Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò - lời cảm tạ

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:
* Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần. Ba mẹ đã
luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập.
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức
cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ
trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức.
* BSTY. Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt khóa luận này.
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
* BSTY. Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường,
Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
* Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơn
Đoàn Thị Tuyết Lê
iii
TÓM TẮT
ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005. “ỨNG
DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO
TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.
Hội đồng hướng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân
BSTY. Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta,
stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và

9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc hồng
trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng; khuẩn
lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích
DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả
multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có
mang gen độc lực đó.
(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần
lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1,
stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae). Điều
này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen độc lực có
thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.
(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của
bò, bê và heo.
iv
SUMMARY
“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli
isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”
The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes of
isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9 swabs of
the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink colony on
MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC.
Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony
groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of
multiplex – PCR were showed that:
(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the
genes.
(2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was
25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from

piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).
(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli.
(4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples
weren’t detected.
v
MỤC LỤC
CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ................................................................................................................iii
Tóm tắt....................................................................................................................iv
Summary...................................................................................................................v
Mục lục....................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt......................................................................................viii
Danh sách các hình...................................................................................................x
Danh sách các bảng..................................................................................................xi
1. ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................1
2. TỔNG QUAN.........................................................................................................3
2.1. Vi khuẩn E. coli............................................................................................3
2.1.1. Định nghĩa...........................................................................................3
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa............................................................3
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên...........................................................................4
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli............................4
2.1.5. Phân loại E. coli...................................................................................4
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC.....................................................4
2.1.5.2. Nhóm EPEC.............................................................................7
2.1.53. Nhóm ETEC..............................................................................8
2.2. Kỹ thuật PCR.............................................................................................11
2.2.1. Nguyên tắc........................................................................................11
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR.......................................................12
2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR....................................................14

2.2.4. Phân tích kết quả PCR.......................................................................15
2.2.5. Những ứng dụng của PCR.................................................................15
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ.................15
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.........................16
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA.......................................16
vi
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau.............17
2.2.6. Các hạn chế của PCR.........................................................................17
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện.................................................................19
3.2. Nội dung....................................................................................................19
3.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................19
3.3.1. Lấy mẫu............................................................................................19
3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli...................20
3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của
E. coli phân lập được........................................................23
3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di..................................25
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................27
4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc
phân lập được..............................................................................................27
4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường
thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC....................................................27
4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn...................................27
4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bò tiêu chảy............................................................28
4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân heo tiêu chảy...........................................................32
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bê tiêu chảy..............................................................36
4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli

phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò....................................................................38
4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát...............................................................39
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................41
5.1. Kết luận......................................................................................................41
5.2. Đề nghị.......................................................................................................41
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................42
7. PHỤ LỤC.............................................................................................................46
vii