên là Nguyễn Thi Thúy, sinh viên tờ 31. lứp Y4K, chuyên ngành
Xet nghiệm Y học. niên khóa 2017 - 2021. Trường Đại học Y Hà Nội.

Em xin cam đoan:

1. Đây lả khóa luận do bán thân em trục tiếp thực hiộn dưới sự hưởng dản
cua rs. Nguyễn Trọng Tttf.

2. Nghiên cứu nãy không trúng lập với bát kỳ nghiên cứu nào khác dà
được cõng bổ iruởc đày.

3. Các số liệu và thòng tin trong nghiên cứu la hoan toán chinh xác. trung
thực \-a khách quan.
Em xin hoàn toàn clụu trách nhiộm về nhũng cam két náy.

Hà Nội. ngày

thủng

nám 202J

Sinh viên

Nguyen Thị Thủy

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?

MỤC LỤC

LỜI CAM ƠN
LỜI CAM DOAN

DANH MỤC CHƯ VI ÉT TẢT
DANH MỤC BANG
DANH MỤC HĨNH

CHƯƠNG I. TONG QVAN TÀI LlẸV----------------

1.1. Tỏng quan VC ung thư biểu mỏ tẻ bão gan..............
1.1.1. Sơ lược VC ung thư biêu mò tế bào gau.........
1.12. Các yểu tổ nguy cơ chính..................................
1.2. Tớng quan vè gen HLA-DQ.....................................
1.3. Tông quan VC SNP rs2856718 cua gen HLA-DQ...
1.3.1. Khái niệm và cách xác định SNPs...................

1.32. SNP «2856718 cua genHLA-DQ...................

1.4. Kỳ thuỹt Real-time PCR pliảt hiện SNP «2856718 cua gen HL A-DQ.... 10
CHƯƠNG 2.1)ÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứt____ 15

2.1. Thời gian

địa diem nghiên cứu..............................

2.1.1. Thời gian nghiên cửu:.........................................

2.12. Địa điềm nghiên cửu................................... ........
2.2. Đối tượng nghiên cửu..

2.3. Phương pháp nghiên cứu.............................................

2.4. Quy tỉ inh nghiencưu..... .....•■.... ................................
2.5. Chuẩnbị dụng cụ. trang thi Ct bị vã hoa chất sư dụng

2.5.1. Chuânbi dung cu, trang thiết bị...........................
2.52. Chuân bi hóa chát..................................................

•W.-

<€

4* HỄ?

17


2.6. Quy trinh kỳ thuật • •••••••••••••••••••••••••••••••••••■•••••••••••••••••••••■•••••■•••••••■•••••a .... 18

2.6.1. Thu thập và bão quân màu bệnh phàm.........................................

18

2.62. Quy trinh tách chiết DNA từ mau mị...........................................
2.63. Kỳ thuật Real-time PCR............

??

• •••••

2.7.1).H> đức trong nghiên cứu y hục...........................................................

CHƯƠNG 3. KÉT QUA NGHIÊN cút________________________

25

3.1. Dậc diêm chung cùa đổi tuợng nghiên cửu......................................... • ••• Ma/
25

3.2. Kèt qua tách chiêt DNA • •••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
3.3. Kct qua xác dinh kicu gen SNP FS2856718 bang kỳ thuât Real-time PCR... 29
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN____________________________________

34

4.1. Đặc diêm cua nhóm nghiên cứu..........................................................

34

4.2. Kèt qua tách chiêt DNA.......................................................................

34

4.3. Kèt qua Real-time PCR • •••••»••■

•••••••••

37

4.4. So sánh với cảc nghiên cúu trn thố giúi...........................................

..40

KT LUN ã M ãããããã M ãããããããããããããããããããããããôãããããããããã ã ••••• ••••••••••
TÀI LIỆU THAM KHAO

PHỤ Lực

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?

•••••••«•• ••••••• •••••••••••

43


DANH MỤC CHỪ VIẾT TÁT

Chừ viết Út

Nghĩa cua ch ử xiết tít

HCC

Hepatocellular carcinoma

HBV

Hepatitis B xirus

HCV

Hepatitis c virus

HTV

Human immunodeficiency virus

HLA

Human Leukocyte Antigen

AFB1

Aflatoxin Bl

PCR

Polymerase Chain Reaction

SNPs

Single nucleotide polymorphisms

DNA

Deoxyribonucleic Acid

WHO

World Health Organization

A

Adenine

T

Thymine

G

Guanine

c

Cytosine

OD

Optical Density

EDTA

Ethylen Diamin Tetra Acetic

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH .MỤC BÂNG

Bang 2.1. Thành phàn cua phan img Real-time PCR....................................... 23
Bang 3.1 Dặc diêm chưng cua các đổi lượng nghiên cíai............................... 25

Bang 32. Kẻt qua và độ tinh sực 11 cua các màu DNA được tách chi Ct..........26
Bang 3.3. Ket qua ldêu gen cua SNP rs2856718 gen HLA-DQ ttong cãc mầu

DNA nghiên cứu

Bang 3.4. Tỷ lệ kiêu gen vả alen SNP ĨS2856718 gen HLA-DQ...................33

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC HÌNH
I linh I. I. Ung thư biêu mõ tề bao gan..................................... .............. ~........... 3

I lính 1.2. Sơ lược tố chức genome cùa phirc hè HLA........................................6
Hình 13. Sự khác biệt SNPs

Hình 1.4. Biêu dồ khuếch đại cua một quy ninh Real-time PCR................... 11

I lính 1.5. Đường chuẩn Real-time PCR (phai) được dựng tứ giá trị Ct vã nông
độ cưa cac mảu chuân (Std)

12

I lỉnh 1.6. Sơ đồ nguyên lý hoai động cua mầu dò Taqman.............................. 13

Hỉnh 2.1. Sơ dồ nghiên cứu.

16

Hình 3.1. Ret qua đo mật độ quang học cùa mầu DNA RG - 01 sau khi tách

chict DNA trẽn máy Nano Drop 2000c............................................................. 26

Hình 3.2. Ret qua điện di DNA tông số trên gel agarose 0.8%

......... 28

I lỉnh 3.4. Đờ thị tin hiệu huỳnh quang cua kiêu gen AG................................. 30
Hình 3.5. Dồ tiu tin hiệu huỳnh quang cua kiêu gen GG.................................. 30

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


ĐẬT VẢN ĐÈ

Ung thư là một nhõm cãc bênh liên quan dển việc tăng sinh tế bão một

cách mẩt kiêm sốt vả nhùng tể bào đó cỏ kha năng xâm lấn những mò khác
bằng cách phảt trién trực tiềp vảo mô làn cận hoặc di chuyên đển những bộ
phận khác trong cơ thê (di cản). Không phai tàt ca các khối u đều là ung thư,

có một sơ khói u thuộc vào nhỏm lành tính, tức la khơi u khơng xàm lẩn các
bộ phận khác cua cơ thê. Hiện nay có khống hơn 100 loại ung thư anh hương

dền cuộc sồng con người *.
Trong cac loạt ung thư hiện nay. mig /Air gan nguyên phứt lã một trong
sâu bệnh ung thư phổ biền nhất va lã nguyên nhãn gãy tư vong lớn thử ba trãi

the giới (khoang 830.000 trường hợp. tương đương 83% tống sỗ ca tư vong
do ung thư), dặc biệt ớ cãc nước chưa phát triển 2. Khoang 80% ung thư gan

nguyẻn phát lá ung thư biêu ntỏ tể bào gan (HCC)5. Sự hĩnh thảnh khối u cũa
HCC là một quá trinh phửc tạp liên quan đến nhiIV yếu tồ nguy co. Sự phô

biến cua các yếu tố nguy cơ thay đối theo sự phàn bồ cua HCC trên toản thê
giới. Nhicm virus viêm gan B mân tính (HBV) và Aflatoxin Bl (AFB1) là

những yếu tố nguy cơ chính ớ các khu vực đang phát tnên như Trung Quốc

va Án Độ í ơ cac khu vực dã phát Iriếạ HCC chu yếu plỉát triển từ xơ gan do

virus viêm gan c (HCV) ’ và bệnh gan nhiễm mờ khơng do rưựu (NAFLD) *.

Ngồi ra. nhiều nghiên cứu cùng dà chi ta rằng da hình gen liên quan den các

quâ trinh gây ung thư khác nhau. Do dô SNPs có thê đóng một vai trị quan
trọng đe xác định tinh nhạy cám cũa một người đối với HCC, từ đó giúp ích
cho việc phịng ngừa vả điều trị HCC

s.

Kháng nguyên bạch cầu ngưòi HLA (Human Leukocyte antigen

system) là một chu đề nghiên cửu quan trọng đổi với di truyèn cùa cơn nguủỉ.

Giìra các chúng tộc có sự khác biệt lớn về hệ thong HI.A. Dó có thê là lí do

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


2

dản tới sự khác biệt về tiền trièn bệnh ớ các chủng tộc khác nhau 5. I0. Các
HLA-DQ có tính đa hình cao. đặc biệt trong exon 2. mà hóa cho cảc VỊ tri gẳn

kháng ngun và đóng vai trị quan trọng ưong việc dưa kháng nguyên virus
váo các tế bào miễn dịch từ dó giúp thanh thai các tể báo bị nhi cm virus hay

tề bao u :I. SNP rs285671S nằm trong khu vực giữa các gen HLA-DQA2 và
HLA-DQB1. Nghiên cửu cua Hu vã cộng sự đà chi ra ràng HLA-DQ

»285671 s làm giam dáng kê nguy cơ HCC cua vật chu

Nghiên cúu cùa

người Liu vá cộng sự chi rỏ hơn rang kiêu gen GG cua HLA-DQ »2856718

có thê lả yếu tố bào vệ đỗi với nhỉ cm HBV và sự tiến triên cua HCC liên quan

den HBV »
Chân đốn ung thư biểu mị tế bào gan sớm là một thách thức, vì triệu
chứng làm sàng thường xuất hiộn muộn trong quá trinh phát trièn ung thư.

cho nèn việc nghiên cứu nhùng yếu tó nguy cư như HLA-DQ »2856',1S là

điều cằn thirl de xác định tinh nhụy cam cua một người dối với HCC tữ dơ
giúp ích cho việc phịng ngứa và dicu ti| HCC. Đà có những nghiên cưu dãnh

giã mói liên quan giữa SNP »285671 s cua gen HLA-DQ va tinh nhạy cam
với HCC liên quan den HBV. tuy nhiên kết qua còn nhiều Ưanh cài ■,1:,1J, u.

Ilơn nừa chưa có nghiên cứu nào đánh giá mối liên quan náy ỡ người Việt
Nam Do vậy. đe tải nghiên cứu: ”ứng đụng kỳ thuật Real-time PCR dê phát
hiện da liínli dam rs28Sị”i8 cùa gen HL.4-DỌ trẽn bịnh nhàn ung thư
biến mô tể bào gan” dưực thực lúộti vin mục tiêu: Xảc định dược lỹ lộ kiêu

gen cua da hình thái dint »2856718 cua gen HLA-DQ trên bệnh nhàn ung thư

biêu mơ tề bào gan.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


3

CHƯƠNG 1. TƠNG QƯAN TÀI LIỆU
1.1. Tơng quan về ung thư biếu mô tế bào gan

1.1 J. Sơ tược về ling tliư hiên inỏ tế bào gan
Ưng thư gan gồm ung thư gan nguyên phát vã thử phát Ưng thư gan

thử phát do các tế bão ung thư ờ các bộ phân khác cua cơ thê di vào gan gây

ra các khối u di căn. Ưng thu gan nguyên phát lá bệnh lý ảc tinh cua gan xảy
ra khi tẻ báo bính thưởng cua gan trớ nên bắt thường về lùnh thái vá chức
nâng. Các tế bao ung thư phát triên gây anh hương đen mơ bính I hường liên
kè va có thè lây lan sang cac vung khac cua gan cũng như các cư quan bên
ngoài gan. Ưng thư gan nguyên phát gốm 3 ioựi chính: ung thu biêu mõ tẻ bão

gan (phát triẽn từ tể bào gan), ung thư biêu mõ đường mát (phát triên tử

đường mật trong gan) vả u nguyên báo gan (Hepatoblastoma). Trong đó ung

thư bicu mỏ tể báo gan (Hepatocellular cancer - HCC) (Hình 1.1) lã hay gặp

nhất *5.

Hình /. /. L IIỊỊ thư biên mờ tế bao gan

•KT


4

Ung thư biẻu mỏ lể báo gan. một trong nhìmg khối u ảc tinh phồ biến

nhất, lã nguyên nhân háng đầu gây tử vong liên quan đền ung thu trên tồn

the giới. Theo thống kè cùa Tơ chúc Y tê Thè giói nảm 2020. IIC< duợc xếp
hạng thư sáu về tý lệ mẩc va thú ba vẻ ty lệ tư vong, gãy ra khoang 906.000

ca mắc mời và hon 830.000 ca tư vong mồi nảm

Tý lệ mắc HCC khác nhau

theo vùng địa lý. và hâu het các trường hợp HCC xay ra ơ các khu x ực kẽm

phát triển hơn. chàng hạn như Dông Á (chiếm 54.8% tnrimg hợp) và Dịng
Nam A (chiếm 10.8% trường hợp)2,16. r. Nam cơ tý lệ mẩc I ICC cao hơn nừ

(2

3 lần) 2. Tuồi thưởng từ 40

50 16. o Việt Nam dây là loại ung thư dứng

hàng thữ 3. Ước tinh mồi năm có 10.000 trường hợp mẳc mới, tý lệ nam gấp

khoang 4 lần nừ. ở các tinh phía Nam cao hsố các quốc gia có ty lộ mắc ung thư gan cao nhất thể giới:8.

1.12. Các yểu tồ nguy car chinh
- Virus xiêm gan B (HBV): theo số liệu cua Tô chúc Y tê The giới
(WHO) nãm 2016. dụa trên một sỗ nghiên cưu từ 2003 đen 2014. ty lè nhiễm

HBV ơ người lớn tại Việt Nam khoang 8.2

19Ỹ-Ĩ. Nhiều nghiên cứu phản

tích gộp (meta - analysis) đà chứng to nguy cơ HCC ơ những người nhiêm

IIBV cao hơn 15 - 20 lằn so với nhùng người không nhi em. Nguy cơ bị HCC

trong cuộc dời cua người nhiem HBV mạn lã khoảng 10

25%. Có nhiều yếu

tồ làm tảng nguy cơ HCC ở người nhicm HBV man. bao gồm cảc yểu tổ VC
hình thải (nam giớL tuồi lởn. tiền sư gia dính cỏ nguởi bl HCC). vẻ virus
(mức độ nhân ban HBV cao. kiêu hình HBV. thin gian nhiem HBV. dồng

nhiêm vời HCV. HTV). về lãm sảng (có xơ gan) và về mỏi trường và lồi sóng

(phoi nhiêm với Aflatoxin, nghiện rưụu nặng, hút thuồc lá)l9.
- Viius viêm gan c (HCV): theo số liệu cua Tô chức Y tê Tile giỏi

(WHO) nảni 2016. dựa trên một số nghiên cuu từ 2003 đèn 2014. ty lè nhiễm

HCV ư người lờn tai Viẻt Nam khoang 1 - 3.3%. Một phân tích gộp trẽn một

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


5

sổ nghiên cíni bệnh - chủng cho thay người có kháng thê kháng HCV có nguy
cơ bị HCC gấp 17 lằn so với người không cõ kháng thê khăng HCV 19.

- Đống nhiễm HBV và HCV: làm lảng nguy cơ bị HCC. Trong một

nghiên cưu 24091 trưởng hợp HCC tại miền Trung và mien Nam Việt Natn

trong thời gian 2010 đen 2016. ty lệ đống nhiễm HBV va HCV la 2,7% :5.
- Sư dụng dỗ uống có cóm một phàn tích gộp trẽn 19 nghiên cứu tiến

cứu ghi nhận nguy cơ HCC táng 16% ơ những người sư dụng từ 3 đơn vị đồ

uống có cồn ttỡ lẽn mơi ngày và tăng 22% ờ những người sư dụng từ 6 đơn vị

đồ uống có cồn trơ lên mồi ngày, và nguy cơ này cùng tàng ngay cá khi chi sữ
dụng lượng cồn thẳp nhất mỏi ngây (25g mỏi ngày, tương ửng vói 2 đơn vị đồ
uồng cỏ cồn mỗi ngày), ó Việt Nam. chưa có sổ liệu chính thức về mồi liên

quan giừa HCC va việc sư dụng đỗ uổng cỏ cồn. Theo một nghiên cứu trẽn
1617 bộnh nhãn HCC tụi miền Trung và miền Nam Việt Nam. có 68.6% bệnh

nhân đã và đang sư dụng đố uống có cồn với nhiêu mức độ khac nhau 1?.

Ngoải ra. ung thư biêu mó tế bão gan con có một sổ yếu tố nguy cơ
hiếm gặp như Aflatoxin. Dioxin.... Do dứ. nên sang lọc pliat hiện sớm ung
thư biêu mõ tế báo gan báng cảch làm siêu âm ỏ bựng. xét nghiêm định lượng

Alpha feto protein (AFP) vã thứ AFP mòi 06 tháng một lần cho nhùng người
cô cãc yếu tố nguy cơ trẽn !9.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


6

1.2. Tong quan về gen HLA-DQ

Hmli 1.2. Sơ lược tô chức genome cua pltức hệ HLA •*

Hệ tilling khảng nguyên bạch cầu người (HLA). chỉnh la phức hợp hòa

họp mỏ (MHC) chu yểu ở người, tứ lâu dưực coi lã khu vực quan trụng nhất
trong con người. hớn quan đen nhi Ồn hung, viêm, tự miền vá cay ghép

Phức hợp HLA la một vung gen nằm trài nhánh ngân cua nhiêm sàc thế số 6
(6p21), bao gồm hơn 200 gcn năm gần nhau. Các gen trong phức hợp nảy
được phân loại thánh ba lớp cơ bân: lớp ] (HLA-A. HLA-B. HLA-C) vã lớp II

(HLA-DR, HLA-DQ. HLA-DP) vả lCảc phản tư láp I được phát hiện trẽn tất cã các té bão cỏ nhãn (khơng

có trên hổng cấu). Trong khi đó. các phàn tư híp n chi có trên một số loụi tế
báo cua hộ mien dịch, như cãc tô bâo trinh diện khang nguyên chuyên nghiệp
(đại thục bão, te bão tua) hoặc cảclympbo B. dã hoạt hóa. Cac tê bão

nay thực bao cãc kháng nguyên, xư lý chúng thanh các đoạn peptide truck khi
gẩn vói MHC lóp II roi vàn chuyền ra bê mật ngoai mang te bào

•w.-


7

Các gene HLA-D mà hóa cho các chuồi a vá K cua NÍHC lớp n. Tơ
chúc cùa HI.A-D đa dạng lum cua cảc gene thuộc MHC lóp I. bao gồm các

locus HL A-DR (D-reỉaĩeđ). HLA-DQ và HLA-DP. Tại mỗi locus có hai gene
Al và BI mã hóa ttrimg ứng cho các chuỗi tt vả 0 cùng một số các

pseudogene. HLA-DQ thuộc về các phàn tu HLA lớp II. các protein MHC híp

II này gân vào các đoạn protein (peptide) trên be mật tẽ bào khác vã trinh diện

cảc peptìd này cho hộ thống miền dịch. Ncu hê thống miễn dịch nhận ra các
peptid là ngoại lai (như peptide cua virus hoặc vi khn), nõ sị kích hoạt phán
ứng dê tân công virus hoặc vi khuân xâm nhập *2. HLA-DQ chửa 5 gen gồm 3

gen p và 2 gen « Trong đó cỏ 2 gcn chức nâng mà hóa cho chuồi u (DQA1)
và chuỗi |ỉ (DQB1). Ngồi ra. cịn một số gen gia là DQA2. DQB2 ;s. HLA-

DQs cõ tinh đa hình cao. độc biệt là 1» exon 2 nià hóa các vị trí liên kểt kháng

ngun ;4. Do dó. một sơ alcn dả được được cho rủng lá có liên quan đến
nhiem HBV dai dâng:4.

1.3.Tông quan VC SNP rs285671S cua gen HLA-DQ

1.3.1. Khái niệm vứ cách xúc định SNPs

•KT


s

Hinli 1.3. Sự khác bi(1 S.XPs 25

Cảc đa hình nucleotide đon. thường dược gọi là SNPs. lá sự thay thế
cua nucleotide đơn tại một vị tri cụ thê trong bộ gen có mặt trong một phần đù

lớn cua dãn só (ít nhất l% dán $ồ) -’6. SNPs lả loại biến thê di truyền phơ biền

nhất ớ người. XIỖÍ SNP dụi diện cho một sự khác biệt nucleotide nong DNA

(Hình l .3). Nhưng biến the SNPs CO the la duy nhất hoặc xay ra ớ nhiều cả

nhân; các nha khoa học đă tỉm thấy him I (X) triộu SNPs trong dãn sổ trẽn tồn
thể giới. SNPs có thê xay ra ỡ bẩt kỳ vị trí nao tiên hộ gen, ca ờ vùng mà hóa
va khơng mà hoa. tuy nhiên thịng thường những biến thè nay đưọc tim thấy

với tần suẩt cao ớ các doan DNA năm giữa các gen 2S. Mãc dũ hơn 99% trình
tự DNA của cong người là giồng nhau, nhưng chi một sự thay dôi nhỏ trong
hệ gen cùng có thể tác dộng lớn dền đến tinh nhạy cam cua những người khác

nhau với bệnh tật. sự đáp ứng cảc liệu pháp điều trị. cùng như kha nàng thích
ứng với các yếu tố từ mơi trường như: chắt độc, vi khuân, virus.... Điều nảy
làm cho SNPs cỏ vai trò quan ưọng trong nhiêu linh vực y sinh học • ■ Chúng

có thè hoạt động như các dẩu hiệu sinh học. giúp các nhà khoa học xác đinh
VỊ trí các gcn có liên quan đèn bệnh tật. Khi SNPs xây ra trong gen hoặc trong

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


9

khu vực gẩn gen. chúng có thể đỏng vai trỏ trvc tiép hơn trong bệnh bang

cách anh hướng đến chức nâng cua gen25.

Việc xác định vá mỏ ta lượng lớn SNPs lá cằn thiêt trước khi chúng ta
có thè sư dụng chúng rộng rãi như một cõng cụ di truyền. Bốn phương pháp
thường đưọc su dụng cho phát hiện SNPs (hay đột biến) la: (i) phân tích da

hĩnh sựi đơn (identification of single strand conformation polymorphisms SSCPs), (ii) phân tích dị sợi kép {heteroduplex analysis), (iii) giai trinh tự trực
tiếp DNA vá (iv) cãc mang pliat hiện biên thê (the developed variant

detectorarrạys - \"DAs). với SSCPs, ti lệ thành còng biến dơi từ 70

95%,

tốn nhiêu cõng sức và có hiệu suắt lương đồi thấp, mậc dủ các phượng pháp

cho công suầt cao hơn cùng đang dược phát triển. Phàn tích dị sợi kép lả
phương pháp phó biến cho phát hiên SNPs do sụ đom giàn, gia thành thâp vã

ti lệ phát hiện cao (95

100%). Phương pháp phát hiện SNPs bang giai trình

tự trục tiếp cùng khã dược u thích. Một khi phan img giai trinh tự đưực

hoàn thảnh, một hè thống, mao mạch Applied Biosystems cỏ thê tao ra trinh tự
tư > 1500 manh DNA 500bp trong 48h với sự can thiểp cua con người. Dye

giãi trinh tư sê phát hiộn 95% cảc dị hợp tư. các dye dắt tiền hơn vả cân nhiều
công sức hơn cô thế phát hiên 100?-'®. Cịng nghệ VDAs cùng cõ nhiêu ưu

diem và tý lệ phát hiên cao. cho phép phát hiộn các SNPs bang quá trinh lai
san phàm PCR vởi mang array sứ dụng đằu dỏ oligonucleotide trẽn một chip

thuy tinh vả do sự khác biột trong liên kết lai giừa oligonucleotides phu hợp
va khơng phũ hợp. Ngồi vice chụn lựa phương phổp cho phái hiện SNPs,

quẩn thê sư dụng dê phai hiộn SNPs cùng cẩn dirợc chọn lựa. Tần số alien
SNPs khác nhau dang kê giữa cac dân tộc khac nhau và cãc qn thê khác
nhau. Cãc cơng ly phân lích SNPs đã lựa chọn sư dụng các nhõm người đa sac

tộc dè tối da hoa cơ hội phat hiện SNPs. Một số nghiên cúu klíác lai sư dụng

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


10

các nhóm người mang bệnh để rim ra các SNPs. theo logic là các biến thê góp
phần váo giai đoạn bộnh sè xuất hiện II tần số cao ờ nhóm nguởi nay -8.

1.3.2. SNP rs28ỉổ 718 cua gen Hl.Á - DQ
Đa hình đon nucleotide rs2856718 nam trong vùng khơng đích mà
3’ƯTR. (3’ - Untranslated region) cua gen HLA-DQ. lã vùng giữa cac gen
HLA-DQA2 vả HLA-DQB1

Trẽn thế giới dà cỏ những nghiên cửu VC SNP rs2856718. Một nghiên

cứu dà chi ra rằng kiêu gen HLA-DQ rs2856718 AG/AA vã alen o làm táng
nguy cơ HCC lien quan đền HBV ớ người khoe mạnh u. Một sổ nghiên cứu

khác cho thấy rủng SNP rs2 856718 tại gen HLA-DQ vả SNP rs3077 tại gen
HLA-DPA1 cỏ tác dụng bão vệ chổng lại sự tiến niên cùa ung thư biêu mỏ tế

bao gan trong đó SNP rs285671X chiếm ưu thế ư dàn tộc Han

Tuy nhiên,

khơng có mối liên quan dáng kè nao giữa phãt hiộn ung thư biêu mị tẽ bão
gan do nhiễm HBV vói alm HLA ơ Hãn Quốc hay quần thê Nhật Ban :ỷ. Do
dó vẫn chưa rị locus 11L/\ cụ thê dong vai trò quan trọng nhu thế nao trong

ung thư biêu mõ tế bào gan ờ bênh nhãn HBV.
Tại Việt Nam. cho đến nay chưa có nghiên cứu nâo vè đa hình đơn
nucleotide rs2856718 cùa gen HLA-DQ trẽn bênh nhân ung thư biêu mõ tế

bão gan Và dày cũng lã lý do chủng tôi thực hiện dề tài này.

1.4. Kỳ thuật Real-time PCR
Real-time PCR là kỳ thuật nhãn ban DNA dựa váo cac chu kỳ nhiệt.
Tín hiệu khuếch dại đưực hiên thị ngay sau mói chu kỹ nhiệt.

Biêu dồ khuếch đụi cua Real time PCR (Hĩnh 1.4):
-

Giai đoạn u; Tin hiêu huỳnh quang phai ra chưa du manh dê máy cõ

thê đo dưục. dường tin liiêu nám ngang (gọi la tín hiéu nền).

•W.-

<€

4* HỄ?


ỉỉ

-

Giai đoạn lũy thừa: số ban sao DNA đủ lớn. máy bải đầu ghi nhận

dưực tin hiệu huỳnh quart; và tin hiệu (ủng lèn sau môi chu kỳ nhiệt.
-

Giai (loạn bình nguyên: Phan úng cạn kiệt nguyên liệu và enzyme

Taq polymerase khong cỏn hoạt động hiệu qua dẫn dền tin hiệu khơng tiếp tục

gia tâng.

Hình ỉ.4. Biêu dầkhtưdí dụi cua fnột quy trinh Real-time PCR
Chu kỳ ngưỡng (Ct): tin hiệu huỳnh quang trong ống Real-time PCR

bai đầu vượt qua dưỏng tin hiệu ncn. Ct SC xuất hiện Slim hay muộn tùy thuộc
vào lượng màu han dầu. Mầu ban dầu nhiêu thi Ct sè xuắ! hiện sớm vã ngược
lại. mẫu ban đầu it till Ct sỏ xuắt hiện muộn.

Diròngchuân cua Real-time PCR:

Khi dem một màu chuãn Cỏ hàm lưụng DNA dà xác định di pha loăng
bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tât ca cãc nồng độ pha loăng đi chạy Real-time

•w.-

<€

4* HỄ?


12

PCR ta sè được cảc giá trị chu kỳ ngưởng (ì khác nhau. Dường biểu diễn mối
liên hệ giừa Cl vã hãm lượng DNA được gọi là đường chuân Real-time PCR

(Hình 1.5).
- Hỳ số tưưng quan R: : dành gia độ chinh xac cua thao tãc pipet. R-

càng gần I thí thao các cáng chính xác. Thịng thường R-' > 0.99.
- Hiệu quá khuếch dại E: điêu kiện lý tưởng E = 100%. nhưng thực tế

thi giả trị E chấp nhân dược ơ mức 90

105%.

Hìnli Ỉ.S. Dường chuẩn Real-time PCX (phãi) dược đựng từ giá trị ct và
nồng dụ cùa các mầu chuẩn (Stứ)
Dựa vào đường chu ân và giá trị Ct cua mầu đầu váo. ta cỏ thê định

lượng chính xâc ham lượng DNA bẽn trong màu.
Rral lime PCR sư (lụng mẫu dịTaqMan:

•W.-

tàm <€

4* HỄ?


B

R a Reporter
Q s Quencher

Polymerization

—
Forwiid
Prtmềr

Proto*

5
3*

&•

5’

<

Strand Displacement
5'

3

>

9X
5'

5’

<

5'

fCutlt 1.6. Str đồ nguyên lý hoạt động cua mẫn dị Taqntan

Mầu dó TaqMan (probe) được sử dụng kha phô biền trong kỹ thuật
Real-time PCR dê tụo tin hiộu huỳnh quang. Mầu dô TaqMan la một đoạn

30bp vói đầu 5' gắn một chất phát huỳnh

quang (reporter) va đau 3* côn lại gán chat hap thu (quencher). Khi máu

&

nucleotide dai khoang 24

TaqMan côn nguyên vẹn. quencher sè hấp thụ tẩt ca ảnh sang huỳnh quan

ê-

oligo

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


14

reporter phát ra. Khi phân ứng Real-time PCR diẻn ra. mảu dị sẽ bị Taq
polymerase cảt bàng hoạt tính 5’

3’ exonuclease (Hình 1.61, reporter đưọc

giai phóng tín hiệu huỳnh quang khơng cịn bị quencher hâp thụ
Phát hiện khác biệt SNP và xác định kiêu (li truyền
San phâni khuếch đại cua trinh tự đích có thê khác biệt chi một

nucleotide, gọi lá SNP hay khác biệt một so nucleotide cua một trinh tự.

với Real-time PCR dùng probe lảm chất phat huỳnh quang, để phát
hiện sự khác biệt SNP và đinh genotype cần thiết kế cãc TaqNỉan probe

(mang các chẩt phát huỳnh quang R khác nhau) bất cộp trên cùng vi tri cua
sàn phàm khuếch dai nhưng các probe náy có sự khác biệt về trinh tự tương

img vởi sự khac biệt SNP hay khác biệt ưinh lự giúp phản biệt genotype
Trong giai đoạn bát cập thi probe cỏ tri nil tụ tuơng thích nhất vói trinh tự đích
trên san phàm khuếch đại sè bất cập lén sợi đích vá sè bj Taq polymerase

phân giai, do vậy đường biêu diên khuếch dại tương ứng với mau huỳnh

quang cua probe sẽ đi lèn vá đen cực đai trong khi tin hiệu cua cac mau huỳnh
quang khac sè vẫn nám dưới huynh quang nền VI các probe tương ứng vần
cịn ngun vẹn và khơng bi phân giai

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


15

CHƯƠNG 2.
ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cút;

2.1. Thịi gian - địa diêm nghiên cứu

2.1.1. Thời gian tighten cứu:
Từ thảng 09/2020 đen toang 05/2021.

2.12. Dịa diêm nghiên cứu

- Trung tam nghiên cứu Gene & Protein - Trường Đại học Y Hà Nội.
- Bộ môn Khoa học xét nghiệm - Trường Dại học Y Hả Nội.
-

Bộnh viện K3 cơ sớ Tân Triều

2.2. Dổi tưựng nghiên cứu
Gom 30 màu mò ung thư dà đủc paratìỉn cùa 30 bệnh nhãn dược chắn

dốn ung thư biêu mỏ rề bào gan bâng giai phau bệnh tại Bệnh viện K3 cơ sở

Tân Triều.
Tiêu chuẩn chọn mảu:
- Bệnh nhân được chân đoan xác dinh bảng xẽt nghiệm mõ bệnh học, có

hỗ sơ bqih an tại viện.
- Bệnh nhan tự nguyộn tham gia váo nghiên cưu sau khi được giai thích

đay du những yêu câu. lợi ích cua việc nghiên cửu.

Tiêu chuần lợụt trừtnầu:

•

Bệnh nhãn mac ung thư gan thứ phát

•

Bộnh nhãn có kèm theo các ung thư khác

-

Bộnh nhãn không đồng ý tham gia nghiên c iru.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
-

Phương pháp dirợc sư dụng trong lighten cứu nãy lã phương pháp mõ ta

căt ngang.
-

Phương pháp lựa chọn mầu là phương pháp chọn mẩu thuận tiện.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


16

2.4. Quy trinh nghiên cứu

Hình 2.1. Sư dồ lighten cừn
Cịng việc 1: Thu thập mau mõ ung thư đà đúc paraflin cua nhom bệnh
nhân ung thư biêu mò tế báo gan tham gia nghiên cứu.

Cõng việc 2: Tadi clúcl DMA từ mẫu mò.

-

Tãch DMA bảng QlAamp FFPE Tissue Kit (Qiagen. 56404).

-

Do nồng độ và kiểm ưa độ tinh sạch cũa DNA bằng phương pháp do

inật độ quang.

• Kiểm tra chất luring DNA sau tách chi Ct bang phương pháp điện di
DNA tổng số.

•W.-

.ZtiW <€

4* HỄ?


17

Còng việc 3: Thực hiện kỷ thuật Real-time PCR su dụng mẫu dị
TaqMan.

Cịng việc 4: Đọc và phán tích kết qua.

2.5. Chuân bị (lụng cụ. trang thiết bị và hóa chắt sư (lụng

2.3.1, Chuẩn bị dụng cụ, trang thiêt bị
- Tú lạnh thường SANYO và tu âm sàu ARCTIKO.

-

Tú an toàn sinh học (Microflow).

-

Pipct định mức lOOOpl. 200pl. lOOpl. 20pl. IOpl. 2.5(d và dầu côn các loại.

-

Ong Eppendorf các loại the tích khác nhau (0.2ml: 1.5ml: 2 ml) và giả.
hộp đựng ổng.

-

Máy ly tàm đế bàn (Eppendorf Centrifuge 5424R. USA).

-

Máy vortex (Eppendorf Mix Mate. USA).

-

Máy Spindown E-centrifuge (Eppendorf. USA).

-

Mày lắc nhiệt (Eppendorf Thermo mixer 543 7. USA).

-

Gang tay. giầy thấm vô trũng.

- Cốc đong, binh thuy tinh.
-

Cân điện tư AB204 (Mettler Toledo).

- Lị vi sõng (Sharp).
-

Khay đồ gel.

•

Bộ diện di ngang.

-

Đồng hổ bắm giở.

-

Máy do OD Nano Drop 2(XX)c (Thermo. USA).

-

Máy điộn di EC 300XL Power Supply (Thermo. USA).

-

Máy soi gel vã chụp anh tụ dộng Gel Doc-: XR- (Bio-Rad. USA).

-

Mảy Real-time PCR Quanstudio 3 (ABI).

2.3.2. Ch nân bị hóa chui
Hỏa chia rách chìiỉĩ DNA ĩ ừ mỏ:

•KT