Xác định đột biến trên một số exon của gen GAA trên bệnh nhân pompe bằng kỹ thuật giải trình tự gen sanger

•KT

4» HỄ?


LỞI CÁM ƠN

Đê hồn thành khóa luận này. cm xin bày to lịng kính trọng và bict on
sảu sắc lói:

- PGS.TS. Trần Vân Khánh - Trường Bộ môn Bệnh học Phân tư. Khoa Kỳ

thuật Y học. Phó Giám dốc Trung tâm nghiên cửu Gcn-Protein. Trường Dại
học Y Hà Nội, đã tận tính hướng dân. truyền dạt cho tói nhùng kiến thức,
phương pháp nghiên cúu khoa học vô củng quý giá: dộng viên và lạo diều

kiện tót nhất cho tỏi trong suốt quá trinh thực hiện luận vân.
- TS. Phạm Lê Anh Tuấn, TS. Nguyen Hoảng việt - giáng viên Bộ môn
Bệnh học Phân tư. Khoa Kỳ thuật Y học. Trường Dại lỉọc Y Hà Nội. người

Ihằy danh nluều lâm sức đào tạo. hướng dan và dộng viên giúp dò dê em có

dược nliừng kiến thức giá lạ trong suổt thơi gian học tập vả thực hiện nghiên

cứu này. Ilơn lất ca thầy dã dạy cho cm những kiến thức chuyên môn. phương
pháp nghiên cứu khoa học. do là lái sán mà em co dược va sẽ giup ích cho em

trong nhùng chặng đường tiếp theo
Em xin tràn trụng cám ơn Ban Giám hiệu. Phòng Quan lý Đảo lạo đại

học trường Đụi họe Y Hà Nội đã tạo diet! kiện cho cm được làm vá hồn

thành khóa luận nảy.
Em xin tràn trụng cam ơn các anh chị trong Trung l âm Nghiên cứu
Gen - Protein đã dành cho em những tính cam quý men. sư dộng Viên kịp

thời, cùng như sự hồ trợ. chia sc trong cõng việc vã trong quá Irính học tập.
Ci củng, em xin dưực háy to lịng bièl ơn sâu sảc dồn Cha Mọ và
những người thân trong gia đính dâ thường xuycn dộng vicn. khích lệ, tạo cho

em nguồn dộng lực. giúp em chuyên tâm học tệp. nghiên cứu và không ngừng
phan dầu. Xin cam ơn bọn bè đả chia sẽ. giúp đò cm mọi mặt trong q trinh

học tập và hỗn ihânh luận vơn tốt nghiệp này.

Hả Nội. tháng 5 năm 2021

Sinh viên
Phạm Hà Tú Anh

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


Cộng llịa Xà Hội Chú Nghía Việt Nam
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Kính gũi:

Phịng quan lý Dào lạo Dại Học - Trường Dại Học Y Hà Nội
Hội đồng chấm khóa luận tót nghiệp

Tơi lên là Phạm Hà Tú Anh. sinh viên tỏ 31 lớp Y4K. chuyên ngành Cử
nhân Xét Nghiệm Y Học, niên khóa 2017 - 2021, trường Đại llọc Y Hà Nội,

tòi xin cam đoan:
1. Dây lả luận ván do lôi trực liếp thục hiện dưới sự hướng dàn cùa
PGS.TS. Tran Vân Khánh - Trướng Bộ môn Bệnh học Phăn tư. Khoa Kỳ

thuật Y hục. Phơ Giám dốc Trung tâm nghiên cứu Gen-Protcin, Tnrịng Đại

học Y Hà NỘI va TS. Phạm Lè Anh l uẩn - giang viên Bộ môn Bệnh học Phân
tư, Khoa Kỹ thuật Y hục. Trường Đại Học Y Hà Nội.

2. Các số liệu và thõng tin trong nghiên cứu la clunh xác. trưng thực và

khách quan, dà được xác nhận và chẵp thuận cua cơ sờ nơi nghiên cứu. Tơi
hồn lồn chịu trách nhiệm trước pháp luật về nhùng cam kểl này.

Hả Nội, tháng 5 nàm 2021
Sinh xiên

Phạm Hà Tủ Anh

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


MỤC LỤC

l.ịl CAM DOAN
LỜI CẢM ƠN

DẬT VÁN l)È________________________

.1

CHƯƠNG 1: TƠNG QUAN____________

.3

1.1. I3cnh Pompc •••• ••••

••••

••••••••

I. i. I. Đạc diêm dịch tề học bênh Pompe..

••••••••

1. 1.2. Di truyền học bệnh Pompc..............

••••••••

1.1.3. Cơ chế bênh sinh

• • ••••• • ••••• •»

3

•<

• ••• •••

•••••• 4

•••••• 5

••

1.1.4. Chân đoán và phán loại bộnh

/

1.1.5. Điều lộ bệnh Pompe..............

.... 1 ỉ

1.1.6 Phòng ngừa bệnh...................

.... 12

1.2. Enzym arid alpha-glucosidase....

1.3. Gen G.4.-Í.......

....13

’••••••

.... 15

• •••••••••••••■••at

1.4. Cat- kỳ thuật sinh học phân tu sư dụng xác dinh dột biên................

17

1.4.1. Phương phỏp phan ng chui trựng hp (Polymerase Chain
Reac tron1

....... ãããã

..

ããããô........ •••••••■••....

••«• ■•••••••«■....

.... 17

1.4.2. Kỳ thuật giái trình tự gen Sangcr................................................

CHƯƠNG 2: DÔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PIIÁP NGHIÊN CỦI’..

23

2.1. Dối tượng nghiên cứu.........................................................

—

23

2.1.1 Dối tượng nghiên cửu..................................................................

....23

2.2. Thời gi.an và địa diêm.... ........ ............................. -............ ..............
2.3. Dụng cụ. trang thiết bị v húa cht nghiờn cu.................................

ãã ãã.23
ô

2.3.1. Dng c v trang thiết bị..............................................................

23

2.3.2. tlóa chát dung trong nghiên cửu.

24

••• ••

• ••••••••••••••••••••

2.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... ....26

•W.-

.?TíCa: <€

4* HỄ?


• •
2.4.1 Thiel kẽ nghiên cứu
2.4.2. Sơ đỗ nghiên cửu.........

27

2.4.3. Quy trình nghiên cứu
2.5. Xu lý và phân lích số liệu

• •••••

34

2.6. Dụo đúc trong nghiên cứu............................................................................ 34

CHƯƠNG 3: KÉT QƯÁ NGIIIÊN cứt’___________________________ 35
3.1. Dặc diêm chung cùa đối tượng nghiên cửu................................................35

3.2. Kct quá tách chiêt DNA • ••• •••••••••• •«••••• ••••« •» •••••*••••••••««•••*••

«••••••»**• ••««••• 35

3.2.1 Kồt quá kiêm tra bằng phương phảp do quang...................................35

3.2.2. Kết qua diên di DNA tông sổ.......................

37

3.3. Ket qua phan ứng PCR khuếch đại doạn gen GAA................................... 38

3.4. Ket qua phàn tích đột bien trên cxon 2. 5. 14 cua gen CAA.................... 41
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN_______________________ ____ ____________ 46

4.1. Dặc diêm chung cua đỏi tượng ngln cứu.............................................. .46

4.2. Ket qua tách clìiêt DNA • •••■••••••••••••••••••••••••••••••■••••••••••■••■••••••••••••••••••••••••à “I *
4.3. Ket qua phan ửng PCR...„......

48

4.4. Kết qua giai trinh tự cxon 2. 5. 14 cua gcn GAA bàng k thut giói trinh
t Sangerã ããã ãããããằãô*ôôãằ*ãããããããããããã ããããããããããããããôãããããããôfããããããããããããôã*ôããôã*ãããôôôô ôôã*ôôôãã ãããããããã 50

4.4.1. DỘI biến vùng cxon 14 ở gen GAA và mối liên quan với các nghiên
cứu trên thè giới •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 51

4.4.2. Đột biến vùng exon 2 ớ gen GAA va inổi liên quan với các nghiên
cửu trên thè giới

53

4.4.3. Dột biên vũng exon 5 ơ gen GAA vá mối liên quan với các nghiên
cứu trên thê giới • • •••••••••••••• •••••••••••«••••••••••••

•••••••••• 54
55

TÀI LIỆU THAM KliAO
PHỤ LỤC

•W.-

<€

4* Hi:


DA XII MỤC BÀNG

Bang 2.1. Trình tự mồi khuếch đại cxon 2.5. 14 cùa gcn GAA..................... 25
Bang 2.2. Thành phân phan ứng PCR................................................................ 31
Bang 2.3. Thành phân phan ứng PCR giai trinh lự........................................... 33
Bang 3.1. Kết qua đo nòng độ và độ tinh sạch của inảu PI-PIO trai mảy

Nanodrop 2000c
Bang 3.2. Dột biến gcn G/\A cua 10 bộnh nhân IOPD.................................... 44

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


DANH MỤC BIÉL' l)Ị

Biêu đó 1.1. Tân suất cùa các alcn đột biên gen GAA.................................... 17

•W.- .tF’.Ca:

<€

4» HỄ?


DANH MỤC HỈNH

Hình I. I. Sơ đồ di truyền Bệnh Pome.................................................................. 5
Hình 1.2. Quá trinh hình thành cnzym GAA ở người bính thường................ 14
Hình 1.3. Q trinh hình thành enzym GAA trên bệnh nhãn Pompe.............14
Htnh 1.4. Vị tri gcn GAA trẽn NST người....................................................... 16
Hình 13. Mình họa giai trình tự gcn trên gd...................................................21
I lỉnh 1.6. Minh họa giai trinh tự gcn trẽn hẻ thống máy tự động.................... 22

llính 2.1. Sơ dồ minh họa cập mồi khuếch dại doạn cxon 2. 5. 14 cứa gcn

GAA..........................................................

25

Hình 3.1. Kct quả đo nồng độ và độ tinh sạch cùa màu P6..............................35
Hỉnh 3.2. Kết quá điện đi DMA tơng sổ...................................

37

llính 3.3. Kết quả diện di sán phiim PCR exon 2.1 cua gen GA A...................38
llính 3.4. Kct quả điện disan phàm PCR exon 2.2 cua gcn GAA................... 39

Hình 3.5. Kct quá điện disan phàm PCR exon 5 của gcn (ÌAA...................... 39
Hình 3.6. Kết qua điện disan phàm PCR exon 14 cua gen GA A.................... 40
llính 3.7. Hỉnh anh đại diện cho đột biến Arg4U* tại cxon 2 gcn GAA bằng kỳ

thuật giai trinh tự gcn (bệnh nhãn P4)........................................... 41
Hình 3.8. Hình anh đại diện cho dột biển Asp645His'Asn tại cxon 14 gcn
GAA bảng kỳ thuật giải trình tự gen (bệnh nhân P8).................... 42
llính 3.9. Ilính anh dại diện cho dột biến C.204ÍB 1G>T lại exon 14 gcn (ÌAA

bang kỳ thuật giải trinh tự gcn (bệnh nhãn P9)..............................43

•W.-

Ĩ&M,

4* HỄ?


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TÁT
cDNA

: Complementary DNA (DNz\ hô sung)

DBS

: Dried Blood Spot (vet máu khô)

ddNTP

: dideoxy nucleotide

EET

: Enzym Enhancement Therapy (liệu pháp tâng cường etuym)

ERT

: Enzym Replacement Therapy (liộu pháp thay the enzyin)

GAA

: Enzym acid alpha-glucosidase

GAA

: Gen mà hóa enzym acid alpha-glucosidase

G1C4

: Tetra saccharide glucose niệu

GSD-U

: Glycogen storage disease type 11 (býnh dự trử glycogen typ II)

GSDs

: Glycogen storage disease (các bệnh liên quan đên dự trử

glycogen)
HCT

: Hematopoietic stem cell transplantation (ghep tẽ hão goc tạo

mảu)

IOPD

: Inỉàntile-onset Pompe disease (bệnh Pompe khới phát sớm)

LOPD

: Late-Onsct Pompe Disease (bệnh Pompe khơi phát muộn)

NST

: Nhicm sac the

rhGAA

: The recombinant human GA A (enzym GA A tái tò hợp ở người)

SRT

: Substrate Reduction Therapy (liệu pháp giam ca chất)

Tm

Temperature

•W.- .-Tí ca:

melting

<€

4» HỄ?

(nhiệt

độ

nóng

chay)


1

DẠT
• VÁN l)Ẻ

Glycogen la một đại phân lu polysaccharide đa nhánh cua glucose được

hình thanh vá tích trù chu yếu trong các tè bào cua gan vã co. đóng vai tro lá
một nguồn dự trữ năng lượng lâu dài ơ người1. Tuy nhiên, nhùng loại dường

dự trữ dưới dạng glycogen cần phai dược xư lý thơng qua các enzym chun
hóa trước khi cơ thế có the sư dụng, ncu thiêu hụt những enzym cằn thiết nảy
sè dàn lái việc glycogen hoặc các chất chuyển hóa trung gian lích tụ lại. qua

then gian sè gây ra nhiều rối loạn, diên hình như nhùng ảnh hường đền gan,
thận, cơ xương, tim, và (hậm chí là hộ thẩn kinh trung ương1. Các bệnh liên

quan đến dụ trừ glycogen (GSDs) là một nhóm các rối loạn di truyền hiểm
gập. đậc trung bơi việc glycogen khơng thê chun hóa thành glucose trong

mõ do thiếu hụt một số enzym tham gia trong con dưỡng phân giai glycogen ’.
Bệnh Pompe được xếp vào (iSI)s loại II (GSD-II) gây ra bới sự thiếu hụt

enzym acid alpha-glucosidasc (GAA) dẩn tới tích tụ glycogen trong liêu thê

(lysosome) vá là một trong những cân bệnh di truyền nguy hièm. Bỹnh dược

mỏ ta lần dầu bơi bác sí người llà Lan JC Pompe trên một bệnh nhi vào năm
19324. Nguyên nhân chính gây ra sự thiều hụt enzym GAA là các đột biến

trài gen mầ hõa ra enzym này, GAA, trực tiếp anh hường đến quã trinh hoạt

dộng cùa enzym làm cho nó khơng hoạt dộng, hoạt dộng kém. hoặc khơng thê

kêt hợp được với cư chai.... Vùng mà hóa trung lâm hoạt động cùa enzym
năm ơ exon 2. do dó. các đột biến trong vùng nảy gây anh hướng trực nếp đến
hoạt động của enzym. Dựa vảo cúc nghiên cứu trên dân số Thãi I an vá Trung

Quốc. sàng lọc dột biến cua cxon 14 và 5 mang lại ly lẻ phai hiện 62%

(21/34). Từ nhùng dàn chứng kè trẽn, tói lụa chọn các vũng cxon 2. 5 và 14

dè nghiên cữu bơi tàm quan trọng cùa những vùng này tới hoat dộng cùa

enzym. cùng như tần suất xuất hiỹn dột biến ơ nhùng vị tri nảy. theo các

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


2

nghiên cứu đà được cịng bổ tnróc. Tất cã đều càn trơ sự phân giãi glycogen

thành glucose. Qua thời gian, glycogen hát đâu lích tụ trong cãc loại mơ, chũ
u ó cư xương, cơ trơn vá cư tim. nơi nó gây ra các tôn thương câu trúc và

chức năng cua mô5. Bệnh nhân Pompe thường gặp các triệu chưng nhu giám
trương lực cơ nặng va cơ yếu dần. gặp khó khán trưng di lại, nhiêu bệnh liên

quan đen cơ tim. Bệnh có tiên lượng xắu và tiên triên nhanh chóng, trê em

thường chét vì suy tim vả suy dường hơ hấp trước một tuỏi6. Pompe là một
loại bệnh hiếm gặp với ti lộ mác khoáng từ 1:14.000 den 1:300.000 phụ thuộc

vào chung lộc và vùng địa lý. o Viẻt Nam tuy chưa có con sổ chính xác về ti
lệ người mac bệnh này. nhưng các ca bệnh dơn le văn được ghi nhận vả diều

trị tại các bệnh viện nhi trên tồn quốc. Có nhiều phương pháp khác nhau đê

chân đốn xác định bệnh Pompe như: đo hoạt tính GAA trong nguyên bão sợi
cua da. sinh thiết mõ cơ. kiêm Ira hoạt tính GAA từ vet máu khơ. xét nghiệm

gen.... Trong đó. xét nghiệm gen là tiêu chuàn vàng dê chân đoản bệnh ơ
nhùng quốc gia dang phát triền khi ma các xét nghiêm do hoạt độ chua phô

biến rộng rãi ’. Tại Việt Nam. ví các diều kiện y khoa giới hạn. chân đoản

xác dinh bệnh nhân Pompc chi dựa váo cãc triệu chứng lâm sảng - da số lại
không đặc trưng cho bênh dản dến nhiều trường hợp bi chẩn dốn nhằm.

Thêm vảo dó, việc xảc dinh dột biến gen còn cần thiết cho việc tiến tới diều
tri bệnh theo cổc liộu pháp cá thê. diên hình lã liộu pháp enzym thay thế (The

recombinant human GAA - rhGAA) hứa hẹn kẻo dài tuổi thọ cùng như cái

thiện chất lượng cuộc sống cũa bệnh nhàn.
Xuất phát lữ điều kiện thực tế vá mong muốn lãm sáng to các đột biến

gcn gây bệnh Pompe phục vụ cõng tác chân đoan l)ê lài:
“Nghiên cứu Xac đinh đứt biên trên mội số cxon cua gen GAA trên bệnh nhân

I’ompc bang kỳ thuật giai trinh tu gcn*’dược thực hiên nhằm mục đích:
Xát định đột biền vùng txun 2, 5 vù Ị4 gtn (74.1 trên bịnh nhàn Pompe.

•KT

4» HỄ?


3

CHƯƠNG 1
TỎNG Qt'AN

1.1. Bộn II Pompe
Bệnh Pompe là một rối loạn gãy ra bời đột biến gcn lộn trẽn NST

thương do thiêu hụt enzym acid * alpha glucosidase trong lieu the * một
enzym can ihict de phân huy glycogen trong lieu the thành glucose. Thiếu

enzym này dàn đen sự tích tụ glycogen trong tiêu thê. gãy ra các tôn thương
trên cơ xương, cơ hô hấp vả cơ tim4 9.
Cân bộnh này dược đặt theo tên cua Joannes Cass i anus Pompe, người

đã phát hiện nó vào nàm 1932. Pompc đà phát hiện thầy sự tích tụ glycogen

trong mơ cơ - rỗi loạn chưa lừng biềt trước dây ờ mọt số bệnh nhi. Lúc bẩy

giờ, sự lích tụ này là một bái tốn rất khố giai thích ví các enzym tham gia
vào quả trinh chun hóa thơng thường của glucose vá glycogen đều có một

vã hoụl động4.
Phai cho đen khi Christian de Duve phát hiện ra tiêu thê vảo nãm 1955.

vài nám sau dó Henri G. Here nhận ra rằng sự thiêu hụt enzym (enzym acid
alpha glucosidase! trong lieu the can trờ sư phàn hùy glycogen, dicu nay phù

hợp với các triệu chứng cua bệnh Pompe. Khám phá này dán den việc thiết

lảp khái niệm VC các bênh tích trừ lysosome, cho đến nay 49 bệnh thuộc nhóm

nãy dà dược dà được xác định10.
/. I. ĩ. Dặc điểm dịcli tề liọe bệnh Pompe

/.//./ Trên thề giới
Bệnh Pompe được ước tính rảng 5.000 den 10.000 người mấc trên loản

thể giới. Ti lộ mắc bệnh Pompe dao động khoang 1:14.000 đền 1:300.000.
Dãy là một bệnh phụ thuộc vào chung lộc và vùng địa lý. Tại cac Quóc gia

khác nhau trẽn the giới tán suất ước lính la: 1:40.000 ớ ngi Mỹ gốc Phi .

•W.-

.?TíCa: <€

4* HỄ?


4

1:50.000 ờ người Trung Quốc11. 1:40.000 ớ người Hà Lan 1: và 1:146 000 ở

dàn sổ
Bệnh Pompc có thê xuất hiộn khơi phát ư nhiều độ tuổi khác nhau từ
lúc so sinh đến lúc trương thành, nhưng phân lờn là bệnh khơi phát ngay tứ
giai đoạn sớm. Tuổi trung bính khi bắt dầu có triệu chúng là 2.0 tháng (từ 0

den 12 thangI. Tỷ lẽ sổng cua tre đen 12 tháng tuồi 25.7% và ờ mức 18 tháng
lã 12.3%. Qua các nghiên cữu trước dây khăng định răng việc khới phát triệu
chửng sớm làm tăng nguy cơ lử vong sớm13. Các bcnh nhân khơi phát muộn

liến triển bệnh vã từ vong tùy thuộc vào thời gian biêu hiện bệnh vả không

phụ thuộc vào tuổi'4.
Ti lệ mõc bẻnh Pompc ớ nam và nữ khơng có sụ chênh lệch nhiều1* .
/. /. 1.2. Tụi Vỉệt Nam

Ở Việt Nam chua có cơn sổ chính xãe về ti lộ người núc bệnh này. Tại
các bệnh VIỘI1 Nhi lớn trên tồn quốc có ghi nhạn các ca bệnh mắc rai rác.
MỘI số nghicn cứu dang được tiến hanh với mưng muốn chân đốn chính xác

va tím hiểu các biộn phảp tri liêu phù hựp.

l.t.2. Di truyền học bịnh Pouipe
Bệnh Pompe gảy ra bơi tính trạng di truyền dạng lặn trẽn NST thường.

Mồi người đều có hai ban sao cua gcn này, một alcn nhận từ cha và một alcn
nhận tứ mẹ. Điều dớ có nghía là:
-

Người cớ ca 2 alen GAA đều bính thưởng - khơng mang dột biền sê

khơng bi mốc bệnh Pompe

•

Người mà có 2 alen đột biên, sè hình thành can bệnh này. Nhùng đột

biến trong gcn này sẽ dàn den hoạt dộng cua enzym (iAA thấp hơn.
-

Người mang kiêu gcn d| hợp tư. la những người mung I alcii đột biến

va một alcn bỉnh thường trên gcn G.-Li. những ngươi này cứ thê là;

•W.-

.?TíCa: <€

4* HỄ?


5

• Người mang mầm bệnh Pompc. họ khơng hề có bất kỳ dẩn hiệu

hay triệu chứng não cua tinh trạng bệnh lý nhung có 1/4 (25%)
kha năng có con b| bệnh Pompe nêu như vợ/chồng cua hụ cùng

lã người mang mâm bệnh. Thòng thường. cà diu và mẹ cua tre bị

bệnh Pompc đều là người mang mam bệnh. Bơi vậy bố mc mang

gcn đột biên cân phai sàng lọc trước sinh đẽ tránh con cua họ
mẩc phai cán bệnh này:fi.
• Tuy nhiên, cùng có nhừng bệnh nhân khơi phát muộn bệnh
Pompe với thê dị hợp tử, do sự chồng chéo tiềm nàng cua hoạt

dộng còn lại cua en/ym GAA. đòi hoi phân lích tồn bộ gen

GA/X đé xác nhận chân đốn 4.
ch*

Ctt

tnựợng
<25%>

me0«" t*"”

ven

con m>ng ọon D4 Ah
(50V

co* 04**
(25%)

Hình t.ỉ. Sư dồ di truyền Hệnh Pome
(Nguồn biơỉđbvn.comỉ
1. ĩ.ỉ. Cư chề bịnh sinh

Bộnh nhân mắc bộnh Pompe là do sự mẩt hoạt dộng của enzym GAA

gày ra sự ũ dọng glycogen trong lieu thê. dần đến cảc tôn thương trên cư
xương, cơ hô hắp và cư tim Một số gia thuyết dược giai thích cho VIỘC

•W.'4* HỄ?


6

glycogen tích tụ trong tắt củ các mơ nhung cơ tim vả cơ xương lại đục biệt dẻ
bị anh hương bơi các tác động của nó.

Nảm 1984. Griffin J.L và cộng sự đã đề xuất "Gia thuyết lysosome”đề
giái thích cho sự phá huy cư xương trưng bệnh Pompe . Gia thuyết này dựa

trẽn quan sal bang kính hicn VI điện tử. cho rằng sự cư cơ làm cho các tiêu thê

chứa đầy glycogen bi vờ. dàn đen giai phóng glycogen tự do vã các thành
phần có khá năng gây độc vào tế bão. Te bảo cơ xương khác với các te bào
khác ớ chỏ là các ticu the phồng ra lại nằm trong một không gian bị giới hạn

giữa các sợi cơ. do dờ khi co cơ sè lạo diều kiện cho sự vờ màng cua màng

tiêu thê. Các tiêu thê bị vờ dàn dến mất vật liệu myofibril vả phá húy hoàn
toàn sợi cơ. Neu gia thuyết này là dứng. VỚI cách trị liệu cua hiên tại các sợi ờ

giai đoạn sau cua sự tiến triển cua bệnh sê không thê sửa chừa dưực!?,lỉ.

Fukuda T.. Roberts A.. Aheam M. vá cộng sụ ( năm 2006) dã dưa ra
"Gia thưyèi W sự tích tụ glycogen trong autophagy". Sự tích tụ glycogen
khơng chi dược tím thấy trong tiêu thê. mã cịn ơ các khơng bão tự thực

(autophagyI. Sự tích tụ q mức cua cãc không bão tự thực trong cư xương
sau dó dà được quan sãt bảng kính hiên vi điện tư trên sinh thiết cơ tử một số
bệnh nhân Pompe. Múc dộ tích tụ khơng bảo tự thực lã rất lởn; ớ một sổ sợi.

thê tích chiếm bới các khơng bào lự thực dạt xấp XI 40% tơng thê tích cua một
phân đoạn cụ thề ;ĩ. Quả trinh tự thực bào xuất hiên quá mức sè tạo diều kiộn
cho sự lích tụ gây rổi loạn làm gián đoạn câc protein co trong sợi cơ vả
chuyên huớng cua enzym điều tri khoi tiêu thè. Nguyên nhàn cua hiện tượng

tụ thực bảo quá mức ớ cơ Pompe vàn chưa rỏ ráng. Thiếu dinh dường là một
nguyên nhãn chính cua qua trinh tự thực bào. Gia SŨ răng, nó liên quan đèn sự
"lĩõi glucose " cục bọ (hậu qua cua quá trinh phân huy glycogen cua liêu thê

thành glucose không đưực thực hiện), ticp theo là cam ứng lự thực bào. sau do

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


7

dẫn đen tích tụ do các lieu thê khơng có kha nâng dung hợp hoặc liêu hóa các
chat cùa khơng bao thục4.

Cúng với đờ "Gia ihuyél oxi hóa gây stress " cũng được đê xuất trong
nghiên cứu cua Tertnan A. và cộng sự (nãm 2(MX)). Gia thuyết này đề cập đến

sự tích tụ quá mức vá sớm cua lipofuscin (dưới kính hiên vi diện tư các hạt
lipofuscin tương ứng với các thè cận bà cua không bão tự thực) chi ra một

nguyên nhân liềm ân khác cua quá trinh tự chct: stress oxy hóa. Tơn thương
oxy hóa cỏ the anh hưởng dền tinh thấm cua màng tiêu thê. dản đen rò ri câc

thảnh phần của lieu thê ngay cả trước khi màng tiêu thê giàn ra;8-°.
Bệnh nhân tuổi trường thành mắc bệnh Pompe (bệnh nhân khởi phát

muộn) cho thấy kha níing oxy hóa đinh giam, nhưng q trinh oxy hóa chẩt

béo và carbohydrate trong cơ xương khi lập thê dục tương tự như nhùng
người khoe mạnh. Cho thấy rang kha năng tập thê dục giâm lá do cư yếu và

gãy môn. chứ không phai do kha năng phân giai glycogen cua cư xương b|
suy giam. Vì' vậy. dường như GAA khơng dóng vai trị chu chót trong việc

san xuất nâng lượng trong co xương khi tập luyện21.
Những nghiên cứu lảm sàng cho thầy rang những bất thường trong

bệnh Pompe vượt ra ngoài tiêu thê. láy lan ánh hương đến ca con dường nội
bào và tự thực. Không cỏ cơ chế náo trong so này dược chứng minh lá nguyên
nhân chắc chắn gây ra tính trạng yếu cơ trong bệnh Pompe4.
Ị. 1.4. Chàit đoán và phân loại bệnh
ỉ. 1.4. ỉ. Triệu chứng lãm sàng
Việc chân doán lâm sàng là bước đâu tiên đê sàng lọc bệnh nhân

Pompe, tuy nhiên lại gặp rất nhiều khó khán do lính trạng bệnh hiềm gặp và

các đặc diêm lâm sàng khơng điên hình6". Chân dốn xuất phát lừ các dặc
diêm chính cùa bệnh Pompc khơi phát sớm và bênh Pompc khơi phát mn
dược trình bây dưới dây:

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?


s

-

Bệnh khừi phái ỊỊÌai đoọn sởnt (ĨOPD - infantile -onset Pompe disease)

nó hiêu hiện ngay trong nảm đau đời, ớ tre dưới 12 tháng li. IOPD gây ra

bói sự giâm cnzym GAA nghiêm trọng, hoạt độ en/.ym thiếu nhiều hoặc gần
như khơng có. Biêu hiện khi sinh ra với phí đại tim. giam trương lực cơ vã

suy hò hấp nghiêm trụng, dẫn den tư vong sớm. nếu không dược diều trị. Mặc
du có các biện pháp can thiệp diều tri thướng xuycn. bệnh Pompc khơi phát

sớm vẫn tư vong25-’4. Chân đoán bệnh nhân IOPD dựa trên những triệu chứng

lâm sàng khá phơ hiến như:

• Cơ: giam trương lực cơ nặng và yểu cơ. không cỏ phan xạ. Bệnh

nhân cỏ hicu hiện trượt qua treo thảng đứng và đầu trẻ rò rệt.
• Tim: u nội tâm mục. viêm cơ tim. tim to.
• Các đặc diêm lâm sàng bõ sung có thê la: khó thớ. khó àn. lười to

ra vã gan to vữa phai. Nghe kém có thê xuất hiện vã dược cho lã
do nhũng thay đối bệnh lý trong tai giữa, tai trong vá hệ thần

kinh thinh giàc*
-

Bệnh khứiphát ỊỊÌai di>ụn muộn (LOPD - Late-Onseĩ Pompe Disease)

bicu hiện bênh sau I tuối. Bệnh Pompc khới phát ơ trc nho. vị thánh niên vả
người lent là những ví dụ về dụng khới phảt muộn. LOPD dược dặc trưng bơi

mức độ hoạt dộng GAA giam một phần, cớ thê lãng lèn đen - 20% mức binh
thường với mửc độ nghiêm trụng khâc nhau như you cơ. thiếu hụt vận dộng

vá hô hấp. Tuổi thụ cùa họ thường dài hơn những bệnh nhãn khơi phát sớm14.

Bệnh nhân LOPD thường ít có vẩn dẻ nghiêm trọng VC tim. các triệu chứng
làm sàng nhìn chung nhọ hơn so với bệnh khơi phát ơ giai doạn sớm.
• Cơ: loụn dưỡng cư bap chân tay. giam trương lực cơ. yêu cơ liên

triển ơ xương châu, chân và xung quanh ba vai. Cứng CỘI sóng
và leo cơ cột song, dau lưng dưới. Yếu cơ loàn thân dan den đi

lại khơ khàn.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


9

• Suy nhược hơ hấp

• Ngồi ra. bệnh nhân có thê có các triệu chửng khác như: bệnh cơ

lim phí đại. làng creatine kinase (CK). gan to6.
Sau khi chân đoán, khoang thời gian theo dõi làm sàng bệnh nhãn mac

bênh Pompc phái dược cá nhân hóa cho túng bệnh nhân, phai theo dôi sát sao
đồi với bênh nhân mắc bênh Pompc ớ trê sơ sinh, sáu tháng một lần dôi với

bệnh nhân mắc bệnh Pompc lớn hơn và khới phát muộn 6.
1.I 4.2. Cảc xi't nghiệm C(ìn lâm sàng

Dè sảng lọc hoặc xác định bệnh nhân Pompc một cách chac chan thí ta phái
làm thêm một số xét nghiệm cận làm sàng đê khầng dinh

Do hoạt tinh GAA
Hoạt động của enzym cịn rẩt lì hay gần như khơng có ỡ bệnh nhãn

khơi phai sớm

IioẠc

hoạt động GAA giam rõ rệt ờ bệnh nhân khởi phát muộn

trong các mõ như nguyên bào sợi nuôi cầy tữ sinh thiết da. sinh thiềt cơ. te

bào lympho tinh khict. tê bào don nhân vá dong te bào lympho. Do do. ta có
thê sứ dụng cãc kỹ thuật "Đơ hoụt tinh ettzym GAA đẽ xác dinh bỹnh.
-

Kiêm tra hoạt tính GAA tử vết máu khơ (DBS - Dried Blood Spot), có

thê dược thu thập một cách thuận tiện bang phương pháp gót chân hoặc ngón
tay. Các phương pháp DBS mới này không chi phú họp dê sàng lục sơ sinh

bênh Pompe tná còn cung cấp chân đoản cáp một nhanh chóng, khơng xâm

lằn6.
-

Phân lích Glc4 (tetrasaccharide glucose niệu) nước tiêu kết họp VỚI

DBS dà được xãc nhận là có độ nhạy chân đoản phai gần 100% đối VỚI bệnh

Pompe ư tre sơ sinh. Kct qua âm lính lừ ca hai xét nghiệm gần như chav chắn
loại trù chân đoan bệnh Pompc ớ tre sư sinh va loai bo sự cân thièt cua các

thu lục xâm lấn. sinh thiết....6 Các thử nghiêm này chi dược thực hiện trong

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


10

các phịng thí nghiệm chun biệt và hiện khơng được phó biến rộng rải ngồi
các nghiên cứu lâm sàng.
-

Do hoạt tính GAA trong nguyên bào SỢI cua da. Nguyên báo sợi được

lay từ sinh thiết da. sau đó phai được ni cay truớc khi thư nghiệm cnzym.
Q trinh náy có thớ mất den 4 - 6 tuân va do dó có thê trí hồn dâng kẽ việc

chân đốn6.
-

Sinh thiết mơ cơ: kỳ thuật này cần xâm lấn nhiều hơn. chơ phép xét

nghiệm trực tiếp vả nhanh chóng hoạt dộng cùa enzym GAA trong cơ vả hám
lượng glycogen. Nỏ cùng cỏ thê dược sư dụng cho các nghicn cứu mô học dê
đánh giá vị trí và lượng glycogen tích tụ trong mơ Tuy nhiên, dối với tré sơ

sinh thí đây lả một xét nghiệm khá nguy hiềm vì nó có thê khiến bệnh nhân
hòn mè sâu. độc biệt nêu bệnh nhãn dà có biêu hiện bệnh cơ tim nộng và bệnh

cơ xương625.
-

Do hoạt tính GAA từ máu tốn phân. Dây là một kỹ thuật không dáng

tin cậy do tác dộng cua maltase *.

-

Xét nghiệm gen

Dựa vào cãc kỹ thuật sinh học phàn tư ta cỏ the biết chính xâc sự sáp

xếp cua cãc nucleotit cua gen G.-L-í. So sánh với trinh tự gen gốc ta có thê phát
hiên được các biến dơi VC cẳu trúc DNA, lừ dó xác dinh các dột biến. Khoang

2952 dột biến vã nhiều biến thè trong gen GAA dâ được xâc định vả dược lập

danh mục ( do dó. việc

xác định dột biền gãy bộnh trơ nen dễ dàng him. Trong nghiên cứu náy. chúng
tôi tập trung vào xét nghiệm gen bơi nó phù hợp với diêu kiện, cơ sơ vật chất

tại phịng thí nghiệm cua chúng lôi. Ilơn het nõ dua ra kết qua cực ki chính
xác. có thè phát hiên them được dột biến mới va dẻ dàng tím được người

mang gcn khi phát hiện dột biến trong gia dinh.

•W.- .-Tí ca:

<€

4* HỄ?


11

/. /. 5. Dĩều trị bệnh Pompe

Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp điêu trị khác nhau đà được
phát tricn, bao gốm cầy ghép tể bào gốc tạo máu. liệu pháp thay thế en/ym

(ERT - enzym Replacement Therapy), liệu pháp giam cơ chắt (SRT -

Substrate Reduction Therapy), và liệu pháp tăng cường enzym (EET enzym Enhancement Therapy) bâng nghiệm pháp chaperones dược lý. liêu

pháp gen2'.

Phưưng pháp cay ghép tề bào gắc tao ntảu dà và dang dược nghiên

cứu diêu lộ các bệnh tích trù tiêu thê. Phương pháp cung cap en/ym bang
cách sư dụng enzym ngoại sinh, thông qua cầy ghép tế bào gổc tạo máu dị

sinh (HCT - Hematopoietic stem cell transplantation) hoặc cỏ thê bàng HCT
tự thân sau khi chinh sữa gen invitro21.

Liệu pháp thay thề eniym sư dụng GAA till tô hợp ỡ người (rhGAA -

the recombinant human GA A ) cỏ lên là alglucosida.se alia, chung hầu hết là
tiền chất cua enzym. Giông nhu liền chất GAA nội sinh. rhGAA sẽ trai qua

qua trinh phản cất protein dọc theo đường vân chuyên dê tạo ra cac dạng
trung gian, sau đỏ enzym dược vận chuyền đến tiêu the và hoạt động18.

Liệu pháp tàng cưừng enzym lã một phương pháp dà thu hút nhiều sự

quan tàm dê diều trị sư dụng các chaperones phàn tư nho Việc sư dụng

chaperones dược lỹ cô thê cãi thiên kha năng gáp và độ ón đinh cúa các
protein dột biến với các cấu trúc bj thay dồi. giúp thu dược một phàn hoạt lính

cua enzym. Hiện nay. nó được sư dụng kém với ERT đe tăng sự ôn dịnh cùa
các cẩu trúc rhGAA, tir dõ giúp tàng luệu qua điêu tri2^pl''3O'31'J2^2>.

Liệu pháp giâm cư chât VỚI mục dích là giam sinh tơng họp dê cân
bâng sự giam thúy phân tiêu thè*5.

•W.- .-Tí ca:

<€

4» HỄ?


12

Liệu pháp gen lập trang vào chuyển gen in vivo vởi vcctơ AAV vói hi
vọng cung cắp nguồn en/ym GAA ôn định (lè điều trị dạt hiệu qua cao trong

bệnh Pompe14.

Hiện nay. chi có liệu pháp ERT được cáp phép đẽ điêu tri trên bệnh

nhân Pompe.
1.1.6. Phòng ngừa bịnh

Hiện nay. chưa có thuốc hay phương pháp điều tri đe giúp bênh nhân

hồn tồn khơi bệnh, bơi Pompe là một căn bệnh di truyền nguy hiếm vồ phức
lạp, anh hường đến nhiều mò cơ quan khác nhau trong cơ the. Cách hũru hiệu

Iihẩt dê ngăn ngừa bẻnh Pompc là tiến hành sàng lục trước sinh Đậc biệt là
đổi với nhùng cộp vợ chổng mang gen gây bênh Pompc thí việc đến gộp bổc

si'di truyền đê dược tư vẩn là het sức can thiết

Sáng lục phơi tiên lam tơ giúp phân tích ban chất di truyền cúa phôi đê
chọn dược những phôi bính thuờng về hình thai và di truyền ngân ngứa tinh
trụng trc sinh ra b| mac các bệnh di truyền hoặc giam ty lộ buộc phai ngưng

thai kỳ do các dị tật di truyền”.

Sàng lọc di truyền trước sinh là việc sư dụng những biên pháp thảm dô
đặc hiệu trong thời gian mang thai đê chần đoán xác định các trường hợp

bệnh do rồi loạn di truyền từ dó cỏ hng xư trí kịp thơi vả thích hợp- \
Sáng lục tre sơ sinh dang dược chấp nhộn vả dược thí diêm thực hiện ữ

các quốc gia khác trên the giời Độc biệt, các trường hợp khơng có triệu
chứng mác LOPD nhưng cô thè được phát hiện trên sàng lọc sơ sinh, giúp

theo dôi vả quan lý bệnh sớm him. Việc chân đoán vá diêu tri sớm các chứng
rối loạn này thường sê ngăn chặn duợc các vấn dê nghiêm trọng về sức

khóc9*57.

•W.-

<€

4* HỄ?


13

1.2. Enzym acid alpha glucosidase

Trong bảo tuông, quá trinh phân huy glycogen được thực hiện bói hai
enzym: glycogen phosphorylase giãi phóng glucose l-phosphate từ các chuồi

thảng cua glycogen vá enzym khứ glycogen đẽ cắt các diêm nhanh. Trong
tiêu the. quả trinh phân giãi glycogen dược xúc tác bill acìd alpha-glucosidase
(cần phân biệt với alpha glucosidase), cơn được gọi là «-l.4-glucosidase hay

acid maltase. Nó có chúc năng tương tự như enzym khư glycogen, nhưng gen

mà hôa năm trên một nhiêm sâc thê khác, được tế hảo xư lý khác và năm
trong tiêu thê chứ không phai trong báo tương8.
Glycogen cỏ thê được vận chuyên vảo tiêu thê bàng 2 con đường:
thông qua cảc không bào thực bảo hoặc bằng each xâm nhập trực ticp vào

màng. Các không bào thực bào sè bao bực lấy glycogen vá chuyên den tiêu
thề. sau dó kết hựp với các tiêu thê đẽ xư lý glycogen nãm bên trong. Con

dường tín hiệu cho phép vận chuyên trực tiếp glycogen vào tiêu thế. tuy

nhiên, hiện nay các tín hiệu nãy vẫn chưa được tím hiêu.
Bên trong tiêu thể. glycogen được thúy phàn thành glucose bơi enzym
GAA. Enzym này chu yếu thủy phân các polymc
GAA sau khi dịch mà phai trai qua qua trình xứ lý đê tro thanh en/yin cơ đầy
dũ chức náng hiện diện bén trong tiêu thê. Ban dầu, enzym nảy được dịch mà

la một polypcptid tiền thân cua enzym có kích thước 110 kDa, hiên thi bay vi

trí glycosyl hóa ticm nâng trong cấu tróc co ban cùa nó. Quá trình glycosyl
hỏa lien kết N cũa GAA xay ra trong lưới nội chất bằng cách gần các chuồi
bẽn carbohydrate vảo gốc asparagm trong ticn chill protein. Một số chuỗi
carbohydrate gần với tiền chất GAA được phosphoryl hóa. Quá trinh
phosphoryl hóa với dư lượng mannose đê tao thành mannose 6-phosphate. Sự

trương thành cua GAA liên quan đền quá trinh phân giãi protein, tạo thanh
dang trung gian 95 kDa và cuối cùng là sự hfnh thành en/ym trướng thảnh cơ

kích thước 76 và 70 kl)a;’.

•W.-

.?TíCa: <€

4* HỄ?

14

Acid alpha glucosidase (GAA) có hoạt tính tồi mt Ờ pH 3.7 den 4.5 và

thúy phân các liên kết ÍI 1-4 glucosid vá «1 1-6 glucosid cua các glycogen
Ikltv

Hỉnh 1.2. Ọuú trình hỉnh thành enĩynt GAA ờ người hình thường

ỉỉi/ỉh Ỉ.3. Ọuả trình hình thành enzynt GA A trên bệnh nhân Pontpe

•KT


15

1.3. Gen GAA

Gen mà hóa acid alpha-glucosidase trong lieu the ở người đà dược nhân
ban và xác định cấu trúc40. Gen GAA năm trên cánh dài cua nhiêm sãc thê 17
o người (vị trí 17q25.2-q25.3) (hình 1.4). Gcn dài khoang 28 kb. chưa 20
cxon và 19 intron. Exon dâu tiên khơng mã hóa và nó cách cxon 2 bời đoạn

intron dài khoảng 2.7 kb. Vùng promoter cua gen GAA mang nhiêu đặc diem

cua các gcn giù nhà (housekeeping gene) như: giàu GC. chứa hai AP-2 tiềm
náng và bổn vị tri liên kết Sp-1 liềm nâng, nhưng (hiểu cảc mô tip TAT/\ hoặc

CCAAT riêng biột41, do dỏ gen GAA biêu hiện gần như ớ mọi loại tể bão. Tuy
nhiên, mức độ biêu hiện cua enzyni GAA lại được điều hỏa chủ yéu ờ cầp độ

phiên mà. nén chức nâng của enzym này chi gói gọn trong một số vị trí nhất
định, mà pliần lớn là ở trong tiêu the42. Mà khơi đáu ATG cua gen GAA nằm ớ
Vị trí 33 bp linh tứ đau 5’ exon 2. Mà kết thúc năm gần dầu 5’ cua exon 20. Tẩt

ca các ranh giới inlron-exon đều luân theo quy lac "CìT/AG”, ngoại trứ vi trí
mói nối cũa cxon 19 là ‘GC’ thay ví •<ÌT‘40. cDNA cua gen GAA có 2859

nucleotide mà hóa ra 952 acid antin cua enzym chưa trướng thành. Vung
trung tâm hoạt động năm ở vj tn acid amin thử 282 thuộc cxon 2. đây là vũng
hoạt dộng quan trọng nhất đồi với enzym. Trung tâm hoạt động cua enzvm

bao gồm vị trí liên kế với cơ chat nầm ở acid amin 95, 111, 125, 126 thuộc
vùng exon 2. Vùng gần lien kết N của GAA với gốc asparagin (quá trinh

glycosyl hóa) nảm ớ 7 vị tn acid amin thử 140. 233. 390. 470. 652. 8X2. 925

thuộc các exon 2. 4. 6. II. 16. 17. Nêu xuất hiện dột biền sai nghía, vơ nghía,
lệch khung đọc mơ.... ơ nhùng bộ ba mả hỏa cho amino acid núm ơ vùng nây

thí có kha nâng cao cn/ym bị mất chức nàng43 4*.

•W.-

.?TíCa: <€

4» HỄ?

16

H 8 8

Mi

ỈH H ỉ ỉỉỉỉỉ ỉ ỈH

ĩ

I mT| 11111111111111Ị1111
I

MM

rtM

KM

KM

MM

I^m 111 ĩ 1|||| Ỉ

KU

BOM

ffinh 1.4. 1'7 tri'gen (7-1/1 trẽn NST người
(Nguứn Nghiên círti cua T Fei2i vờ cộng sự * ’J
Việc xác định câc yếu tố phicn mà anh hương dền sụ biểu hiện GAA

I11Ờ ra kha năng điều chinh biêu hiện gcn phục vụ cho mục đích điêu trị. CI1O

đen nay. khoang 2952 đột biến vá các biên the đã dược xãc đinh trong gen
G.-L-T6. Các dột biên num rái rác kliãp gen. tuy nhiên dương như có một nhom

cãc dột biến sai lệch tại diêm nóng cua dao CpG trong vùng dượt bao tơn tiến
hóa cùa cxon 14. Các dụt biên bao gồm tát ca các loai: dột biến sai nghía
(51%). dột biến mat đoạn nhơ (14,9%). dột biến vùng nối giửa cxon-intron

(12.7%),... (biếu đồ 1) Tuy nhiên các đột biến GAA có sự phân bố trong câc

quần the là khác nhau và lác dộng cùa chúng dền quá trinh tạo lien ket GAA,

sự biêu hiện, hoạt dộng cua protein lồ khác nhau4 . Từ những dàn chứng kê

trên, lôi lựa chọn các vùng cxon 2. 5 và 14 dè nghiên cứu bơi tầm quan trụng

cua nhùng vùng này tới hoạt động cua enzym. cùng như tần suất xuất hiện dột
biển ơ nhùng vị trí này. theo cãc nghiên cữu dã được cõng bõ trước.

•W.- zTiCa:

<€

4-Hi: