Nghiên cứu vai trò gen glra2 liên quan đến hội chứng rối loạn phổ tự kỷ trên mô hình ruồi giấm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.04 MB, 60 trang )
TKf V*:
-u
LỜI CÁM ƠN
Dê thục hiện thánh cõng luận vãn nảy. em xin tó lịng biết ơn sâu sắc đến Ths. Vù
Đức Anh Klioa Kỳ thuật Y học. Trưởng Đại hex? Y Hả Nội và Ths. Trần Quốc Dạt những
người thầy đà trực tiếp hướng dần. truyền đạt cho em nhùng kiến thức vã kinh nghiệm quý
báu trong suốt quá trinh thực hiện khóa luận nãy.
lũn cùng xin gửi lời cám cm chân thành ten TS. Nguyen Trụng Tuệ Trường bộ mơn
Khoa học Xét nghiệm, người dã nhiệt tính giúp đờ và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt
quã trinh học tập vã nghiên cứu.
Em xin cám em Ths. Trằn Nguyên Hống Viện Dược liệu. BSNT. Nguyen Dính
Lộc. BSNT Nguyền Thị Thu Tháo Bộ mỏn Hỏa sinh vả nhõm nghiên ciru ruồi giấm tại
Khoa Kỳ thuật Y học. Trường Đại học Y Hã Nội nhừng người đà giúp đở em rất nhiều
trong quả trinh học tập vã hồn thành khóa luận.
Em xin trân trụng cám em Ban Giám Hiệu nhà trường, lành đạo Khoa Kỳ thuật Y
học. Trường Dại học Y Hà Nội đà tạo điều kiện thuận lợi nhất đê em học tập. tim hiếu kiến
thức.
Con xin giri lèn cám em sâu sắc tới gia đỉnh, người thân vả bạn bè đà luôn giúp đờ.
ung hộ và dộng viên con rất nhiều ưong suốt quà trinh học tập.
Hâ Nội. ngày 13 tháng 05 nâm 2021
Sinh viên
Ngó Thị Huyền Linh
TM/ V*:
LỜI CAM DOAN
Tòi lả Ngỏ Thị Huyền Linh. Sinh viên khỏa 115. Khoa Kỳ thuật Y học, Trường Đại
học Y Hã Nội, xin cam đoan:
1. Dây lã luận vân do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng đản cua Ths. Vù Đức Anh
vả Ths. Trần Quốc Đạt
2. Công ưinh nghiên cứu này hỗn tồn mới khơng trũng lập với bất kỳ cõng trinh
nghiên cứu nào khác
3. Các số liệu và thòng tin trong nghiên cứu chinh xác. trung thực vã khách quan. Tơi
xin chịu hồn tồn trách nhiệm trước pháp luật về nhùng cam kết nảy.
Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2021
Sinh viên
Ngó Thị Huyền Linh
TM/ V*:
MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN’
LỜI CAM ĐOAN
DANH .MỤC TỪVIÉT TÁT
2.1....................................................................................................................................
2.3.1. Phương pháp lạo dòng ruồi knockdown gen GLRA2 tại mỏ nào
KÉT LUẬN............................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHÁO
PHỤ LỤC 1
DANH MỤC BÀNG
DANH MỤC HÌNH
TM/ zfci V*:
4Ã 'V.
DANH MỤC TỪ' VIẾT TÁT
ASD Autism Spectrum Disorder (Hội chủng rổi loạn phơ tự ký)
GLRA2 Glycine receptor «2
GLRB
: Glycine receptor |ỉ
GLRA1
: Glycine receptor a 1
GLRA3 : Glycine receptor a 3
dsRNA : duble stranded RiboNucleic Acid (RNA mạch đôi)
IR
: Inverted Repeat (trinh tự lặp lại đào ngưục)
PBS : Phosphat Buffer Saline
RNAi : RNA interference (RNA can thiệp)
ƯAS
UApstream Activation Sequence (trinh tự hoạt hóa thượng nguồn)
TMS : Transmembrane segments (vũng xuyên màng)
ADDM Autism and Developmental Disabilities Monitonring Network
DSM Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
GLR : Glycine receptor
LIG : Ligand-gated ion channel
dGLRA2 : Drosophila melanogaster Glycine receptor «2
8
ĐẠT VÁN ĐÈ
•
Hội chứng rối loạn phổ tự ky (ASD - Autism Spectrum Disoder) lả một tinh trạng
rồi loạn hành vi nghiêm trọng nằm trong nhóm câc rối loạn phát tricn lan tóa (pervasive
developmental disoders). Bệnh đặc trưng bời cãc rối loạn thần kinh phức tạp bao gầm việc
khô khàn trong giao tiếp, tương tác xã hội. phát triên ngòn ngữ. hành vi cửng nhấc, lặp di
láp lại.1 Cân nguyên di truyền cua ASD có cơ chề rất phức tạp. một sổ gen dà được chửng
minh là có liên quan đến hội chúng này như NBEA, SHANK. ABCA13.POGZ. niTOR....
Các gen nãy mang nhiều chức nàng khác nhau như tông hợp vã phàn hủy protein, tham gia
cầu tạo khung xương te bão. tham gia quá ưinh hình thành khớp thằn kinh..?
Một sổ nghiên cứu gan dây cho thấy, những đột bicn cua gen GLRA2 cùng liên
quan đen hội chứng rối loạn phỏ tự ký. Đây là một gen mà hóa cho tiêu đon vị thụ thê
Glycine alpha 2 làm trung gian cho sư ức chề khớp thằn kinh ờ túy sống, thân nào vã các
vũng khác cúa hẻ than kinh trang ương? Người ta dà phát hiên một sồ đột biển cùa gen
GLRA2 ở bênh nhãn mắc chủng tự ky như mất đoạn exon (Acx8-9) hay dột biển sai nghfa
p R153Q vá p.NlóSS.1 Tiếp dó. mõ hĩnh cã ngụa vần vã chuột dược sư dụng dề nghiên cữu
về gen GLRA2. Kết qua cho thấy, vai trò của gen GLRA2 liên quan đến ASD trong tinh bển
cua khớp thần kinh, khá nâng học tập. ghi nhớ và khã nàng tương tác xà hội. 5 Có thê thấy
răng, gen GLRA2 cỏ vai trị rất quan trọng trong quã trinh dàn truyền thằn kinh cua dộng
vật
Việc nghiên cứu các cán bênh thần kinh ơ mức dộ phản tư cùng trờ nên khô khàn
đối với cãc nhà khoa học bơi tinh phirc tạp và trờ ngai trong vỉộc lưa chợn vã xây dưng mô
hinh nghiên cứu. Mơ hĩnh thực nghiộm tốt có vai trị đặc biýt quan trọng trong nghiên cứu.
làm sáng to cơ chề bệnh sinh cùng như thứ nghiêm phát triển dược phấm diều trị.
Mó hinh ruồi giắm chuyên gen là một mỏ hình có nhiều ưu diêm vượt trội trong
việc nghiên cứu các tác dộng cứa gen lên hý thần kinh như thiết kề dơn giãn chi phi thắp,
dà lập ban đỗ hộ gen chi tiết, có 70% gen bệnh tương đổng vởi ngươi de tạo dòng, dẻ
chuyên gen vã biêu hiện protein ngoại lai, có thè khao sát trên một quần thê quy mõ lớn rất
thuận lợi cho việc sàng lục thuốc. Mặc dù cách nhau hãng triệu năm trong quã trinh tiến
TM/ V*:
9
hóa nhưng các cẩu trúc than kinh. cư. tiéu hóa... giữa ruồi giấm và người dưục bao tồn một
cách dáng ngạc nhiên.5 Trên thề giới, dà cỏ nhiều nghiên cứu về bệnh tự ký trên mơ hình
ruồi giấm, vói phương pháp tàng biêu hicn (overexpress) hoặc giam biêu hiện
(knockdown) gen tại mõ nầo ruồi giấm, đồng thời phản tich anh hương cua gcn dền kha
nãng tương tác xà hội. kha nâng vận dộng, thay dơi về nhíp sinh học và các thay dối trong
cầu trúc thần kinh cư. Kiêu hĩnh ghi nhận trẽn mõ hình này có các bicu hiện tương tự như
bệnh tự ký:'6■'
Có thê thầy mị hình ruồi giầm chuyển gen là một mõ hình có nhiều ưu diêm vượt
trội trong việc nghiên cữu các tác dộng cua gen lẽn hệ thần kinh Tuy nhiên hi
có nghiên cứu nào trên mõ hình ruồi giấm vẻ gen GLRA2 liên quan dền hội chứng rối loạn
phô tự kỹ. Trẽn cư sờ dó nhóm nghiên cứu tiến hành dề tài "Nghiên cứu vai trò gen
GLRA2 liên quan dền hội chứng rồi loạn phổ tự kỳ bung mơ hình ruồi giầm ” với hai mục
tiêu chinh:
(1) Giam biểu hiộn gen GLRA2 trẽn mó não ruồi giấm.
(2) Phàn tích các biểu hiộn hãnh vi liên quan den rối loạn phố tự ky cùa ruồi giấm
giám biêu hiộn gen GLRA2.
Đây dồng
lã
hướng
nghiên
cửu
hồn
tồn
mỡi
ơ
Việt
Nam
góp
phàn
cung
kỹ.
cồ
bang
thờicửu,
chúng
cungthứ
cấp
về
vai
một
trị
mõvã
hĩnh
cua
gen
tiềm
GLRA2
năng
trong
và
kinh
bệnh
te
tự
cho
những
nghiên
nghiệm
sàng
lọc
thuốc
sau
này.
TM/ V*:
CHƯƠNG 1. TỎNG QI AN
1.1.
Tống quan về hội chứng rỗi loạn phố tự kỹ
1.1.1.
Sơ lược về hội chứng rồi loạn phổ tự kỹ
Hội chứng rói loạn phổ tự ký (Autism Spectrum Disoder ASD) lã một hội chimg rối
loạn tảm thằn với những anh hương VC giao tiếp, hành vi vả kha năng tương tác xã hội.
Năm 1943 tại Mỳ, Leo Kanncr là người đầu tiên dưa ra khái niệm về hội chứng này trong
bãi bảo mang ten ’"Autistic Disturbances of Affective Contact" tạm dịch là “rỗi loụn tự ky
về tiếp xúc tinh cam".8 Bệnh tự ky dược mò tá như một hội chửng rối loạn "phổ", vi nõ cõ
sự khác biệt rộng rài về loụi vã mức độ ảnh hường cua bệnh đổi với từng cá thê. 9 Trước
đây. ASD dược chấn đoản với từng tinh trạng riêng biệt bao gồm: Hụi chững Asperger; rối
loạn phản ră tuối thư (Childhood Disintegrative Disorder - CDD) vã rối loạn phát triền lan
tòa không dặc hiệu (Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified (PDDNOS)) Nhùng tinh trọng này hiên nay được gộp chung lại gọi là hội chứng rối loụn phố tự
kỹ theo sổ tay chần đoản vã thống kẽ các bộnh tâm thằn DSM V (Diagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition).10
Nhiều nghiên cứu đã chi ra rằng, các rối loạn cua bệnh nhãn tự kỳ thường xảy ra ư
những tháng đầu đòi vã tỳ lệ mắc ơ nam giới là cao hơn. 11 Dựa trẽn các số liệu đà dược
kiêm chửng ước tinh ty lộ mắc các rỗi loạn phó tự ky trẽn thề giới vào năm 2012 lã khoang
62 1000012 Trong một cuộc kháo sãt từ năm 1990 • 2019 cua tị chức nghiên cữu gánh nặng
bệnh lỹ tồn cầu (The Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study - GBD)
trẽn 369 bệnh lý tại 204 quốc gia và vùng lănh thố. tỹ lệ mắc hội chững ASD ước tinh lá 1
270.” Tụi \íỳ. CDC bắt dầu theo địi sự phò biền cua ASD từ năm 1996. sau đỏ thành lặp
mụng lưởi giám sãt tự ký và khuyết tật phãt tricn (Autism and Developmental Disabilities
Monitoring Network ADDM) ờ tre em 8 tuổi, tụi 11 bang cua Mỳ vã bão cáo thưởng xuyên
hai nàm một lần từ năm 2000. Trong báo cáo mói nhất cua ADDM vào năm 2020 dựa trẽn
sổ liệu khao sát cua nám 2016. ty lộ mắc tự kỳ là 1 54. ty lệ nãy đà tâng so vói năm 2014 là
1/59 và ti lộ mẩc ư nam giới cao hơn 4.3 lần so vời nừ giói
14
Tại châu Á ty lộ mằc ASD
dược bão cão trong cãc nghiên cữu gằn dãy cao hơn so với những báo cáo trước dó. ước
tinh ti lộ này vào nẫm 1980 là 1.9/10000 vã den năm 2009 lã 14.8 10000.”
Tại Việt Nam. chưa có nghiên cứu nào cơ quỵ mó cà nước chi cỏ một số nghiên
cứu tồng hợp sỗ liệu cũa các bệnh viện, trong đó tại bệnh viện Nhi Trung ương số ca mac
ASD cua tre từ 18
36 thảng tuồi tại đây đà gia láng dáng ke. Cụ
thê tý lệ nảy dà tâng gắp ba lằn kê từ nám 2000
2007 vả tâng gắp bốn lần trong
giai doạn từ nảm 2008 2010.16 Một nghiên cứu vào nảm 2013 ơtinh Thái Nguyên cho thấy
tý lệ mẩc bệnh cua tre từ 18
36 tháng tuồi tại tinh nãy lã 0 45% vã tý lệ
mắc cao nhất là ơ trung tâm các thành phố Ớ Mien Bắc Việt Nam. với nghiên cứu trẽn tre
em 18 - 36 tháng tuồi tại thành phố Hã Nội vã 2 tinh Thãi Binh Hòa Binh cua Hoàng Vàn
Minh đã chi ra rằng, tý lệ mắc ASD là 75.2/10000 cao hơn so vơi giai đoạn 2013 2014.1«
Cõ thê thấy dường như tý lệ mẳc ASD dã gia táng theo then gian vã ngây càng trơ
thảnh một càn bệnh dáng lo ngụi tụo ra gãnh nặng kinh tề vã tinh thần cho người bệnh vã
chính gia dinh cứa họ.
1.1.2.
Nguyên nhân
Nguyên nhân gảy ra hội chửng rối loạn phổ tự ký hiện nay chưa dược xác dịnh rô
ràng, tuy nhiên qua nhiêu nghiên cứu cơ thê thay nó cỏ liên quan dền di truyền vả các tác
dộng cua môi trường. Trong dỏ yếu tố di truyền là một yếu tố rất quan trọng vã dược các
nhã khoa học rãt quan tâm. Với sự phát triẽn manh mè cua khoa học cảc vấn dề về sinh học
phản tứ ngây câng được hiếu rồ. kết quã cùa việc giãi trinh tự toàn bộ bộ gcn người dà xác
định dưực nhiều gcn có liên quan dền hội chững rỗi loạn phơ tự kỳ. Những gen nãy mã hõa
cho các protein cõ vai trò quan trọng trong nhiều quá trinh hĩnh thành vả hoụl động cua cơ
thè. Một số protein tham gia vào quả trinh doth vị. tiếp hợp liên kết màng vả liên kết các
thụ thê với các thành phần dản truyền thần kinh như SHANK. SynGAPl.... dà dược dề cập
lã một yểu tổ liên quan den ASD.1819 Các nghiên cứu mới đày về việc thay dói các kích
thích ơ te bảo thần kinh có liên quan dền ASD dâ chi ra ràng, các kênh ion là một yểu tồ
quan trụng trong cân nguyên bệnh tự ky Sự thay đôi VC canxi. natri hay kênh kali dường
như làm tảng cưỡng kha nâng hưng phấn cua tế bào thần kinh, các dột biến gen liên quan
đến các kênh ion có liên hộ với hội chứng tự ký bao gom SCNỈA. CACA1C, KCNMA1. và
KCNJ1o.w> Ngoài ra một số gen tham gia vào
quá trinh hinh thành synap thần kinh, cấu trúc bộ khung xương tế bão. tòng họp hoặc phản
huy protein... cùng liên quan đen cơ chề bệnh sinh cua ASD.1
Một bằng chững nửa cho thấy, bộnh tự ký cõ liên quan đến di truyền đó là ớ cặp
sinh đỏi cùng trứng, khi một trong hai người mảc ASD thí người cịn lại có nguy cơ mảc
bệnh lên tới 36% 95%. Ty lộ này ư các cặp sinh dôi khác trứng lã 0 30% 21 Ngoải ra. các bất
thường về nhiễm sấc thê cùng cô the làm bộnh biêu hiện rò rệt lum. Khoảng 10% bênh
nhân mằc hội chứng rối loụn phố tự ký cùng kẽm theo hội chứng Down hoặc dírt gây
nhiễm sắc the X (hội chứng Rett).“
Bén cạnh nhùng yếu tồ VC di truyền, các tác dộng từ môi trưởng dược xem như
các yếu tố nguy cơ tiêm ấn dổi với ASD Tuồi tác cua bố mẹ, cân nụng cua tre khi sinh ra.
kim loựi nẶng. thuốc diệt cỏn trũng, chắt diệt khuân vã chắt gảy ỏ nhiễm thực phẩm được
cho là góp phần gây ra hội chứng ASD J Con dầu lòng cua bố mẹ cao tuồi, cô nguy cơ mẳc
ASD cao gầp 3 lằn so với con thứ ba cua bã mẹ từ 20 34 tuồi và bố ít hơn 40 tuổi. 23 Tre
sinh thiếu tháng (<33 tuần) hoặc thiếu cản (<2.5kg) có nguy cơ mằc tự ký cao gẩp 2 lầu trc
bỉnh thường24 Bâ mụ tnrớc khi sinh nếu tiếp xúc với một số loại thuốc diệt côn trũng gãy
úc chc Acetylcholine vã GABA. việc ức chế cảc chất dàn truyền thằn kinh này cỏ thê gây
ASD :í Tương tự. cãc chẩt õ nhiễm hữu CƯ anh hường đến con đường dần truyền canxi tác
dộng dến một loạt các chắt dản truyền thần kinh như GABAcrgic. cholinergic và
dopaminergic .26" Những yếu tồ mòi trường nãy gõp phần vào gia tàng ty lý mac bệnh tự
ký nhưng không du đê gảy ra ASD.1
1.1.3.
Chẩn đoàn
Hầu hét những người mảc ASD dều cõ một hoặc một số hãnh VI như: giao tiếp
bằng mầt kẽm. có xu hướng lang tránh người khác, hiếm khi thê hiện sự thích thú với một
mơn dồ. gặp khó khản khi nỏi chuyện qua lại. thường nòi dài dòng về một vấn dề u thích
mà khơng quan tâm người nghe có hứng thú hay khơng, cõ nẽt mặt hoặc cữ động khơng
khớp với lởi nói. giọng nơi có giai diệu bẩt thường (như robot), gặp khó khăn khi lý giai
quan điểm hoặc hãnh dộng Cua người khác, lặp lại một hãnh vi nhắt dịnh, quan tàm sâu
sầc vã lâu dài dến các chu dề nhất dịnh như con sỗ. âm nhạc.... khó chịu vi nhùng thay đói
nhó trong thơi quen, nhạy cám quá độ hoặc thờ ơ với một số tảc dộng vào giác quan, gập
vắn đề về rổi loạn giấc ngu.... Ngối ra một số rất lì người mằc ASD có một số kha nàng
xuất sấc như: cơ thế tim hiểu mọi thứ một cách chi tiết và nhớ rất lâu. xuất sẳc trong cãc
linh vực toán học. khoa học. ãm nhục hoặc nghệ thuật.2*
Có thè thầy, hầu như các bệnh nhản ASD sỏ gộp khó khản trong ba vắn đề đó lã
tương tãc xà hội. kha năng giao tiếp vả hãnh vi lặp lại. Đó cùng là nhừng van đề cốt lỗi
trong việc chân đoản cản bệnh nãy. Qua nhiều the hộ tim hiêu. due kết, các nhà khoa học
và tâm thần học đà dưa ra một tiêu chuãn chi tiết vã hoàn chinh dê chân đoàn ASD. dược
trinh bày trong hai bang phản loại quốc tể lã "The Diagnostic and Statistical Manual of
Mental Disorders 5th Edition " (DSM V) vã "Autism Spectrum Diagnostic Observation
Schedule" (ASD OC).-5 De chẩn đốn một người cỏ mắc tự ký hay khơng dựa vào hai tài
liệu trẽn, tiêu chi sỉ bao gốm việc xuất hiện ít nhất ba dấu hiệu cùa sự giam giao tiếp xã hội
hoặc hai dầu hiệu lặp di lặp lại một hành dộng và cô phán ứng quã mức hoặc dưới mức với
các tác dộng từ môi tnrởng?0
Hội chứng rỗi loạn phô tự ky thưởng xuất hiện ờ trê em. bới vậy việc chắn dốn
sớm rất có ý nghía trong việc can thiệp diều trị giúp tre có khá nàng dộc lập hơn trong
tương lai.-’1
1.1.4.
Diều trị
Hiện nay, chưa có một phương pháp điều trị chuân não cho hội chứng rối loụn phồ
tự ký. Nhưng cỏ nhiều phương pháp dê giam thiêu triệu chứng, với những can thiệp thích
hợp, sê tạo cơ hội cho người mac ASD the hiện các kha năng và kỳ năng cua hụ. Việc điều
trị sè có hiộu qua riêng cho mỏi ngưởi với cãc liệu pháp vã can thiệp nhắt dinh
52
Các liệu
pháp diều tri hiện nay CO the kc den như
3J J4
• Liệu
pháp
hãnh
vi
nhãn
thức,
tập cửu
trung
vào
sự
kềtvượt
nối
giừa
suy
giúp
nghi'cam
nhùng
người
xúc
vã
chững
vi
Asperger
Nghiên
(một
cho
loại
thầy
ASĐ)
liệu
pháp
qua
náy
chững
rỗi
loựn
lomắc
âuhành
14
•
Can thiệp sớm cho bệnh nhãn tự kỷ, các can thiệp nãy thường dược ãp dụng
cho trê em từ 2
3 tuồi35 Tại thời điềm nảy. nào cùa trê vẫn dang trong quá trinh
hĩnh thảnh, vi vậy phương pháp diều trị này có hiệu qua lâu dãi Cãc chi dàn gần dày dưa ra
dề nghị về việc can thi ộp sớm tói hãnh vi vã sự phát triển cho những tré dược chân đồn
hoặc nghi ngờ mấc ASD-^
•
Liệu pháp nghề nghi
cầu, kha náng. sờ thích cùa họ3’
•
Liỹu pháp dẻ cha mẹ làm trung gian là phương pháp chi dẫn cho bỗ mụ cùa bộnh
nhàn tự ký cảc phương pháp tri liệu tại nhã. Cãc nghiên cứu cho thấy phương pháp
nãy cô thê cài thiộn kỳ nâng giao tiếp cua tre33
•
Đào tụo kỳ năng xà hội, lả việc dạy trê tự kỹ nhùng kỳ nâng can thiết dê tương tãc
với người khác39
•
Liệu pháp nơi ngơn ngữ. bao gồm việc cai thiện kỷ năng nói hoặc dạy cảc kỳ nâng
giao tiếp phi ngôn ngừ Liêu pháp nãy có thế giúp người bênh cai thiện kha nâng
giao tiếp với người khâc*
Đồi với việc sư dụng thuốc, hiện nay khơng cõ loại thuốc não có the chừa khơi
ASD hoặc diều trị cảc triệu chứng cốt lỏi. Tuy nhiên, cõ nhùng loại thuốc có thê giúp một
số người mắc chứng ASD hoạt dộng tốt hơn. Vi dụ: thuốc giúp kiêm soát tinh trạng táng
động, mắt khá nàng tập trung, lo lắng, trầm cám. tự gây thương tich hoặc co giật32
1.2.
Tổng quan về ruồi giầm
1.2.1. Ruồi giấm
Ruồi
một
lồi
giấm
ruồi
có
tên
nhó.
khoa
cóvi
học
kích
là
tlnrỡc
Drophila
từ có
2àn
nteỉanogasier.
4thè
mm.
Chúng
thường
Dãy
có
màu
trên
vãng
bụng
nhạt
và
dõi
đến
mắt
nâu
màu
đó
hoặc
do
gạch
dcnThức
củng
với
cua
nhùng
ruổi
vần
giấm
ngang
lãlà
nhùng
de
dâng
trái
trong
cây
tự
chín,
nhiên
vậy
chủng
ta
bất
gặp
chúng
rầt
TM/ V*:
J.2.1.1. Vịng đài ruồi giấm
Ruổi giấm lả lồi sinh san hùu tinh con dực và con cãi cõ khác biệt rỏ ràng về hĩnh
thè nên rất dè phân biệt. Trung binh con cãi sè đè khoáng 400 qua trũng trong ca cuộc din
Trứng ruồi giấm dài khoang 0.5 mm hĩnh oval, cỏ màu trảng dục. ớ đầu trước có hai sợi hô
hấp nho kẽo dãi từ mặt lưng gân tới dẩu tận phía trước. Trong diều kiện thịng thường
khoang 25cC trứng sê nơ sau 12
15 giờ thành
ầu trùng giai đoạn 1. Lúc này sửc ãn cua ầu trùng rất lòn. chủng SC ãn lien tục vã sau đó
lột xác thành ầu trũng giai doạn 2, 3 lần lượt sau 24h vả 48h từ khi nơ. Trong giai đoạn ấu
trùng, chúng tích cực ăn các vi khuân, vi trũng vã các manh vụn trẽn thức án. có the là cãc
manh phàn húy cua trái cây. rau cu. nấm men...
Giai đoạn ấu trũng kẽo dãi khống 4 ngày, sau dó ẩu trùng giai đoạn 3 sẽ rời khoi
bề mặt thức án vã tím chồ khơ ráo de dóng ken, bước vào giai doịin nhộng. Áu trũng ruồi
sè dược bao bọc bơi một lớp biéu bi cứng vã sảm màu dần theo thời gian. Trong giai doạn
nãy ấu trũng sè biến thãi hoãn toàn vả quã trinh nãy mẩt khoang 4 ngây. Cuối cùng, nhộng
lột xác vã trơ thành ruổi giầm trương thảnh, bải dầu một chu ki mới. Tuõi thọ cua mỗi giấm
Ớ25®c kẽo dài khoang 35 45 ngày?
Hình
doợnphát
ỉ.Ị.nhộng,
triển:
Vịng dời
trúng,
cua
ruồithành.
giầm. Ruồi giầm trui qua 4 giai
ầu
trùng
con
trường
re 2$. V*:
• -U
16
1.2.1.2.
cẩu trúc cơ thê ruồi giấm
Ruồi giấm lã một loài động vật nhó bẽ vã $0 với con người chúng cách xa hãng
triệu năm lien hõa. tuy nhiên sự tương đổng giừa cầu true cơ the người vã ruồi giấm đưực
bao tồn một cách dáng ngục nhiên5 Đặc biệt lã về cấu trúc thần kinh, khi quan sãt các giãy
thần kinh xuất phát từ tuy sống cua ruổi và người cõ thê thấy sự phân chia rỏ răng trong
từng phần cua cơ thê. Ớ người và ruổi đều tồn tại hệ thần kinh trung ương ơ phần dầu và
hệ thần kinh túy sống ơ phần thán Các te bão thần kinh có chung hệ thống gen protein chức
nâng và cấu trúc bơi synap Ca hai loài dcu cỏ sự phản chia các vùng chức nàng ơ nào
tương tự nhau như vùng thị giác, vùng khứu giác, vùng tiếp nhận, xư lý. lưu trừ thịng tin
và vũng vận động.41
Hình 1.2. Bào tồn về cầu trúc cua hệ thun kinh giừa người và ruồi giấm/1
1.2.1.3.
Hự gen cùa ruồi giầm
Ruồi giầm là sinh vật dược sư dụng dầu liên dề nghiên cứu về di truyền Từ những
nãm dầu cúa the ky XX. nhã di truyền học Thomas Hunt Morgan dà sư dụng loài vật này
de tạo nên cõng trinh nghiên cửu VI* đụi cua minh VC quy luật di truyền, dày là cơ sơ
khoa học vững chắc cho ngành di truyền học cho den tận ngây nay. Với sự ra đời cua các
phương pháp giai trình tự gen. tồn bộ hệ gen cua ruồi giẳm hiện nay dà được giai mà vã
lộp ban dồ chi tiết.5 Ruồi giấm có 4 cập nhiễm sắc thê. trong dó có 3 cặp nhiêm sẩc the
thường và 1 cặp nhiễm sắc thè giới tính Trên các cặp nhiễm sắc thê chửa khoáng 132 triệu
cặp base gồm 15500 gen. Thực tế số lưụng gen trên nhiêm sảc thê sổ 4 rất ít. bời vậy các
TM/ V*:
17
nghiên cứu chi tập trung vào nhiễm sẩc the giới tinh nhiêm sắc thê sổ 2 vã nhiêm sắc thê số
3/ Từ dó quy định vià kiều gen cùa ruồi giầm cùng chi thề hiện trên 3 cập nhiễm sác thề.
dược ngản cách bơi dấu Cảc alcn tương dồng dược ngăn cách bằng dẵu gạch ngang.
Hình 1.3. Quy tắc ký hiệu kiêugen cùa ruồi giấm và ứng dụng trong vỉểtphép lai di truyền.
P: thề hệ bồ nty: Fỉ: thế hệ con lai: »v. gen white quy định kiểu hình mất trống: vg: gen
vestigial quy (lịnh kiều hình cảnh ngắn: B: gen Hai quy (tịnh giant kích thước mắt: •’+
gen kiêu dụi (wildrype).
Với vice
hiểu
rị
về
cấu
trúc
bộ
gen
việc
so
sánh
vã
dưa
ra
các
giấm,
bằng
các
chứng
nhà
khoa
đi
truyền
hục
có
VC
thê
mối
hiểu
liên
rị
quan
hơn
về
giừa
chức
người
nàng
vàcũng
ruồi
như
nhừ
vai
lợi
trơ
thế
cua
này
một
việc
gen
thao
trên
tác
ruồi
di
truyền
tương
ững
trẽn
trẽn
mơ
hình
người.
ruồi
Cùng
giầm
cùng
khá
dễ
dàng.
TM/ V*:
ỉ.2.2. ứng dụng mô lùnh ruồi giấm trong nghiên cứu
Qua nhiều thập ky sư dụng mó hình ruồi giấm đề nghiên cửu, cãc nhã khoa học dà
cho chúng la (hẩy răng đây là một mô hinh nghiên cứu tuyệt vin Khi mà cơ tói 6 giai
Nobel VC Y học vã Sinh lý học có sự gỏp mật cùa ruồi giấm Những lý do đà the hiện rằng
mõ hinh ruồi giắm thực sự tuyệt vời bao gồm:
•
Các phân đoạn trong cơ thê cua ruổi giấm và người cõ sự tương dồng cao
•
Hộ gen cua mồi giấm dà được lộp bân dỗ chi tiểt
•
Ruồi giấm có 70% gen bệnh tương dồng với người
•
Chi có 4 cụp nhiềm sẩc thè, vi vậy việc sảng lọc di truyền trớ nẻn dề dăng
•
De dâng thực hiện các thao tác di truyền như chuyên gcn. gày đột biến, biêu hiện
protein ngoại lai
•
Vơng đời ngấn, chi mất 10 ngày trong điều kiện 25° c dê cõ một thế hộ mới. Đây là
một lợi thế trong việc nghiên cửu giai mà quy trinh sinh học. lào hỏa. hay phơi
nhiễm độc chất...
•
Cấu trúc cơ thê hồn chinh, tạo lợi the trong việc nghiên cứu về chun hóa
•
Dẻ dàng kiêm soát từ giai đoạn hứng den lúc trướng thành tạo diều kiện thuận lợi
cho việc nghiên cứu tế bào gốc. ung thư
•
ít hụn chế về mặt đạơ dức
•
Chi phi duy tri mô hĩnh re. dễ dàng tạo ra một quần thê lớn. rất tiềm nâng cho việc
sàng lọc thuốc
•
Trẽn thế giói có nhiều trung tâm lưu trừ tạo dõng mồi chuyên gen, dễ dàng dật mua
hoặc trao đồi các dòng ruổi phục vụ cho nghiên cứu
•
Có nhiêu cịng cụ vã phần mem hỗ trợ cho các thi nghiệm.
DEF
Hình 1.4. Một sổ hoạt dộng lưu trữ và thao tảc trên ruồi giầm. A Tu lưu dữ ruồi;
B Bộ dụng cụ gáy mẻ ruồi và kinh soi nôi; c - Ĩng ni ruồi: D Một số dựng cụ
cơ han: E DŨI silicon dế bẳí ầu trùng: F Tách nào (iu trùng ruồi giầm.
1.2.3.
ứng dụng mơ hình ruồi giầm trong nghiên cứu rổì loạn phố tự ky.
Với nhùng lựi the như trẽn, mơ hình ruổi giấm đà đirợc img dụng rộng rầi trong
nhiều lính vực nghiên cứu như mơ phong bệnh lý. tương tác gcn. tiếp xúc dộc chắt, ung
thư. te bão gốc. thư nghiệm thuốc... Một số nghiên cửu dà xảy dựng vả đảnh giả bệnh ASD
thõng qua mõ hĩnh ruổi giấm, từ dỏ xác dịnh những yếu tổ tác dộng như gen hay môi
trường lên hành vi. tuổi thụ. vặn dộng vã Cẩu trúc than kinh cùa ruồi giấm Một nghiên cữu
từ nám 2015 cùa Wise vã cộng Sự dã sử dụng mị hình ruồi giầm đẽ nghiên cứu về anh
hường cua dột biền gen rugose (một gcn tương dồng với gen neurobeachin • XBEA ớ
người) đến chứng rối loạn phố tự kỷ. Cụ the. ruồi bị dột biến gen rugose cò cầu trúc thần
kinh bất (hưởng, giám kha nâng hoạt dộng, bị ành hướng đến lụp tính, cường độ hoụt dộng
vã hành vi tương tác xà hội. 6 Trước dó cũng dã có nghiên cứu cht ra ràng những dột biến
mất đoạn gen NBEA dàn đến bệnh tự kỹ vô cán ớ tre nam
42143
Nghiên cứu về họ gen ABC
liên quan đến rổi loạn phổ tự kỷ vói hai nghiên cứu về gen ABCA13 và ABCC4 sư dụng
mị hình ruồi giấm Khi knockdown 2 gen này tại mõ nào dà thu dược ruồi giắm cỏ kiêu
hĩnh bicu hiện bệnh tự ky Cụ thệ ruồi giam biêu hiện gen có hiện tượng giam kha nàng
tương tâc xà hội. rồi loụn nhịp thức ngu vả cấu trúc thằn kinh cơ bị biến đoi. 44'45 Ngoài ra
đột biến %enABCA13 cũng dã dược chứng minh lã cỏ liên quan den rối loạn phô tự ký trên
mỏ hình động vật bộc cao.*6 Nhùng kết qua tiên đà cho thấy ring mõ hĩnh ruồi giấm rất
tiêm nâng dê nghiên cửu bệnh tự ky.
1.2.4.
Phương phũp knockdown một gen bung kỹ thuật RNAi và biếu hiện gen
knockdown bung hệ thung GAL 4 - l'A s.
Hộ thống GAL4 U/\S dược sữ dụng de nghiên cứu bleu hiẻn cua gen trên mõ hĩnh
ruồi giấm. Hộ thống này dược phát triền bơi Hitoshi Kakidani vã Mark Ptashne vào nám
19X8 vã dưực sứ dụng dầu tiên vã nàm 1993 bơi Brand vã Perrimon trẽn ruổi giấm-4"
43
Hệ thống gồm hai phần: một gen mã hỏa cho protein GAL4 vã một gen chứa trinh tự ƯAS
(Upstream activating sequence/ gần trước gen dích. Dựa vào dó, dè tàng biếu hiện gen
trong mị hình ruồi giầm các nhà khoa học dà phát triên hệ thống nảy khi sứ dụng hai dõng
ruồi:
•
Một dịng chứa gcn mà hóa protein GAL4 dược điều hòa bơi promoter dịnh hướng
mõ gọi là dịng driver. Theo dó CỈAI.4 sè dưực biêu hiện ớ một mõ nhắt dịnh như.
dịng av - GAL4 cho biêu hiện dặc hiệu ớ mõ nào. gmr - GAL4 cho biêu hiện ớ
mix. pnr GAL4 cho biêu hiện ớ cánh...
•
Dịng cịn lụi chứa UAS gấn trước gen đích, có tác dụng liên kết đặc hiệu với
protein GAL4 kich hoạt phiên mă
Khi hai dõng ruồi nãy sổng dộc lụp vói nhau tức lã GAL4 sè khơng gằn với UAS.
khi dó gen đích sỗ khơng dưực kích thích biếu hiện. Nhở vậy. chúng ta cô thê
21
dề dàng duy tri các dõng ruồi chứa gen bệnh mã vẫn đàm bão sức sổng cua chúng. Điều
này đặc biệt thuận lợi khi nghiên ciru về cảc proticn có tính độc cao và trành biếu hiện
protein ngoại lai thường xuyên, anh hướng đến sức sổng cùa cảc dòng ruồi chuyền gen.
gáy tro ngại lón cho nghiên cứu. Khi thực hiện thi nghiệm, hai dịng ruồi trén được lai vói
nhau; tạo ra con lai mang ca hai yếu tố GAL4 và ƯAS. Lúc nãy protein GAL4 được điều
khiên bưi promoter định hướng mô. biêu hiện đặc hiệu ơ một mõ nhắt định. Tại đó protein
GAL4 sc gắn với ƯAS hoạt hịa sự phiên mã cùa gcn đích. Việc nãy giúp biêu hiện gcn
đích tại một mõ nhầt định tránh việc biêu hiện khắp nơi làm giam súc sống cua ruồi giấm,
dặc biệt lả cỏ thê nghiên cứu chuyên biệt một mò cần quan tâm
Ruòi biêu hiện GAL4
Ruòi chúa gen mục tiêu gản với
ƯAS
Promoter định _ _
buông mõ
Gen mục ũéu không biếu hiện khi
vảng mặt GAL4
GAL4
GAL4 đưọc biêu hiện
định hưởng mõ
VAS „___________.
, . * 2 Gen mục tiêu (trinh tụ
bám
cùa ŨAL4)
GAL4 kích hoạt sự biêu hiện cua gen mục tiêu thõng qua việc bám lẽn ƯAS
Hình Ị.5. Bien hiộngen thịng qua hệ thong GAL4 - UAS.
TC V*:
22
Ngoài chức năng biểu hiện vượt mức một protein, hệ thống GAL4 UAS cùng có
thỏ sử dụng dê tạo ra kiếu hĩnh mất hay giam biêu hiện cùa một gen bảng cảch biêu hiện
RNA Sựi đôi (dsRNA) nội sinh nhầm knockdown gen theo cơ che RNAi (RNA
Interference RNA can thiệp). Đáy lã một cơ chế bao tồn cua sinh vật đa bào. nõ sè irc chề
biếu hiện một gen khi xuất hiện một sợi RNA dơi có cẩu trúc giống hột gen này. Đây
dường như là hệ thống tự vệ cua te bão khi cô các phần tư di truyền ngoại lai xâm nhập. 4’
ứng dụng cơ chề này vào việc lãm giam biêu hiện gen ơ ruồi giấm có the dược trinh bày
như sau:
Khi dsRNA có cầu trúc kẹp tóc (hair pin) dược tạo ra từ sự phién mã ưình tự lặp lại
đao chiều cùa gen dích nhờ hệ thống GAL4 - UAS. Lúc nảy enzyme Dicer sc cắt các doạn
dsRNA thành những doạn RNA ngấn (siRNA) kích thước khoang 21 28 nucleotide. Các
siRNA sẽ gắn với phức hộ RISC, tại dãy enzyme Heìicase sẽ phân giai siRNA thành mạch
dơn khi có sự hoạt hõa cua ATP Lúc nãy phức hộ RISC dược hoạt hõa trơ thành RISC'.
Nhờ vào siRNA sợi đơn gắn ưên phức hệ. RISC’ sè tím den đoạn mRNA có trinh tự tương
ứng rồi phân giai nõ Khi mRNA bị phân húy quả trinh dịch mà sè không xay ra dàn dến
việc giam bicu hiện gen.
RX»W III DICER Câl
dtltXA Ibiabcic UR.YA
các đoậotlRNAg
ort pbac bệ RISC
S
U!
■RA % bit rfp uRXA H
pbM CUI đưưi au RI SC
Hvbcâir pbtn
pỉUB CU1 uKN K ATP •xb toi
tbâU mạrb \ óa Qui cmb Bây ro \
/
X/
Hình 1.6. CơcheRNA can thiệp (RNA interference - RNAi).
TC V*:
1.3. Tổng quan vè thụ thế Glycine vã mối liên quan cua gen GLRA2 đến hội chứng rối loạn
phô tự kỷ
Thụ the Glycine (Glycine receptor GlyR hoặc GLR) lã một thành viên cua siêu họ
thụ thế võng Cys (Cys loop receptors CLRs) cũng với các thụ thè đản truyền thần kinh
khác như thụ thê Nicotinic Acetylcholine (nAChR). Serotonin 5HT3 hay ax it yaminobutyric (GABA) ở động vật có xương sống.50
Thụ thê Glycine được cắu tạo bới năm ticu dơn vị con bao quanh một lỏ trung tàm.
mỏi tiếu dơn vị gồm 4 phân doạn xoắn « xuycn mãng. íl Hiện tại chúng ta dâ biết đen 5
dồng dạng cùa các tìcu don vị con bao gồm 4 tiếu dơn vị a (GLRAI. GLRA2 GLRA3.
GLRA4) vả một tiêu dơn vị p (GLRB). Mỏi tiểu dơn vị dược mà hõa bơi các gcn tương
ừng GLR.il. GLRA2, GLRi3, GLRA4, GLRB.i:
GLR dược biết den lã các thụ thể ức che đản truyền thằn kinh chinh ớ túy sống và
thân nào người trướng thảnh.5J Chức năng cùa nó thường dược thè hiện nhiều nhất trong
việc hoạt hóa cãc kênh ion clorua phối tứ trẽn bể mật tế bão thần kinh sau synap. Cụ thê.
khi Glycine dược giài phỏng dưới sự kích thich thần kinh từ mãng trước synap, nó sè dược
truyền đến mảng sau synap vã liên kết với cãc thụ thè trẽn kênh ion clorua phổi tử, lúc dó
kênh nảy sẽ được mớ ra cho phép các ion cr di qua mảng tế bào. Đây là một phán ứng ức
chế gãy ra sự tâng phân cực í4
Ngoai báo
Máng tẽ bão
Vịng xồn
xuy én núng
A
Nội bào
Hình ỉ. 7. Cư chề hoạt dộng cùa kênh ton clorua thụ thề Glycine. A kênh ion
dorua dõng, lỉ Khi Glycine liên kết vin thụ thế, phần kênh ỉon Clorua cua thụ thế
sẽ mở ra. cho phép ion cỉ' di qua màng tề bào
Các thụ the Glycine chửa tiếu phần
trọng trong cãc khóp thần kinh tuy sống vã thản nào. góp phần kiỡn sốt vận động vã nhịp
hơ hấp
55
Cãc đột biển trong gen GLRA1 giai thích biếu hiện chinh cua chủng
hypeiekplexia: một chúng rỗi loạn giật minh quả múc di truyền, một số dột biền mới dược
xác định trong các gen GLRB và GỉyT2 cũng gáy cho tré vị thành niên các rối loạn lương
tự.* Ngoài ra bicu hiện cua gen GLRA3 tại hổi hai mà cùng dược chững minh lả có liên
quan dến bệnh dộng kinh thùy thãi dương?"
Trong khi đó cảc GLR chữa tiêu dơn vị «2 dược phàn bố rộng rài trong nào phôi
thai và dược chứng minh lã cõ vai trò trong quá trinh phát triển vo nầo. 58 Ngoài ra nõ cùng
được chứng minh lã cõ biếu hiện mạnh nhất tại mò nào người trướng thành. 59 Vi vậy vai
trô cua GLRA2 trong cãc vấn de VC thần kinh rất dược chú trọng Liên quan đến hội chứng
tự ky. khi phân tich gen cua một bé trai bị ASD người la dà xác định dược một dột biển
mất đoạn exon cùa gen GLRA2 (Aex8-9) gảy mẩt d|nh vị tế bão. Sau đó. nhỏm nghiên cứu
này cùng dà gĩài mà trinh tự cho 400 tre nam mắc chứng ASD và xác định đưực một dột
biển sai nghía mởi (p rl53Q). dợt biền nãy khơng xuất hiện trong nhóm dồi chủng. Phân
tíchm Yivo dã chững minh rảng dột biền prl53Q gảy giam bicu hiện bề mặt và giam rỏ rệt
độ nhạy với Glycine.4 Từ dô họ tiểp tục sư dụng mõ hinh cá ngựa văn vã chuột dê nghiên
cứu Ket qua cho thấy khi giâm biêu hiện gen GLRA2 ơ cá ngựa văn dà gày ra khuyết tật
phản nhánh sợi trục nghiêm trọng Chuột bị loụi bo gen GLRA2 biêu hiện sự thiêu hụt trong
bộ nhớ nhận dụng vật thê vã suy giam kha năng ghi nhỡ lâu dãi ơ vó nào trước Các nghiên
cim trên dà cung cắp bang chứng VC vai trô cua gen GLRA2 vỡi hội chứng ASD. làm
giam kha nàng tương tác xà hội. khá nàng học tập, ghi nhớ và có nhìmg biền đơi trong cấu
trúc thần kinh1
Nhận thầy nhùng vai trõ cùa gen GLRA2 liên quan đến hội chúng rối loạn phố tự
ky là rất dáng quan tàm. Bèn cạnh dó. mơ hình ruồi giầm là một mõ hinh kinh tế. hiệu quá
cùng với nhiều ưu diềm tuyệt vời khác. Chúng tịi dà sứ dụng mỏ hình náy dê tiền hãnh
nghiên cúu những lác dộng khi giam biẻu hiện gen dGLR.42 (drosophila meianogơster
Glycine receptor «;) tương tự như gen GLRA2 ờ ngươi, việc xây dụng và đánh giá biểu
hiện mỏ hinh ruồi giấm tự ky. lả tiền dề cho các nghiên cứu về các con dường tin hiệu và
cơ chế bộnh sinh cua ASD lien quan đen gen GLRA2 trẽn in vixv. dồng thời cung cắp một
mị hình tiềm năng và kinh te cho nhùng nghiên cứu. thứ nghiệm và sàng lọc thuổc sau
này.
CHƯƠNG 2. HỎI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cửu
2.1.
Dổi tượng nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng các dòng ruồi chuyển gcn được thu thập tại các trung tám lớn
trên the giới, bao gồm:
•
elav GAL4 ( mả số =8760 Bloomington Stock Center) dòng driver định hướng bicu
hiện protein GAL 4 tại mò nào ruồi giầm
•
ƯAS - GFP - IR: - (mà số =9331 - Bloomington Stock Center): Biêu hiện dsDNA
cua gen GFP
•
ƯAS dGLRA2 IR - (mã số 3516S4 CG6927 Bloomington Stock Center): biêu hiện
dsDNA cua gen dGLRA2
•
Sp Cyo; elav - Gal4: biêu hiện kiểu hình lơng bên dãi. cánh cong và định hưởng
biêu hiện protein GAL4 tại mơ nào ruồi giấm
•
+; sp Cyo. TM6B XV biêu hiện kiêu hinh lỏng bẽn dài. cánh cong: thân ngấn, mắt
trắng
2.2.
Nguyên vật liệu, hoa chất vá thiết bị
2.2.
Ỉ. Ngun vật Uệu và hỏa chất
•> MĨI trường thức ãn cơ ban
•
Agar 0.75% (w v) (Sen a)
•
Đường 5% (wv)
•
Bột ngỏ 5% (w v)
•
Bột câm gạo (w v)
•
Nấm men 5% (w v)
•
Propionic acid 0.5% (v v) (Merck -Đủc)
•
Sodium benzoate 0.1% (w v) (Merck Đức)
• Sữa bột 3% (xv v) (Nutrifood)
Nước cất một lần
