Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hoá giàu saponin và tinh chế saponin từ củ tam thất panax pseudoginseng (burk) f h chen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGÔ HẢI HÀ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
CAO CHUẨN HỐ GIÀU SAPONIN VÀ TINH
CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX
PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2021


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
Người thực hiện: NGƠ HẢI HÀ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
CAO CHUẨN HOÁ GIÀU SAPONIN VÀ TINH

CHẾ SAPONIN TỪ CỦ TAM THẤT PANAX
PSEUDOGINSENG (BURK.) F.H.CHEN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2016.Y
Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Khanh
TS. Đào Thị Thanh Hiền

Hà Nội - 2021

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể các thầy cơ giáo thuộc Ban Chủ
nhiệm, các phòng ban trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã dìu
dắt, giúp đỡ trong suốt năm năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện trên ghế nhà
trường và tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.
Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ
Nguyễn Văn Khanh – giảng viên bộ môn Bào chế và công nghệ dược phẩm trường
Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng tiến sĩ Đào Thị Thanh Hiền là
người đã trực tiếp tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong khoảng thời gian thực
hiện đề tài.
Đồng thời, em xin cảm ơn các thầy cô trong bộ Bào chế và công nghệ dược
phẩm thuộc Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tạo điều kiện để em có
thể thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã ln ln
động viên và giúp đỡ em trong lúc khó khăn cũng như trong q trình thực hiện
khóa luận này.
Hà Nội, tháng 6 năm 2021
Sinh viên

Ngơ Hải Hà


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...................................................................................3
1.1. Tổng quan về cây tam thất ( Panax Pseudoginseng)..........................................3
1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất..............................................................3
1.1.2. Phân bố của cây tam thất......................................................................3

1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất......................................................4
1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất...................................................5
1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất.......................................................8
1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền........................................................... 11
2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất............................ 12
2.2.1. Nguyên tắc chung............................................................................... 12
2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất................13
2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất...................................14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................16
2.1. Đối tượng và nguyên vật liệu thí nghiệm.......................................................... 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................... 16
2.1.2. Ngun liệu, hố chất......................................................................... 16
2.1.3. Máy móc, dụng cụ.............................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 18
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1,
ginsenosid Rb1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao................................. 18
2.2.2. Quy trình chiết xuất và tinh chế saponin............................................. 20
2.2.3. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được......22
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................. 22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ........................................................................................ 23
3.1. Thẩm định phương pháp định lượng R1, Rg1 và Rb1 trong tam thất bằng phương
pháp HPLC.............................................................................................................. 23


3.1.1. Độ đặc hiệu của phương pháp............................................................. 23
3.1.2. Tính thích hợp của hệ thống............................................................... 25
3.1.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ....................................................... 26
3.1.4. Độ lặp lại............................................................................................ 27
3.1.5. Độ đúng.............................................................................................. 28
3.2. Định lượng saponin toàn phần trong mẫu củ tam thất...................................... 29

3.3. Chiết xuất saponin toàn phần từ củ tam thất..................................................... 30
3.4. Tinh chế saponin trong mẫu củ tam thất........................................................... 32
3.4.1. Tinh chế saponin toàn phần................................................................. 32
3.4.2. Tinh chế saponin điển hình bằng sắc ký lỏng đầu dị PDA.................33
3.5. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được....................34
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN..................................................................................... 37
4.1. Về phương pháp định lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao......................................................... 37
4.2. Về quy trình chiết xuất và tinh chế saponin...................................................... 37
4.3. Về quy trình xác định cấu trúc và độ tinh khiết của các saponin tinh chế được 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................................... 41
1. Kết luận............................................................................................................... 41
2. Đề xuất................................................................................................................ 41


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7

Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 2.1
Hình 3.1

Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11


MỞ ĐẦU
Từ xưa, các loại thảo dược tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ
truyền với tác dụng bồi bổ cơ thể cũng như điều trị bệnh lý của người bị bệnh. Ngày
nay, việc ứng dụng các loại cây cỏ tự nhiên trong các lĩnh vực chăm sức khoẻ con
người càng được quan tâm và đẩy mạnh phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường
ngày càng tăng của các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược. Trong các loại thảo dược
có tác dụng bồi bổ cơ thể, các cây thuộc chi sâm như nhân sâm (Panax ginseng) hay
sâm Mỹ (Panax quinquefolium) đã được biết đến và sử dụng rộng rãi bởi những lợi
ích và ứng dụng của các loài cây này đối với sức khoẻ con người, và Panax
pseudoginseng (Burk.) F. H. Chen, hay còn gọi là tam thất, là một trong những loài
cây thuộc chi sâm có tác dụng hàng đầu có thể kể đến. Tam thất là một loài dược
liệu quý, được biết đến từ xa xưa với vai trò là một vị thuốc y học cổ truyền sử dụng
phổ biến với những tác dụng như bồi bổ thân thể người bị suy nhược, điều trị chảy
máu [1, 4, 43, 48].
Đến thời điểm hiện tại, đã có hơn 200 hợp chất hố học đã được phân lập và
xác định từ các bộ phận khác nhau của cây Tam thất, trong đó thành phần chủ yếu là
các saponin, với năm loại saponin chính có thể kể đến là notoginsenosid R 1,
ginsenosid Rg1, Rb1, Rd và Re [43, 48]. Các saponin này đã được chứng minh có

tác dụng tốt đối với sức khoẻ, như các lợi ích đối với hệ tim mạch [43, 48, 51], khả
năng chống xơ vữa động mạch[50], khả năng chống viêm [12, 45], chống oxi hoá
[49], giảm nồng độ cholesterol trong máu cũng như điều hoà huyết áp [31, 36] và
giảm rủi ro mắc phải ung thư [9, 20, 24, 43]. Trong tam thất, ba thành phần saponin
chính được đặc biệt lưu ý là notoginsenosid R 1, ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rb1
bởi tác dụng điều trị các loại bệnh xu hướng của thế kỷ 21, như các bệnh về tim
mạch [48, 51], tiểu đường [31, 36] hay ung thư [9, 20, 24].
Từ những minh chứng trên, có thể thấy tam thất là một dược liệu quý giàu
saponin với nhiều tác dụng dụng có lợi đối với sức khoẻ con người. Việc sản xuất
cũng như ứng dụng tam thất trong lĩnh vực chăm sóc sức khoẻ là một thị trường đầy
tiềm năng tại Việt Nam. Tuy nhiên, hiện nay ở nước ta các nghiên cứu về chiết xuất
cao chuẩn hoá giàu saponin cũng như phân lập các saponin riêng biệt còn hạn chế.
Việc phân lập các saponin chính từ tam thất có nhiều ý nghĩa trong việc đánh giá tác
dụng dược lý của các saponin này, từ đó những nghiên cứu sâu hơn về các saponin
điển hình trong tam thất có thể được tiến hành. Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài
1


“Xây dựng quy trình chiết xuất cao chuẩn hố giàu saponin và tinh chế saponin từ
củ tam thất Panax pseudoginseng (Burk) F.H.Chen với hai mục tiêu chính như sau:
1.
Xây dựng được quy trình thẩm định ba loại saponin R1, Rg1 và Rb1 có
trong củ tam thất.
2.
Xây dựng được bào chế cao chuẩn hoá giàu saponin từ tam thất và tinh
sạch hai loại saponin điển hình từ cao chuẩn hố giàu saponin.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây tam thất (Panax Pseudoginseng)
1.1.1. Tên khoa học của cây tam thất
Tên khoa học: Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen, trong giới thực vật
có vị trí phân loại như sau:
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Thực vật hạt kín (Magnoliophyta)
Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida)
Bộ: Hoa tán (Apiales)
Họ: Nhân sâm (Araliaceae).
Chi: Sâm (Panax)
Loài: Tam thất (pseudoginseng)
Tên đồng nghĩa: Aralia quinquefolia var. notoginseng Burkill; Panax
pseudoginseng var. notoginseng (Burkill) G.Hoo & C.L.Tseng hoặc Panax
pseudoginseng Wall.
Tên thường gọi: sâm tam thất, kim bất hoán, nhân sâm tam thất, điền thất [1,
4].
1.1.2. Phân bố của cây tam thất
Tam thất có nguồn gốc ở phía nam Trung Quốc, được trồng từ lâu đời và
khơng cịn được tìm thấy trong trạng thái mọc trong tự nhiên. Cây được nuôi trồng
nhiều nhất ở tỉnh Vân Nam, sau đó là Quảng Tây và ở một số quốc gia khác như Đài
Loan, Nhật Bản, Triều Tiên [4]. Sự nhạy cảm với ánh sáng của cây hạn chế sự phân
bố của tam thất tại Trung Quốc [43].
Ở
Việt Nam, tam thất là một loại cây được nhập trồng từ Trung Quốc [4].
Tam thất được trồng với số lượng ít tại một số tỉnh như: Hà Giang (Đồng Văn), Lào
Cai (Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng… tại các vùng núi cao 1200 –
1500 m [1].

3

1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây tam thất
Tam thất là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân tam thất mọc thẳng, không
phân nhánh, cao 30 – 50 cm, màu tím tía. Lá kép chân vịt, màu xanh đậm, 3 – 4 lá
mọc vòng, cuống lá dài 3 – 6 cm, mỗi cuống lá gồm 5 – 7 lá chét hình mác, cuống lá
chét dài 0,6 – 1,2 cm, gốc thn, đầu có mũi nhọn, mép khía răng, hai mặt có lơng
cứng ở gân, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt [4].
Cụm hoa hồn chỉnh có đường kính 5 – 25 mm, tổng chiều dài cuống từ 5 –
45mm. Cuống nhỏ ở một đầu và đầu còn lại chứa nhiều nụ hoa, với khoảng 130–
230 hoa [48].Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có hoa đơn tính, có hoa
lưỡng tính cùng tồn tại. Hoa màu lục vàng nhạt, đài 5 răng ngắn, màu xanh, tràng 5
cánh rộng ở phía dưới, nhị 5, bầu 2 ơ. Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín màu đỏ,
trong có hai hạt hình cầu, màu trắng [4].
Rễ chính có hình nón hoặc trụ, với chiều dài từ 1 – 6 cm, có màu vàng hoặc
nâu với các vết nhăn và nếp rễ. Cây thường được thu hoạch vào mùa thu, trong thời
gian trước khi nở hoa và có thể được nghiền thành bột sử dụng cho đường uống
hoặc kết hợp với các thảo dược khác [4].

Hình 1.1. Hình ảnh cây và củ Panax pseudoginseng (Burkill) F. H. Chen

4


1.1.4. Thành phần hoá học của cây tam thất
Theo các nghiên cứu, hơn 200 thành phần hoá học đã được phân lập từ tam thất.
Trong số đó, saponin (4,42 – 12%) [4] chiếm hàm lượng lớn và được coi là thành phần
chính, ngồi ra trong tam thất cịn chứa những thành phần khác như flavonoid, các
peptit vòng, đường saccarid và các nguyên tố vô cơ. Những thành phần phân bố trong
các bộ phận khác nhau của cây như rễ, thân, hoa và lá với tỉ lệ khác nhau.

Saponin được coi là thành phần chính trong Panax pseudoginseng. Trong
thực tế, đã có hơn 100 loại saponin được phân lập và xác định, xthuộc ba nhóm
ginsenosid, notoginsenosid và gypenosid. Hầu hết các saponin trong cây tam thất là
các triterpen thuộc nhóm Dammarane với nhóm aglycon là 20(S)-protopanaxadiol
(nhóm Rb) hoặc 20(S)-protopanaxatriol (nhóm Rg). PPG có thành phần khơng chứa
bất cứ saponin nào có nhóm axit oleanolic(nhóm Ro), đây là một khác biệt lớn so
với cây Panax ginseng C. A. Meyer and Panax quinquefolius L. Mỗi bộ phận khác
nhau của tam thất sẽ chứa thành phần và tỉ lệ saponin khác nhau tuỳ theo từng bộ
phận cụ thể. Nghiên cứu cho thấy ginsenosid Rb 1 có nhiều trong tất cả các bộ phận
của cây, trong khi Rg1 giàu trong thân và rễ. Rg3 – một chất được báo cáo về khả
năng bảo vệ thần kinh - có hàm lượng lớn trong nụ hoa tam thất. Thơng thường,
năm loại saponin chính là notoginsenosid R1 (7 – 10%), ginsenosid Rb1 (30 – 36%),
Rg1 (20 – 40%), Rd (5 – 8,4%) và Re (3,9 – 6%) chiếm tới khoảng 90% tổng số
saponin trong tam thất được nghiên cứu cùng ứng dụng trong thí nghiệm về dược lý.
Trong số đó, ba saponin lần lượt là ginsenosid Rb 1, ginsenosid Rg1 và
notoginsenosid R1 được chọn làm hợp chất tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng tam
thất. Để tăng cường sự đa dạng phân tử của ginsenosid, đồng nghĩa với khả năng
tìm kiếm được các chất có hoạt tính sinh học mới, các nghiên cứu khoa học đã được
thực hiện nhằm xác định các sản phẩm thuỷ phân và các sản phẩm biến đổi sinh học
của saponin nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính mới, mở ra hướng nghiên cứu mới
trong việc ứng dụng tam thất trong điều trị [43].

5


Hình 1.2. Cấu trúc phân tử notoginsenosid R1 và ginsenosid Rb1

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử ginsenosid Rg1 và ginsenosid Rd

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử ginsenosid Re
6


Ngoài các loại saponin, các thành phần khác cũng được báo cáo có mặt
trong Panax pseudoginseng. Trong PPG, các peptit vịng được tìm thấy có cấu trúc
là các hợp chất mạch vịng hình thành dựa trên các liên kết peptit do 2 – 37
protein hoặc axit amin không phải protein tạo nên. Chúng được tìm thấy trong
các thực vật thuộc họ Caryophyllaceae và Rhamnaceae và được phân chia thành
hai lớp, năm lớp phụ và tám loại. Đã có 14 loại peptit vòng được phân lạp
và xác định về cấu trúc dựa trên phương pháp quang phổ, đó là các
peptit vịng sau: cyclo- (Leu-Thr), cyclo- (Leu-Ile), cyclo- (Leu-Val), cyclo- (IleVal), cyclo- (Leu-Ser), cyclo- (Leu-Tyr), cyclo-(Val-Pro), cyclo- (Ala-Pro), cyclo(Phe-Tyr), cyclo- (Phe-Ala), cyclo- (Phe-Val), cyclo- (Leu-Ala), cyclo- (Ile-Ala) và
cyclo- (Val-Ala) [35].
Saccarid phân lập từ cây bao gồm monosaccarid, oligosaccarid và
polysaccarid. Polysaccarid tồn tại trong nhiều bộ phận, với hàm lượng cao nhất
ở rễ chính. Tổng hàm lượng đường của rễ PPG gần gấp đôi so với thân rễ,
và hàm lượng polysaccarid của hoa gấp đôi so với thân và lá của tam thất.
Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh rằng các polysaccarid trong PPG có tác
dụng bổ trợ và hoạt động kích thích miễn dịch.
Một số loại flavonoid đã được phân lập ra từ PPG, chủ yếu là flavonol và
flavonglycosid như liquiritigenin, quercetin hay kaempferol-3-O-α-Lrhamnoside.

Có một lượng ít sterol đã được phân lập và xác định từ PPG, bao
gồm β-sitosterol, daucosterol, stigmasterol, stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid
và stigmast-7-en-3β-ol-3-O-β-D-glucopyranosid.
Hơn 19 loại amino axit đã được phân lập trong PPG, với 7 trong số
chúng được coi là thiết yếu [43].
Các thành phần dầu dễ bay hơi trong PPG gồm tecpen, rượu, aldehit,
olefin và ankan. Terpen được coi là một thành phần quan trọng vì tỷ lệ tương
đối cao trong hợp chất. Hơn 91 chất dễ bay hơi đã được phân lập từ dầu của

hoa nụ hoa tam thất, với các thành phần chính là spathulenol (12.19%), α‐gurjunen
(6.73%), bicyclogermacren (6.57%), germacren‐D (5.26%) và bicycloelemen
(3.55%) [33].

Ngồi các hợp chất hóa học được liệt kê ở trên, cịn có các thành phần
khác được phân lập từ PPG, bao gồm icarisid B6, guanosin hydrat, axit béo, các
nguyên tố vô cơ và muối khoáng [43].


7


1.1.5. Tác dụng dược lý của cây tam thất
Đúc kết từ các kinh nghiệm xưa cùng với các nghiên cứu hiện đại, tam
thất đã được chứng minh là một loài cây với nhiều tác dụng dược lý tốt lên hệ
tim mạch, hệ miễn dịch, khả năng chống xơ vữa động mạch, hoạt động
cầm máu, khả năng chống ung thư…



Tác động lên hệ tim mạch

Rất nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng điều trị các bệnh tim
mạch thông qua việc sử dụng PPG thơng qua hai tác dụng chính: khả năng ảnh
hưởng đến tế bào nội mô và khả năng bảo vệ tế bào cơ tim. Cụ thể, trong
cao huyết áp, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tăng cường hoạt động của
các tế bào nội mô cơ tim thông qua tác dụng giảm nồng độ NO và ET-1
trong máu đã làm giảm khả năng tăng huyết áp trong chuột thí nghiệm
[43]. Ngồi ra tác dụng bảo vệ tế bào tim mạch của saponin 20 (S) ‐panaxadiol
thông qua việc chống lại sự oxi hố, cùng với tác dụng hình thành mạch máu

của ginsenosid Rg1 có tác dụng trong điều trị chữa lành vết thương do thiếu
máu cục bộ [48].
Trong suy tim, thông qua thử nghiệm điều trị chuột bị suy tim sử dụng
ginsenosid Rb1 (35 và 70 mg/kg) và losartan (4,5 mg/kg) trong 8 tuần, Rb1 đã
được chứng minh có tác dụng khơi phục chức năng tim và ty thể, tăng hấp
thu glucose và bảo vệ chống lại quá trình tái định dạng tim thơng qua các
con đường tín hiệu TGF-β1/ Smad, ERK và Akt [51].



Khả năng chống xơ vữa động mạch

Thực nghiệm trên 3 nhóm chuột được sử dụng parafin lỏng, zymosan (20mg/kg,
3 ngày 1 lần) và zymosan cùng PNS (100mg/kg hàng ngày) trong 9 tuần, kèm chế độ ăn
nhiều chất béo đã đã chứng minh khả năng trong việc điều trị xơ vỡ động
mạch của PNS. Kết quả mẫu máu trên chuột đã chứng minh PNS có thể ngăn ngừa
và điều trị xơ vữa động mạch dựa trên khả năng chống viêm, giảm mức lipid
trong máu cũng như khả năng sửa chữa mạch máu. Cơ chế chính của tác
dụng này là do khả năng kháng viêm thông qua sự ức chế chuyển vị của p65 NF-kB
[50].



Khả năng gây đông máu và chữa lành vết thương

Tam thất được coi là thần dược trong điều trị chảy máu trong và ngoài trong
điều trị chấn thương. Các thành phần saponin có tác dụng làm giảm viêm, giảm
stress oxy hóa và ức chế endotoxin và myeloperoxidase trong giai đoạn hồi phục

của chuột bị sốc xuất huyết [43]. Nghiên cứu riêng về ginsenosid Rg1 được phân
lập còn cho

8


thấy tác dụng thúc đẩy tạo mạch máu con đường tín hiệu VEGF-KDR/FIK-1 và
I3K-Akt-eNOS [18].



Hoạt động chống oxy hố

Các flavonoid và saponin từ tam thất đã được chứng minh có hoạt tính chống
oxy hóa và loại bỏ gốc tự do. Tại nồng độ 0,2 – 1,0 mg/ml, các flavonoid trong tam thất
có hoạt tính chống sự oxi hố của axit 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulphonic,
các gốc superoxit anion và các gốc hydroxyl vượt trội hơn so với axit ascorbic. Ngồi
ra, các flavonoid cịn hể hiện tác dụng ức chế đối với Staphylococcus aureus,
Aeromonas hydrophila và Pseudomonas aeruginosa[17]. Một số loại saponin từ tam
thất cũng được báo cáo về tác dụng chống lại stress oxy hoá trên ty thể [49].



Khả năng chống viêm

Hoạt động chống viêm của PPG được chứng minh thông qua các cơ chế khác
nhau, đặc biệt thông qua con đường NF- kB. Tam thất có tác dụng ngăn chặn sự tập
trung và kích hoạt của bạch cầu trung tính, đại thực bào và tế bào lympho dẫn đến
sự hạn chế giải phóng của ROS, lysozym, prostaglandin, leukotrien và các cytokin
gây viêm, làm giảm thiệt hại cho các mô xung quanh [45].

Thực nghiệm cho thấy ginsenosid Rb1 có khả năng chống viêm thơng qua
khả năng hạn chế sự giải phóng của các cytokin gây viêm trong các tế RAW264.7,
cũng như giảm lượng COX-2 và iNOS. Trong các thử nghiệm trên động vật, Rb 1 có
tác dụng giảm chấn thương do viêm thận cấp và chữa trị nhiễm trùng huyết do
lipopolysaccarid [12].



Khả năng hạ đường huyết và chống tăng lipid máu

Trong tam thất, PNS có tác dụng làm tăng đáng kể độ nhạy với insulin cũng như
cải thiện cân bằng nội mô glucose trong các thử nghiệm trên chuột KK-Ay, điều này có
ý nghĩa rất lớn trong q trình kiểm sốt tiểu đường. Ngồi ra, PNS cịn có khả năng
điều chỉnh về cả mức độ cũng như độ nhạy cảm của leptin trên chuột KK-Ay, hóc mơn
này có tác dụng kiểm sốt năng lượng tổng thể cũng như sự cân bằng nội môi trong
trao đổi chất, thơng qua đó giảm nhu cầu thức ăn và và chất béo [37].
Trong 5 thành phần chính của PNS, Rb 1 và Rg1 được báo cáo về tác dụng thúc
đẩy tiết insulin của tế bào beta và làm giảm tích tụ chất béo trung tính. Tác dụng nói
trên được dựa trên cơ chế cải thiện cân bằng đường nội mơi bằng cách tăng cường q
trình tạo chất béo trung tính trong tế bào mỡ và tăng cường chức năng và khả năng
sống sót của tế bào beta thơng qua con đường phụ thuộc PKA [31].

9




Tác dụng bảo vệ thần kinh

Đã có những ghi nhận về tác dụng của các PNS như ginsenosid Rg 1, Rb1,

notoginsenosid R1 và các polysaccarid từ cây về khả năng hạn chế sự chết tế bào
thông qua việc điều chỉnh tỉ lệ Bcl-2/Bax và biểu hiện của Trx-1, SOD-1, HSP70,
giảm biểu hiện của caspase-1, caspase-3 và các protein có liên quan, nhằm khơi
phục con đường tín hiệu Akt-NF-kB có tác dụng chống chết tế bào. Các cơ chế
chống viêm cũng có tác dụng trong việc bảo vệ thần kinh. Ngồi ra, các saponin cịn
có tác dụng thúc đẩy q trình chuyển hóa và bảo vệ cấu trúc của tế bào thần kinh
chống lại tổn thương do thiếu oxy trong ống nghiệm một cách toàn vẹn, thúc đẩy
tăng sinh tế bào gốc thần kinh hồi hải mã và biệt hóa thành tế bào thần kinh và tế
bào thần kinh đệm mới [43]. Ginsenosid Rb 1 có thể điều chỉnh mức protein của yếu
tố thần kinh có nguồn gốc từ não. Ngồi các tác dụng trên, PPG có tác dụng chống
thối hóa thần kinh, ginsenosid Rb1 có thể điều chỉnh giảm protein Tau q trình
phosphoryl hóa trong bệnh Alzheimer [30].



Khả năng hỗ trợ và kích thích miễn dịch

Các chất trong tam thất như saponin dạng protopanaxadiol, ginsenosid -Rb 1, Rd, notoginsenosid -K, -R4 phân lập từ P.notoginseng có tác dụng tăng cường mạnh
một số kháng thể đặc hiệu và các phản ứng tế bào chống lại ovalbumin (OVA) trên
chuột, và chúng còn có khả năng tặng hoạt hố tế bào lympho T và tế bào lympho B

ở

chuột miễn dịch với OVA [43].



Tác dụng lên thận

Nghiên cứu chỉ ra rằng các PNS có khả năng bảo vệ chống lại độc tính trên

thận do cisplatin gây ra[27], ngồi ra PNS cịn có tác dụng giảm sự chết của mô
thận thông qua ức chế con đường ty thể, do tác dụng giảm biểu hiện của caspase 9
và Bax và tăng biểu hiện của Bcl-2 [28].



Tác dụng lên gan

Các loại PNS còn thể hiện tác dụng bảo vệ các tổn thương gan do nhiều nguyên
nhân như rượu, carbon tetrachlorid, … Những tác dụng điều trị của các loại saponin kể
trên đối với bệnh xơ gan có thể liên quan đến hoạt động điều hòa miễn dịch của nó đối
với các cytokin tiền xơ và chống xơ hóa, cũng như đặc tính chống oxy hóa. Ngồi ra,
PNS có thể làm giảm chứng thiếu máu cục bộ đường ruột, rối loạn chức năng vi mạch
gan do tái tưới máu và tổn thương tế bào gan bởi cơ chế chống viêm

[43].
Cụ thể, tác dụng của ginsenosid Rg1 tại gan đã được chỉ ra như việc
giảm nồng
10


độ đường huyết trong máu và chỉ số kháng insulin tại chuột, làm tăng nồng
độ aspartate transaminase và alanin transaminase trong mơ hình chuột T2 ‐ DM
[36]. Tác dụng bảo vệ gan của ginsenosid Rg1 cịn được thể hiện thơng qua
việc điều chỉnh con đường tín hiệu Keap1-Nrf2-ARE [13].



Cơ chế chống ung thư

Các chiết xuất và thành phần của PPG đã được kiểm chứng về khả
năng chống ung thư đối với bệnh ung thư ruột kết, ung thư gan, ung
thư phổi, u lympho, ung thư tuyến tuỵ, ung thư vú. Cơ chế chính có thể
do sự ức chế sự tăng sinh tế bào và gây ra quá trình chết rụng tế bào thơng
qua giảm điều hồ biểu hiện Bcl-2, tăng điều hoà biểu hiện Bax, giảm tiềm
năng xuyên màng của ty thể, và sự hoạt hoá của caspase-3 [43].
Trong ung thư vú, ginsenosid Rg1 đã được báo cáo về khả năng gây
chết tế bào theo chương trình, và ngăn chặn sự hình thành tế bào khối u
ở chuột thực nghiệm thơng qua sự ngăn chặn tổn thương do oxi hố[9].
Ngồi ra, những báo cáo khác về khả năng chống ung thư tại xương hay
ung thư bạch cầu cũng đã cho thấy khả năng chống ung thư của Rg1
trong tam thất [20, 24].
1.1.6. Tam thất trong y học cổ truyền
Rễ tam thất được thu hái trước khi ra hoa, rửa sạch, phơi khô hoặc
sấy khô, rồi phân loại thành rễ củ, rễ nhánh và thân rễ.
Tam thất có vị đắng, ngọt, tính ẩm, vào các kinh can, thận, có cơng
năng hoạt huyết, bổ huyết, cầm huyết, tiêu ứ máu, tiêu sưng, giảm đau.
Tam thất được dùng làm vị thuốc trong các bài thuốc y học cổ truyền của
Việt Nam như chữa các chứng chảy máu khi bị thương hoặc chữa suy
nhược cơ thể ở người cao tuổi hoặc phụ nữ có thai. Trong y học cổ truyền
Ấn Độ, tam thất là thuốc bổ và làm tăng khả năng thích nghi của cơ thể
[4].
Tại Trung Quốc, từ xa xưa rễ của tam thất đã được sử dụng như
một phương thuốc cầm máu nổi tiếng, là thành phần chính trong Vân Nam
Bạch Dược – một phương thuốc nổi tiếng của Trung Quốc. Các ghi chép về
cây có thể được tìm thấy từ rất sớm trong cuốn Bản Thảo Cương Mục của Lý
Thời Trân, với các tác dụng được đề cập đến như cầm máu, loại bỏ máu ứ,
giảm đau và điều trị chảy máu do vật sắc, ho ra máu, nôn trớ, chảy máu cam
và lỵ ra máu [43].

11


2.2. Các phương pháp chiết xuất và tinh chế saponin từ tam thất
2.2.1. Nguyên tắc chung
Chiết tách là bước đầu tiên và có vai trị lớn trong việc thu hồi và làm sạch các
chất có hoạt tính sinh học từ ngun liệu thơ. Trong PPG, sản phẩm chính thu được sau
quá trình tách chiết là các loại saponin, tuy vậy do bản chất của saponin là một chất có
độ phân cực cao, khơng bền về mặt hố học và nhiệt học, không dễ bay hơi dẫn đến
những thách thức trong việc tìm ra các biện pháp hiệu quả trong quá trình tách chiết
[29]. Chính vì vậy, rất nhiều các biện pháp chiết tam thất đã được thử nghiệm, cụ thể
như các phương pháp chiết xuất phổ thông như ngâm, sử dụng soxhlet, chiết nóng hồi
lưu cùng với các biện pháp chiết xuất hiện đại như chiết xuất sóng siêu âm, hỗ trợ vi
sóng hay chiết dung mơi nhanh, với các kỹ thuật có những ưu điểm và nhược điểm
riêng biệt. Trong quá trình tách chiết tam thất, các bước được tiến hành lần lượt là: Quá
trình tiền xử lý, chiết xuất và sau đó là tinh chế sản phẩm.

Tiền xử lý là bước đầu tiên trong quá trình tách chiết, được tiến hành với
mục đích tăng hiệu quả của quá trình chiết xuất. Các bước tiền xử lý bao gồm làm
khơ, giảm kích thước hạt và khử chất béo. Các nguyên liệu thô từ thực vật (rễ, vỏ
cây, lá, thân, củ) thường được làm khơ và sau đó nghiền thành bột trước khi nhằm
giảm kích thước hạt với mục đích tăng hiệu quả truyền khối của quá trình chiết. Các
nguyên liệu thơ thường được làm khơ. Q trình khử chất béo được tiến hành thông
qua việc sử dụng dung môi ưa béo, chẳng hạn như ethyl axetat hoặc n–hexan nhằm
loại bỏ chất béo khỏi hỗn hợp. Hiệu quả của quá trình phân tách được cải thiện bằng
cách sử dụng một phần của cây có nồng độ saponin cao nhất [29].
Các phương pháp chiết thường được phân loại theo 2 nhóm chính: các phương
pháp chiết xuất truyền thống và các phương pháp chiết xuất hiện đại. Các phương pháp
chiết xuất truyền thống có thể kể đến như ngâm, chiết bằng soxhlet, chiết nóng hồi lưu

(HRE), với hiệu suất chiết xuất trong các phương pháp này phụ thuộc phần lớn vào khả
năng tan của nguyên liệu trong dung môi. Điều này dẫn đến sự bắt buộc của việc sử
dụng lượng lớn dung môi, kèm theo sự hỗ trợ về nhiệt độ (đun nóng) hoặc cơ học
(khuấy và lắc). Các nhược điểm chung có thể thấy của phương pháp truyền thống là về
thời gian, lượng dung môi sử dụng lớn, hiệu suất thấp và khả năng phân huỷ của các
chất trong thời gian chiết [8]. So sánh với các phương pháp cũ, các phương pháp chiết
xuất hiện đại được cho là tối ưu hơn, do các ưu thế như việc sử dụng ít dung mơi, tốn ít
thời gian hơn, có khả năng tự động hoá cũng như hiệu quả

12


hơn. Càng ngày càng có nhiều các thí nghiệm nhằm tối ưu hoá hiệu suất chiết xuất
saponin trong tam thất thông qua các phương pháp chiết xuất hiện đại [29].
Việc phân lập các thành phần trong hỗn hợp chiết của tam thất có thể tốn
nhiều thời gian và do sự đa dạng và phức tạp trong cấu trúc của các thành phần.
Chính vì vậy, rất nhiều kỹ thuật phân lập đã được tiến hành thử nghiệm nhằm tìm ra
biện pháp phân lập và tinh chế hiệu quả nhất [32, 42]. Các biện pháp thường được
sử dụng có thể kể tới là sắc ký cột, sắc ký lỏng hiệu năng cao và sắc ký phân bố
ngược dòng tốc độ cao [11, 21, 22, 41].
2.2.2. Các phương pháp chiết xuất saponin toàn phần từ tam thất
Tam thất thường được chiết xuất với dung môi cồn nồng độ cao, thông qua
nhiều phương pháp khác nhau nhu đun hồi lưu, chiết siêu âm, chiết nóng. Những
phương pháp này đều đạt được hiệu suất cao về khả năng chiết xuất saponin từ tam
thất [38]. Ngoài ra, các nghiên cứu cũng chỉ ra như các yếu tố như thời gian, nồng
độ ethanol sử dụng, tỉ lệ dược liệu – dung môi và số lần chiết cũng sẽ ảnh hưởng tới
hiệu suất chiết của saponin [19].
Một số phương pháp cụ thể có thể tham khảo như:
Theo patent CN101513438A: PPG đầu tiên được làm sạch, khơ, sau đó
nghiền nhỏ và trộn với dung môi ethanol 85% với tỷ lệ dược liệu/dung môi là 6 –

o

10. Hỗn hợp được chiết thông qua phương pháp đun hồi lưu với nhiệt độ 60 C. Sau
khi đun, dịch chiết được đem đi lọc, sau đó tiếp tục chiết và lọc, tổng cộng ba lần
chiết. Dịch lọc được gộp lại và cô đặc thu hồi dưới điều kiện áp suất thấp ở nhiệt độ
o

60 C. Dịch cô đặc được loại tạp bằng việc sử dụng vật liệu hấp phụ là nhựa
macroporous D101 theo lần lượt các bước: Rửa giải trước bằng nước cất để loại tạp,
sau đó rửa với ethanol 70%, thu được dịch rửa giải ethanol, cô đặc dịch, rửa giải
thông qua cột alumina bằng 70% ethanol, dịch rửa giải được cô đặc đến khơ để thu
được saponin tồn phần. Theo thống kê, hàm lượng saponin tồn phần của phương
pháp có thể đạt lên tới hơn 14% [10].
Theo patent CN104800258A về quá trình chiết xuất PPG tồn phần, tam thất
được nghiền nhỏ thành bột thơ sau đó cho vào bể chiết kết hợp với nước tinh khiết
với tỷ lệ từ 6-8 lần, thêm chất nhũ hóa, trộn đều tới khi hỗn hợp hoà lẫn với nhau.
Hỗn hợp được chiết xuất bằng biện pháp đun hồi lưu hai lần, mỗi lần trong một giờ.
Dịch chiết được được tổng hợp lại từ hai lần, điều chỉnh pH của dung dịch từ 7 – 8
sau đó lọc và lấy dịch. Dịch lọc được tiến hành hấp phụ và sắc ký thông qua nhựa
13


macroporous, rửa giải bằng ethanol nồng độ 50 – 70% trong một hoặc hai lần. Dịch
rửa giải thu được sẽ được loại bỏ ethanol bằng biện pháp ngưng tụ dưới môi trường
áp suất giảm và tiến hành sấy phun để thu được dạng bột. Các ưu điểm của phương
pháp được kể ra như: hiệu suất chiết tăng hơn 30% so với các phương pháp thông
thường, thời gian và số lần chiết tam thất được giảm thiểu, cùng với sự tiết kiệm về
giá thành cũng như tổng thời gian chiết xuất [47].
Theo patent CN101049331A, PPG được nghiền thành hạt có đường kính 3 –
8 mm, sau đó thêm dung mơi ethanol nồng độ 65 – 75% với tỷ lệ dược liệu/dung môi

từ 10 đến 12 lần. Hỗn hợp dịch được mang đi chiết bằng phương pháp hồi lưu hai lần,
mỗi lần 2 giờ. Dịch thu sẽ được hấp phụ bằng nhựa macropative D101 và rửa giải bằng
nước tinh khiết với tổng thể tích khoảng từ 4 đến 6 lần thể tích cột, và sau đó được rửa
với dung dịch amoniac 0,05 – 1% với thể tích khoảng 4 – 6 lần thể tích cột. Rửa cột
bằng nước đến pH = 7, sau đó rửa bằng ethanol 20 – 30% với thể tích bằng 3 – 5 thể
tích cột, và cuối cùng rửa giải bằng ethanol 60 – 80% với thể tích bằng

3

– 5 thể tích cột, thu được saponin tồn phần [16].

2.2.3. Các phương pháp tinh chế saponin từ tam thất
Đối với tuỳ loại saponin cần phân lập và tinh chế, có các phương pháp khác
nhau được tiến hành như sau:
Phương pháp tinh chế notoginsenosid R1 và ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd từ
củ tam thất: Đầu tiên, tam thất được chiết bằng dung mơi ethanol 40 – 95%, sau đó
dịch chiết được tách phân đoạn để thu được notoginsenosid R 1 và ginsenosid Rg1,
Re, Rb1 và Rd. Quá trình rửa giải áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao
pha đảo với tỉ lệ hệ dung môi nước/ethanol biến đổi từ 30% đến 80% được sử dụng
trong quá trình. Phương pháp này có một số ưu điểm như quy trình đơn giản, khơng
gây ơ nhiễm, chi phí thấp và độ tinh khiết cao (hơn 97%) [44].
Phương pháp tinh chế Ginsenosid Rg1, Re và Rb1: Chiết xuất saponin PPG toàn
phần được hòa tan với ethanol, thêm dodecylbenzen natri sulfonat, sau khi hịa tan
xong nạp vào nhựa hấp phụ macroporous khơng phân cực, với dung môi rửa giải là
ethanol, cô đặc dịch rửa giải thu được. Sản phẩm khơ được hịa tan với ethanol, sau đó
được nạp vào sắc ký cột với q trình rửa giải gradient dung mơi là ethanol 80%

- 50%, ở nhiệt độ không đổi, phát hiện ginsenosid Rg1, Re và Rb1 bằng detector UV.
Ginsenosid Rg1, Re và Rb1 có độ tinh khiết hơn 90% [22].

14