Nghiên cứu tác dụng của thạch tùng răng cưa (huperzia serrata (thunb ) trevis) trên mô hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến rugose
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.76 MB, 51 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
--------***--------
TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG
RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.)
TREVIS) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ
MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
HÀ NỘI-2021
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
TRƯƠNG THỊ HOÀI PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA THẠCH TÙNG
RĂNG CƯA (HUPERZIA SERRATA (THUNB.)
TREVIS) TRÊN MƠ HÌNH RUỒI GIẤM TỰ KỶ
MANG GEN ĐỘT BIẾN RUGOSE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƯỢC HỌC
Khóa: QH.2016.Y
Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. PHẠM THỊ NGUYỆT HẰNG
2.
THS. ĐỖ THỊ QUỲNH
HÀ NỘI-2021
LỜI CẢM ƠN
Em muốn được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt
Hằng, trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu Trung ương, người thầy đã
truyền cảm hứng, trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như kinh
phí để em thực hiện đề tài khóa luận này.
Em muốn gửi lời cảm ơn tới ThS. Đỗ Thị Quỳnh, Bộ môn Y Dược học cơ
sở, Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội. Cô đã cho em cơ hội được
nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời
khuyên quý báu, giúp đỡ em trong suốt q trình thực hiện khố luận tốt nghiệp.
Em muốn gửi lời cảm ơn tới các thầy cô bộ môn Y Dược học cơ sở, cô chủ
nhiệm và các thầy cô bộ môn khác của Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia
Hà Nội, trong suốt khoảng thời gian 5 năm qua, đã cung cấp cho bản thân em rất
nhiều kiến thức và kinh nghiệm quý báu, quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi
cho em trong quá trình học tập.
Em xin cảm ơn tập thể các anh chị, cán bộ khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện
Dược liệu Trung ương đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tình cho em trong quá trình thực
nghiệm, cũng như chia sẻ những kinh nghiệm quý giá ứng dụng thực tế.
Cuối cùng, em xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã
ln động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi em gặp khó khăn trong học
tập cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa
luận này cịn có nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cơ
bạn bè để khóa luận được hồn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 29 tháng 5 năm 2021
Sinh viên
Trương Thị Hoài Phương
MỤC LỤC
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................................... 2
1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ................................................................................................. 2
1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ............................................................................... 2
1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ............................................................................. 2
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ....................................................... 3
1.1.3.1 Yếu tố di truyền học
1.1.3.2 Yếu tố nguy cơ từ môi trường
3
5
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ............................... 6
1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ................................................... 7
1.1.6. Một số mơ hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ............................................... 7
1.2. Tổng quan về ruồi giấm............................................................................................................. 8
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển................................................... 8
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm............................................... 9
1.2.2.1. Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm
1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm
9
9
1.2.2.3. Chu kỳ vịng đời của ruồi giấm 9
1.2.3. Mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ............10
1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa........................................ 11
1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại....................................................................................... 11
1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng.................................................. 12
1.3.3. Thành phần hoá học và tác dụng sinh học...................................................... 13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................ 15
2.1. Dược liệu nghiên cứu............................................................................................................... 15
2.2. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................................... 15
2.3. Hoá chất, dụng cụ, thiết bị nghiên cứu.............................................................................. 15
2.3.1. Hoá chất
2.3.2. Dụng cụ, thiết bị
15
16
2.4. Thiết kế thí nghiệm................................................................................................................... 16
2.4.1. Căn cứ để chọn mức liều 2 mg/ml và 4 mg/ml............................................. 16
2.4.2. Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu...............16
2.4.3. Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu............................18
2.4.4.Chia lơ thí nghiệm..................................................................................................... 18
2.5. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................ 18
2.5.1. Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mơ hình
ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi......................18
2.5.1.1. Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi
giấm 18
2.5.1.2. Thử nghiệm đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm
trưởng thành 19
2.5.1.3. Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi
giấm trưởng thành 20
2.3.1.4. Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng
thành 21
2.5.2. Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng
răng cưa đối với khả năng sống sót của ruồi giấm Rugose trưởng thành..................... 22
2.6. Phân tích kết quả.......................................................................................................... 23
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................................... 24
3.1. Kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với ruồi
giấm Rugose đột biến gen mang hội chứng tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi...............24
3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với
khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội
chứng tự kỷ........................................................................................................................................... 24
3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh đối
với khả năng trèo của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ . 26
3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa tới khả
năng cải thiện mức độ tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen
mang hội chứng tự kỷ....................................................................................................................... 28
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa ảnh tới sự
thay đổi nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự
kỷ.............................................................................................................................................................. 30
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa tới
khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT......................................................................................................... 35
1. Kết luận............................................................................................................................................. 35
2. Đề xuất............................................................................................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT
Viết tắt
1
ABA
2
ADHD
3
ASD
4
DSM-5
5
FRM1Fragile X Mental Retardation 1
6
NBEA
7
TSC
8
TTRC
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD)................................. 5
Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái....................................................................................................... 9
Hình 1.3: Chu kỳ vịng đời của ruồi giấm................................................................................. 10
Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa........................................................................................... 12
Hình 2.1: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng...................19
Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm..................21
Hình 2.3: Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor.................................. 22
Hình 2.4: Mơ hình đánh giá mức độ cải thiện khả năng sống sót................................... 23
Hình 3.1: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng vận
động của ấu trùng ruồi giấm tự kỷ.............................................................................................. 24
Hình 3.2: Kết quả đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành bằng thử
nghiệm leo trèo ở các thời điểm 3, 7, 10 ngày tuổi............................................................... 26
Hình 3.3: Khả năng tương tác cộng đồng của ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng
tự kỷ.......................................................................................................................................................... 28
Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa đối với khả năng hoạt
động của ruồi giấm Rugose............................................................................................................ 30
Hình 3.5: Kết quả phân tích mức độ vận động tại thời điểm buổi sáng của ruồi giấm
trong 6 ngày.......................................................................................................................................... 31
Hình 3.6: Đồ thị phân tích khả năng sống sót......................................................................... 33
ĐẶT VẤN ĐỀ
Rối loạn phổ tự kỷ (Autism spectrum disorder- ASD) là một rối loạn thần kinh
phức tạp với những rối loạn về hành vi thường xuất hiện trong những năm đầu đời của trẻ,
được đặc trưng bởi sự suy giảm khả năng giao tiếp, tương tác xã hội kết hợp với những
hành vi, sở thích hoặc hoạt động hạn chế và lặp đi lặp lại [34]. Gần đây, có nhiều sự thay
đổi về nhận thức cũng như tiêu chuẩn chẩn đoán kết hợp với các yếu tố sinh học và môi
trường, tỷ lệ tự kỷ đang gia tăng một cách nhanh chóng ở tất cả các quốc gia
[24]. Nguyên nhân của tự kỷ đến nay vẫn chưa được xác định chính xác cũng như
chưa có phương pháp hay thuốc điều trị đặc hiệu [11]. Trong khi đó, các thuốc tân
dược hiện đang sử dụng mới chỉ giúp cải thiện triệu chứng, tuy nhiên, lại gây ra nhiều
tác dụng không mong muốn nguy hiểm [32]. Do đó, nhu cầu nghiên cứu phát triển các
loại thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu khơng hoặc có ít tác dụng khơng mong muốn
để hỗ trợ và điều trị hội chứng tự kỷ là rất cần thiết và đang được thế giới quan tâm.
Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis họ
Thạch tùng (Thông đất) (Lycopodiaceae). Ở Việt Nam, cây mọc hoang dã tại một số
vùng núi cao từ 1000 m trở lên, như là Lào Cai, Cao Bằng,… Theo kinh nghiệm dân
gian, toàn cây Thạch tùng răng cưa được sử dụng để điều trị suy nhược thần kinh, mất
trương lực cơ, cầm máu... [70] nhờ có các thành phần hoá học như alkaloid Huperzin
A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques…[21]
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu thuốc từ dược liệu nói chung và Thạch tùng răng
cưa nói riêng nhằm hỗ trợ điều trị hội chứng tự kỷ còn rất hạn chế. Do đó, chúng tơi
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata
(Thunb.) Trevis) trên mơ hình ruồi giấm tự kỷ mang gen đột biến Rugose” với hai
mục tiêu cụ thể sau:
1.
Đánh giá tác dụng cải thiện hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis) trên mơ hình ruồi giấm đột
biến gen mang hội chứng tự kỷ.
2.
Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng
thành đột biến gen mang hội chứng tự kỷ của cao chiết cồn từ cây Thạch tùng răng cưa
(Huperzia serrata (Thunb.) Trevis).
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hội chứng tự kỷ
1.1.1. Khái niệm về hội chứng tự kỷ
Tự kỷ - “Autism” là tên gọi chứng rối loạn phát triển, đặc trưng bởi khiếm khuyết
về mặt thiết lập các mối quan hệ, tương tác với xã hội, do nhà tâm lý học Leo Kanner
đặt ra vào năm 1943 [49]. Chi tiết hành vi của nhóm trẻ mắc bệnh này được mơ tả bao
gồm: "Thiếu quan hệ tiếp xúc về mặt tình cảm với người khác; các thói quen thường
ngày rất giống nhau về tính cách kỳ dị và tỉ mỉ; khơng có ngơn ngữ nói hoặc ngơn ngữ
nói khác thường; rất thích xoay các đồ vật hình trịn; có kỹ năng mức cao về nhìn nhận
khơng gian hoặc giỏi trí nhớ "vẹt", hình thức bên ngồi có vẻ hấp dẫn, nhanh nhẹn,
thông minh" [34, 35, 40, 55, 59].
Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh
là “Autism Spectrum Disorder (ASD)”), do sự đa dạng triệu chứng biểu hiện [66].
Ngày nay, một thuật ngữ khác nữa được gọi để chỉ nhóm các rối loạn phức tạp
này là “Hội chứng tự kỷ”. Người ta chia rối loạn phổ tự kỷ thành 5 phân loại bao gồm:
rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative và rối loạn phát
triển lan toả không được chỉ định khác [8, 34].
Năm 2008, Liên hiệp quốc đưa ra khái niệm: “Tự kỷ là một dạng khuyết tật phát
triển tồn tại suốt cuộc đời, thường xuất hiện trong 3 năm đầu đời. Tự kỷ là do rối loạn thần
kinh, gây ảnh hưởng đến chức năng hoạt động của não bộ. Tự kỷ có thể xảy ra ở bất cứ cá
nhân nào, khơng phân biệt giới tính, chủng tộc hoặc điều kiện kinh tế - xã hội. Đặc điểm
của tự kỷ là những khiếm khuyết về tương tác xã hội, giao tiếp ngơn ngữ, phi ngơn ngữ và
có hành vi, sở thích, hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại”. Đây được coi là khái
niệm tương đối đầy đủ và được đưa vào sử dụng phổ biến nhất.
Những khiếm khuyết liên quan đến ASD hiện diện trong suốt cuộc đời và được
coi là có tác động đáng kể về mặt chức năng, xã hội và tài chính đối với các cá nhân bị
ảnh hưởng, gia đình và xã hội [23].
1.1.2. Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ
Theo thống kê mới nhất của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), người ta ước
tính rằng trên tồn thế giới cứ 270 người thì có một người mắc ASD. Ước tính này đại
diện cho một con số trung bình và tỷ lệ hiện mắc được báo cáo khác nhau đáng kể giữa
các nghiên cứu. Tuy nhiên, một số nghiên cứu được kiểm soát tốt đã báo cáo những
con số cao hơn đáng kể. Tỷ lệ mắc ASD ở nhiều quốc gia có thu nhập thấp và trung
bình vẫn chưa được biết rõ [65].
2
Tỷ lệ trẻ em mắc ASD ngày càng tăng ở mọi quốc gia. Một cơng bố của Trung
tâm kiểm sốt và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) vào năm 2014 đã cho biết tỷ lệ
rối loạn phổ tự kỷ là 1/68, tức cứ 68 trẻ thì có 1 trẻ mắc ASD, tăng 30% so với năm
2012 [2].
Xét về giới tính, theo nhiều nghiên cứu ở nhiều quốc gia khác nhau bao gồm cả
Việt Nam, ASD có tỷ lệ gặp ở trẻ em nam cao gấp 3 lần so với trẻ em gái [31, 37, 41,
46, 48, 63, 64].
Tại Việt Nam, theo thống kê sơ bộ của Bộ Lao Động - Thương Binh và Xã Hội,
Việt Nam có khoảng 200000 người mắc chứng tự kỷ và số lượng trẻ được chẩn đốn
và điều trị ngày càng tăng lên, nếu tính theo cách tính của Tổ chức Y tế Thế giới, con
số này ước chừng 500000 người [1]. Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và cộng sự năm
2019 cho thấy: tỷ lệ mắc ASD ở trẻ 18-30 tháng tuổi ở miền Bắc Việt Nam là khoảng
75.2/10000 trẻ. Tỷ lệ mắc ASD ở trẻ em được tìm thấy trong nghiên cứu này khá tương
đồng với tỷ lệ mắc ASD trung bình trên thế giới với tỷ lệ khoảng 0.76%. Cũng trong
nghiên cứu này, kết quả cho thấy những trẻ em sống ở thành phố có tỷ lệ mắc rối loạn
phổ tự kỷ cao hơn trẻ em sống ở nông thôn. Mức độ đơ thị hóa ngày càng tăng, dẫn
đến trẻ có nguy cơ mắc hội chứng càng cao hơn. Một điểm đáng lưu ý nữa là tỷ lệ mắc
ASD cao hơn ở những trẻ có mẹ làm nơng nghiệp. Phát hiện này cho thấy có thể có
mối quan hệ giữa ASD và thực hành canh tác, đặc biệt là việc sử dụng thuốc bảo vệ
thực vật phổ biến ở Việt Nam [31].
1.1.3. Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ
Nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ hiện vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.
Vì rối loạn rất phức tạp và khơng có hai người mắc chứng tự kỷ giống hệt nhau nên có
lẽ có nhiều nguyên nhân gây ra hội chứng này. Các bằng chứng khoa học hiện có cho
thấy có thể có nhiều yếu tố khiến trẻ có nhiều khả năng mắc ASD, bao gồm các yếu tố
về môi trường và di truyền.
1.1.3.1. Yếu tố di truyền học
Theo một nghiên cứu về khả năng di truyền của các rối loạn phổ tự kỷ năm 2015,
tiền sử gia đình là một trong những yếu tố đáng chú ý làm tăng khả năng mắc ASD. Ước
tính có từ 64% đến 91% rủi ro là do tiền sử gia đình có người mắc hội chứng [8].
Mặc dù, đã chỉ ra rằng ASD có nguyên nhân đa yếu tố phức tạp, nhưng các nghiên
cứu song sinh đã chứng minh được có sự đóng góp mạnh mẽ về mặt di truyền. Các nghiên
cứu về sự liên hệ giữa tỷ lệ tự kỷ với các anh chị em trong gia đình có trẻ tự kỷ cho thấy,
trong các trẻ sinh đôi cùng trứng, khi có một đứa trẻ bị tự kỷ thì nguy cơ mắc chứng tự kỷ
của đứa trẻ còn lại có thể lên tới 70-90%. Tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng
3
chỉ khoảng 30% và 3-19% ở anh chị em nói chung. Hơn nữa, tỷ lệ là gấp đôi giữa các
anh chị em cùng huyết thống so với các anh chị em cùng mẹ khác cha. Những kết quả
này đã cung cấp bằng chứng cho thấy yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng trong sự
phát triển của ASD. Từ đó, mở ra những nỗ lực lớn trong nghiên cứu để cố gắng làm
sáng tỏ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này [68].
Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD
Trong nhiều nghiên cứu, các rối loạn đơn gen đã được phát hiện xuất hiện đồng
thời với ASD. Một số được báo cáo phổ biến nhất là bệnh xơ cứng củ và hội chứng
Fragile X, ít gặp hơn là bệnh Phenylketon niệu và hội chứng Smith-Lemli-Opitz. Tỷ lệ
ASD gặp trong các rối loạn này cũng tăng lên nhưng khơng tìm thấy ở tất cả các cá thể
mang đột biến [25].
Nguyên nhân dẫn đến hội chứng Fragile X là sự mở rộng của bộ ba nucleotid
CGG lặp lại trong vùng 5’ chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation 1
(FMR1) [28]. Biết rằng hai trong bốn loại nucleotid là Adenin và Cytosin có thể bị
methyl hóa, do đó, sự mở rộng này dẫn đến sự siêu methyl hoá promoter của FMR1 và
đi kèm với đó là sự ức chế phiên mã [61]. Trong khi 1-3% trẻ em được chẩn đốn tự
kỷ có hội chứng Fragile X thì khoảng 18-33% số trẻ mắc hội chứng Fragile X có hành
vi tự kỷ [34].
Phức hợp xơ cứng củ - Tuberous Sclerosis Complex (TSC) là một chứng rối
loạn di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi các khối u lành tính trong
não và nhiều mơ, cơ quan khác, chứng động kinh và suy giảm nhận thức. TSC là do
đột biến gen TSC1 hoặc TSC2 mã hóa hamartin và tuberin tương ứng. Tỷ lệ hiện mắc
ASD ở TSC được ước tính nằm trong khoảng từ 36% đến 50% [61].
Nghiên cứu gen trong toàn bộ hệ gen
Các nhà khoa học đã phát hiện được nhiều gen liên quan đến hội chứng tự kỷ
khi nghiên cứu gen trong tồn bộ hệ gen và phân tích tồn bộ vùng mã hố. Chúng có
chức năng và đóng vai trị quan trọng trong nhiều quá trình như phiên mã và tái cấu
trúc sợi nhiễm sắc, tổng hợp và phân huỷ protein, cấu tạo và nâng đỡ bộ khung xương
tế bào và hình thành các synap thần kinh (Hình 1.3) [14, 25, 61, 68].
4
Hình 1.1: Các gen liên quan đến rối loạn phổ tự kỷ ở người (ASD) với các
chức năng sinh học khác nhau [61].
Các nghiên cứu di truyền gần đây đã xác định gen Neurobeachin (NBEA) là gen
đóng vai trị quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của ASD. Gen này bị phá vỡ ở bệnh
nhân mắc chứng tự kỷ vô căn [67]. Báo cáo ban đầu cho thấy đột biến chuyển đoạn
nhiễm sắc thể với điểm đứt gãy trên gen NBEA là nguyên nhân dẫn đến tự kỷ vô căn ở
trẻ nam [13, 62]. Kết quả một nghiên cứu năm 2009 còn cho biết đột biến mất đoạn
gen này cũng liên quan đến hội chứng tự kỷ [48]. NBEA mã hóa protein neo A-kinase
(AKAP) liên kết với tiểu đơn vị điều hòa của protein kinase A (PKA), được xác định là
protein đặc hiệu của tế bào thần kinh, có vai trị quan trọng trong q trình phát triển
não. Các nghiên cứu trên mơ hình động vật chỉ ra vai trị của NBEA trong nhiều quá
trình của tế bào như cấu tạo võng mạc, trao đổi và giải phóng các chất dẫn truyền thần
kinh qua màng tế bào, tham gia duy trì trí nhớ ngắn hạn [61, 62].
1.1.3.2. Yếu tố nguy cơ từ mơi trường
Các yếu tố mơi trường có thể đóng vai trị nhất định trong cơ chế bệnh sinh
ASD. Một số đánh giá hệ thống và phân tích tổng hợp đã mô tả các yếu tố nguy cơ
trước khi sinh và chu sinh, cũng như các yếu tố chế độ ăn uống và lối sống của bà mẹ.
Trong nhiều nghiên cứu, các nhà khoa học đã chỉ ra tuổi cha và tuổi mẹ cao có
liên quan độc lập tới nguy cơ mắc ASD. Điều này cũng làm tăng nguy cơ mắc ASD ở
đời con [19].
Các yếu tố trước khi sinh bao gồm tình trạng trao đổi chất của mẹ, tăng huyết áp,
tiểu đường thai kỳ, chảy máu khi mang thai hoặc tiền sử gia đình mắc bệnh tự miễn cũng
5
có liên quan đến nguy cơ mắc ASD và chậm phát triển kết hợp. Hơn nữa, nguy cơ gia tăng
cũng được tìm thấy đối với trẻ sinh ra đầu tiên so với trẻ sinh ra thứ ba trở lên [26].
Nhiễm trùng tử cung có liên quan đến sự gia tăng đáng kể nguy cơ mắc bệnh tự
kỷ. Mối liên hệ giữa nhiễm trùng của mẹ trong thời kỳ mang thai và sinh con với nguy
cơ tự kỷ cũng được củng cố bởi các kết quả trên mơ hình động vật. Nhiễm virus thai
kỳ kích hoạt phản ứng miễn dịch của mẹ, có thể gây ảnh hưởng tới sự phát triển não bộ
của thai nhi [30].
Một số phân tích gộp được đề cập gần đây cho thấy quá trình phơi nhiễm với
thuốc trong thời kỳ mang thai có thể làm tăng nguy cơ tự kỷ với trẻ được sinh ra
[26]. Phơi nhiễm trước khi sinh với Valproat đã được xác nhận là một trong những yếu
tố nguy cơ đối với ASD, đặc biệt là trong ba tháng đầu của thai kỳ [16]. Thai nhi tiếp
xúc với Valproat có nguy cơ mắc ASD cao gấp 8 lần [40]. Đối với thuốc chống trầm
cảm, bao gồm các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc, các nghiên cứu được
kiểm sốt tốt cho thấy khơng có rủi ro khơng rõ ràng [40], mặc dù có ý kiến cho rằng
việc tiếp xúc với thuốc chống trầm cảm khi mang thai làm tăng nhẹ nguy cơ mắc ASD,
đặc biệt là trong 3 tháng đầu.
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ
ASD có thể ảnh hướng tới sự phát triển sớm của não và tái tổ chức thần kinh. Hiện
nay, vẫn chưa có dấu ấn đặc hiệu để chẩn đốn ASD do vậy việc xác nhận chẩn đoán ASD
vẫn phải dựa trên đánh giá rối loạn hành vi được ghi trong cẩm nang thống kê và chẩn
đoán rối loạn tâm thần của Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ (DSM-5), được xuất bản năm 2013
[10]. Trẻ mắc hội chứng này thường biểu hiện sự suy giảm và bất thường
ở 3 khía cạnh hành vi chính là tương tác xã hội, khả năng giao tiếp và hành vi có tính
lặp lại. Trong đó, tiêu chuẩn chẩn đốn bao gồm việc xuất hiện của ít nhất 3 dấu hiệu
của sự giảm giao tiếp xã hội hoặc hai dấu hiệu của việc lặp đi lặp lại các hành vi có
phản ứng quá mức. Dấu hiệu của sự giảm tương tác xã hội và khả năng giao tiếp bao
gồm sự suy giảm rõ rệt các hành vi phi ngôn ngữ như ánh mắt, biểu cảm khuôn mặt
hay ngôn ngữ cơ thể. Các hành vi của trẻ có tính lặp đi lặp lại và dập khn. Trẻ không
hứng thú với việc giao tiếp và hoạt động xã hội. Trẻ tự kỷ cũng có những thiếu hụt
trong khả năng học tập và nhận thức, thiếu hụt ngôn ngữ, động kinh, bất thường vận
động, lo lắng và các vấn đề về đường tiêu hóa [45, 61] đi kèm với rối loạn giấc ngủ và
thay đổi nhịp sinh học [51]. Ngồi ra, DSM-5 nhận định rằng ASD có thể đi kèm với
các rối loạn khác, bao gồm các rối loạn di truyền (ví dụ, hội chứng Fragile X) và các
vấn đề về sức khoẻ tâm thần (ví dụ, rối loạn tăng động giảm chú ý - Attention deficit
hyperactivity disorder - ADHD) [40].
6
1.1.5. Các phương pháp điều trị rối loạn phổ tự kỷ
Hiện nay, bệnh nhân được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ có thể tiếp cận với hai
phương thức điều trị là: dùng thuốc hoặc không dùng thuốc:
Với hướng điều trị không dùng thuốc, các phương pháp can thiệp đã được phát
triển và nghiên cứu để điều chỉnh hành vi cho trẻ nhỏ. Những can thiệp này có thể làm
giảm các triệu chứng, cải thiện khả năng nhận thức, kỹ năng sống hàng ngày và tối đa
hóa khả năng hoạt động và tham gia vào cộng đồng của trẻ. Liệu pháp quản lý hành vi
được sử dụng để cố gắng củng cố các hành vi mong muốn và giảm các hành vi không
mong muốn. Trị liệu hành vi thường dựa trên phân tích hành vi ứng dụng (ABA) đã
được chấp nhận rộng rãi giữa các chuyên gia chăm sóc sức khỏe và được sử dụng
trong nhiều trường học và phòng khám điều trị. Sự tiến bộ của trẻ được theo dõi và đo
lường theo thời gian trị liệu thông qua các bảng kiểm tra hành vi và ngôn ngữ [71].
Với hướng điều trị bằng thuốc, hiện tại, chưa có loại thuốc nào có thể điều trị
triệt căn cho rối loạn phổ tự kỷ. Nhưng vẫn có một số loại thuốc đã được chứng minh
là có thể hỗ trợ điều trị một số triệu chứng liên quan đến ASD, đặc biệt là một số hành
vi nhất định. Risperidon và Aripiprazol thuộc nhóm thuốc chống loạn thần đã được xác
nhận là có thể cải thiện các triệu chứng khó chịu hoặc kích động ở trẻ em và thanh
thiếu niên mắc ASD. Phần lớn trẻ em sử dụng hai loại thuốc này được cải thiện về việc
cáu kỉnh và kích động, bao gồm gây hấn, tự gây thương tích và các hành vi gây rối
khác. Nhưng cả hai loại thuốc này cũng có thể gây ra tác dụng không mong muốn, bao
gồm an thần và tăng cân, làm tăng nguy cơ mắc các vấn đề sức khỏe sau này. Một vài
loại thuốc như Methylphenidat, Atomoxetin và Guanfacin thường được sử dụng để
điều trị rối loạn tăng động giảm chú ý (ADHD), cũng cho thấy lợi ích đối với các triệu
chứng ADHD ở khoảng 25% trẻ mắc ASD. Tuy nhiên, với mỗi loại thuốc này, khả
năng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn ở những người mắc ASD lại cao hơn so
với những người mắc ADHD nói chung [40].
Các chuyên gia cũng khuyến cáo việc sử dụng thuốc điều trị cho bệnh nhân
ASD cần thận trọng, nên ưu tiên cho các phương pháp điều trị có nguy cơ thấp hơn,
bao gồm các can thiệp về hành vi hoặc tâm lý xã hội [33].
1.1.6. Một số mơ hình nghiên cứu rối loạn phổ tự kỷ
Trong thập kỷ qua, các mơ hình động vật bao gồm các lồi linh trưởng, lồi
gặm nhấm (điển hình là chuột) và ruồi giấm đã góp phần khơng nhỏ trong việc nghiên
cứu để tìm hiểu đặc tính, chức năng của các gen liên quan đến ASD.
Tìm hiểu các mơ hình lồi gặm nhấm cho nghiên cứu ASD, nhìn chung có 2 loại
mơ hình chính là mơ hình di truyền và mơ hình khơng di truyền [61]. Các mơ hình di
7
truyền ASD gây ra ở chuột có thể được thiết lập bằng cách nhắm mục tiêu vào các gen
tương đồng của chuột với các gen có liên quan tới ASD ở người như FMR1, NBEA,...
Cụ thể, chuột đực bị loại bỏ gen FMR1 có biểu hiện thiếu tương tác xã hội, sự hiếu
động và suy giảm nhận thức. Những điều này là tương đồng với các triệu chứng tự kỷ
ở người. NBEA đơn bội có thể gây ra rối loạn chức năng nhận thức và kiểu hình giống
ASD, bao gồm những thiếu hụt trong hành vi xã hội, phản ứng sợ hãi có điều kiện, học
tập khơng gian và trí nhớ ở chuột [61].
Mặt khác, các mơ hình tự kỷ không di truyền trên chuột cũng được nhiều nhà khoa
học trên thế giới nghiên cứu. Các mơ hình này được gây ra do phơi nhiễm trước khi sinh
với các tác nhân hóa học như Axit Valproic (VPA), Thalidomid và Ethanol trong khi mang
thai, nhiễm virus hoặc viêm [61]. Trong số các yếu tố này, phơi nhiễm VPA, một loại
thuốc chống động kinh và ổn định tâm trạng dùng cho bệnh nhân khi mang thai có thể làm
tăng đáng kể tỷ lệ ASD ở con sinh ra [17, 44]. Nghiên cứu lâm sàng đã xác định các yếu tố
nguy cơ liên quan đến việc sử dụng VPA, bao gồm dị tật bẩm sinh, chậm phát triển, giảm
chức năng nhận thức và tự kỷ. Hội chứng tự kỷ do VPA gây ra có thể do khiếm khuyết
trong sự phát triển tế bào thần kinh của tiểu não, hệ limbic và thân não gây ra sự gián đoạn
trong kết nối synap giữa các tế bào thần kinh [61].
Bên cạnh đó, trong những năm gần đây, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên
cứu sử dụng ruồi giấm làm sinh vật mơ hình để mô phỏng chứng rối loạn tự kỷ ở
người với mục tiêu xác định được tác động của các yếu tố về gen, môi trường đến các
hành vi, biểu hiện, khả năng vận động, các thay đổi về nhịp sinh học của ruồi giấm.
Một số gen có liên quan và đã được sử dụng để gây mơ hình ruồi giấm tự kỷ trên thế
giới như: gen Rugose, dFMR… [61]. Việc tổng hợp nhiều dữ liệu nghiên cứu sử dụng
mơ hình ruồi giấm biến đổi gen cho hội chứng tự kỷ cũng góp phần xác định được vai
trị của các nhóm gen liên quan, làm sáng tỏ cơ chế phân tử của ASD.
1.2. Tổng quan về ruồi giấm
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển
Ruồi giấm có tên khoa học Drosophila melanogaster thuộc họ Drosophilidae, là
sinh vật được sử dụng trong lĩnh vực di truyền học từ đầu những năm 1900. Nó phân bố
ở tất cả các châu lục, bao gồm cả hầu hết các đảo. Hiện nay, ruồi giấm là sinh vật mơ
hình được sử dụng rộng rãi khơng chỉ trong di truyền học cổ điển và phân tử, mà cịn
với nhiều kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học mới, để nghiên cứu các vấn
đề đòi hỏi cách tiếp cận đa ngành, chẳng hạn như sinh học phát triển và sinh học thần
kinh [22, 54].
8
1.2.2. Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm
1.2.2.1. Đặc điểm bên ngồi của ruồi giấm
Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng. Con cái trưởng
thành có kích thước dài khoảng 2.5 mm, con đực nhỏ hơn với phần bụng sẫm màu. Dễ
dàng phân biệt được con đực và con cái nhờ sự khác nhau về màu sắc với mảng đen rõ
rệt ở bụng [42].
Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái [18].
1.2.2.2. Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 139.5 triệu cặp base gồm khoảng 17000 gen
phân bố trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp
nhiễm sắc thể giới tính trong khi ở người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể. Sự đơn giản này
là một trong những lý do tại sao chúng là một trong những sinh vật đầu tiên được sử
dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [7, 50].
1.2.2.3. Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm
Vòng đời của ruồi giấm trải qua 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng
thành. Một con ruồi cái có thể đẻ tới 2000 trứng trong suốt cuộc đời của nó. Trứng sau khi
thụ tinh sẽ phát triển thành phơi trong vịng 18-24h. Phơi này, sau đó, lột xác 2 lần qua ba
giai đoạn ấu trùng khác nhau trước khi hố nhộng và trải qua q trình biến thái, cuối
cùng, trở thành ruồi giấm trưởng thành. Ở 25°C, sự phát triển để thành một con ruồi
trưởng thành chỉ mất khoảng 10 ngày kể từ khi xảy ra hiện tượng thụ tinh. Tuổi thọ trung
bình của ruồi giấm trưởng thành khi là khoảng 60-70 ngày [22, 29, 50].
9
Hình 1.3: Chu kỳ vịng đời của ruồi giấm [22].
1.2.3. Mơ hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ
Năm 2015, tác giả Wise và cộng sự đã nghiên cứu và xác định được mối liên quan
giữa đột biến gen Rugose (một gen tương đồng với gen NBEA ở người) với biểu hiện của
rối loạn tự kỷ trên mơ hình ruồi giấm [67]. Nghiên cứu khác cũng cho thấy các đột biến
mất chức năng của gen Rugose thể hiện cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng và khiếm
khuyết trong các tương tác xã hội và suy giảm vận động ở ruồi trưởng thành
[67]. Những phát hiện này chỉ ra rằng đột biến gen Rugose biểu hiện các đặc điểm kiểu
hình tương tự như ASD ở con người. Do đó, sử dụng ruồi giấm đột biến gen Rugose có
thể là một mơ hình phù hợp để nghiên cứu ASD, đồng thời qua đó, chúng ta có thể
hiểu biết rõ ràng hơn về vai trò của gen NBEA trong rối loạn phổ tự kỷ ở người.
Với những ưu điểm của mình, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã được
đưa vào sử dụng trong lĩnh vực di truyền học rất sớm từ những năm đầu thế kỉ XX:
Các nhà khoa học đã giải trình tự tồn bộ hệ gen của ruồi giấm và phát
hiện có khoảng 60% gen tương đồng với bộ gen của người, khoảng 75% các gen bệnh
ở người đã biết có sự trùng khớp dễ nhận biết trong bộ gen của ruồi giấm [7, 9].
So với các thử nghiệm trên động vật khác như chuột, khỉ,…, sử dụng
ruồi giấm trong nghiên cứu ít vấp phải các vấn đề liên quan đến đạo đức trong nghiên
cứu y sinh học hơn.
Ruồi giấm phát triển nhanh (khoảng 10 ngày để thành ruồi trưởng
thành), đẻ trứng nhiều (có thể tới 100 trứng/ngày) nên cho phép có thể tạo ra lượng lớn
ruồi trong một thời gian ngắn, nghiên cứu nhiều thế hệ trong vịng vài tuần [7, 29].
Ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tiết kiệm chi phí ngun vật liệu và
khơng gian khi làm thí nghiệm.
Điều kiện sống đơn giản giúp dễ dàng tạo quần thể lớn ruồi, là tiềm năng
trong sàng lọc dược chất và thuốc.
10
Dễ dàng và an toàn khi gây mê ruồi giấm. Hơn nữa, hình thái ruồi cũng
rất dễ nhận biết khi được gây mê.
- Trong khi con người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể, D.melanogaster
chỉ có
4. Sự đơn giản này là một trong những lý do khiến ruồi giấm thuộc những sinh vật đầu
tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [29].
Sử dụng ruồi giấm làm đối tượng nghiên cứu, T.H. Morgan – cha đẻ của mơ
hình này đã phát hiện ra quy luật di truyền liên kết gen và liên kết giới tính, từ đó, đặt
nền móng cho di truyền học hiện đại. Đến ngày nay, đã có rất nhiều cơng trình nghiên
cứu sử dụng ruồi giấm để xây dựng mơ hình nghiên cứu bệnh trên người. Trong đó, có
các bệnh thối hóa thần kinh, ví dụ các mơ hình ruồi giấm chuyển gen mã hóa các
protein gây bệnh Alzhermer như β- amyloid, Tau, … [60].
Với nhiều ưu điểm đã được ghi nhận, kết hợp yếu tố dễ quan sát và định lượng,
chúng tôi quyết định sử dụng mơ hình ruồi giấm chuyển gen Rugose để nghiên cứu tác
dụng sinh học và đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của cao chiết cồn TTRC.
Mặc dù, có nhiều lợi thế cho việc sử dụng D. melanogaster để nghiên cứu các
bệnh ở người, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm :
- Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi.
- Tác dụng thuốc có khác biệt đáng kể khi so sánh với các nghiên cứu ở
người.
Tóm lại, việc sử dụng D. melanogaster làm sinh vật mẫu rất tốt vì nhiều lý do,
nhưng chúng cũng có những nhược điểm chưa thể khắc phục. Thế nhưng, mô hình sử
dụng ruồi giấm đột biến gen mang hội chứng tự kỷ này vẫn rất quan trọng khi cung
cấp được những bằng chứng khoa học làm tiền đề tiếp tục đánh giá tác dụng điều trị tự
kỷ của các dược liệu Việt Nam trên mơ hình động vật thực nghiệm trong thời gian tới.
1.3. Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa
1.3.1. Tên gọi – vị trí phân loại
-
Thạch tùng răng cưa (cây Thơng đất) có tên khoa học:
Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.
-
Tên tương tự: Lycopodium Serrata (Thunb.) Trevis.
Vị trí phân loại của lồi Huperzia serrata trong hệ thống phân loại
thực vật: Ngành: Thạch tùng (Lycopodiophyta);
Lớp: Thạch tùng (Lycopodiopsida);
Bộ: Thạch tùng (Lycopodiales);
11
Họ: Thơng đất (Lycopodiaceae) [69] hoặc Huperziaceae [21];
Chi: Huperzia;
Lồi: H. Serrata.
1.3.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng
Cây thân đứng, mọc ở đất cao từ 10-40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1-2 lần
hình trụ, đường kính khoảng 2mm. Lá hình bầu dục đầu nhọn, dài 15 mm, rộng 3 mm;
phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa. Túi bào tử ở nách lá,
hình thận, màu vàng tươi [5].
Hình 1.4: Cây Thạch tùng răng cưa [3].
1:
Ảnh chụp tại thực địa; 2: Phần ngọn của cây; 3: Lá;
4: Túi bào tử mọc ở nách lá; 5,6: Túi bào tử đã mở; 7: Túi bào tử hình
thận.
Cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt
đá, đất mùn ở dưới tán rừng quanh năm ẩm ướt, độ mùn cao, ở độ cao 1000m so với
mặt nước biển. Loài thực vật này được biết nhiều ở Trung Quốc dưới tên gọi là Qian
Ceng Ta, trong các bài thuốc chữa bệnh như: cầm máu, lợi tiểu… Còn ở các nước
phương Tây, đặc biệt là Hoa Kỳ, Thạch tùng răng cưa được sử dụng như thức ăn bổ
trợ, bán rộng rãi trên thị trường. Loại cây này hiện nay cịn được nghiên cứu nhiều với
tác dụng tăng cường trí nhớ và điều trị bệnh Alzheimer . Ở Việt Nam, cây Thạch tùng
răng cưa được tìm thấy nhiều ở Sapa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng) [6].
Bộ phận dùng là phần thân cây trên mặt đất, có thể dùng tươi hoặc sấy khô để
bảo quản lâu dài [69].
12
1.3.3. Thành phần hoá học và tác dụng sinh học
Một số thành phần hố học có tác dụng dược lý trong Thạch tùng răng cưa gồm
alkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles, và những acid Phenoliques. Trên thế giới có
rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách chiết được các thành phần hoạt tính này.
Nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc phân lập được 2 alkaloid là Huperzin A và
Huperzin B. Các nghiên cứu tiếp theo phân lập được các alkaloid: Huperzin E và F,
Huperzin G, Huperzin I, Huperzin J, Huperzin K và Huperzin L, Huperzin R, Huperzin
P, Huperzin Q và N-oxyhuperzin Q, Huperzin S, T và U, Huperzin O, Huperzin W,
Huperzin B [21].
Chang-Heng Tan và cộng sự đã phân lập được 9 alkaloid: Huperzin P,
Fawcettimin và Phlegmariunin B. Huperzin Q. N-oxyhuperzin Q serratadin, 6fhydroxycerratadin, 4f-hydroxyserratadin và 4f,6f-dihydroxycerratidin, Phlegmariurin
B, 2f- hydroxyphlegmariurin B, 2-oxyphlegmariuni B và 11-oxophlegmariurin [58].
Nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản đã phân lập được 17 alkaloid: LycoposerraminC, -D, -E, -P, -Q, -S, -U. Lycoposerramin-G, -H, -I, -J, -K, -M, -N, -O [57].
Kazuaki Katakawa và cộng sự phân lập được 8 alkaloid: Lycothunin, Serratin,
Serratanidin,
11alpha-hydrofawcettidin,
8alpha-11alpha-dihydroxyfawcettidin,
2alpha,11alpha-dihydroxy-fawcettidin,
2beta-hydroxylycothunin,
8alpha-
hydroxylycothunin. Sau đó nhóm tiếp tục phân lập được 7 alkaloid khác từ cây gồm
Lycoposerramin-R, -T, dẫn chất N-methyl và N-formyl của Lycoposerramin-T, -Ndimethyl-beta-obscurin, lycodin và fawcettimin [36].
Trong nhóm các alkaloid, thành phần hố học có tác dụng lên hoạt động của hệ
thần kinh, tác dụng hướng thần hoặc chống lại chứng mất trí nhớ là Huperzin A [6].
Huperzin A có tên khoa học là (1R,9S,13E)-1-amino-13-ethylidene-11-methyl-6azatricyclo[7.3.1.02,7]trideca-2(7),3,10-trien-5-one. Huperzin A được tìm thấy trong
phần chiết ra của loài Thạch tùng răng cưa là một alkaloid có khả năng ức chế mạnh
enzym Acetylcholinesterase (AChE) nên sự có mặt của Huperzin A làm giảm lượng
enzym AChE có trong não. Nhờ đó, hàm lượng Acetylcholin tăng lên làm cải thiện trí
nhớ cho bệnh nhân. Một số báo cáo lâm sàng cũng nhận định Huperzin A tạo điều kiện
dẫn truyền thần kinh cholinergic bằng cách tăng nồng độ Acetylcholin trong hệ thần
kinh trung ương có tác dụng bảo vệ hệ thần kinh [6, 21].
Bên cạnh đó, một vài nghiên cứu cũng cho thấy Huperzin A có vai trị như một
chất bảo vệ thần kinh. Nó hoạt động như một chất chống oxy hóa và tăng cường hoạt động
của các enzym chống oxy hóa não khác, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do trong tế bào
não và tăng tuổi thọ của tế bào não. Điều này có liên quan đến khả năng điều
13
chỉnh biểu hiện của apoptotic protein, hỗ trợ ty thể tế bào não – trung tâm năng lượng
chính mỗi tế, bảo vệ não khỏi độc tính của glutamat bằng cách hoạt động như một chất
đối kháng thụ thể NMDA và điều chỉnh chuyển hoá protein tiền thân beta-amyloid
(beta-amyloid ảnh hưởng đến mức ATP trong ty thể và làm rối loạn các chức năng có
thể dẫn đến các bệnh như Alzheimer) [21].
Ngoài ra, khả năng chống viêm của Huperzin A cũng được đề cập trong nhiều
nghiên cứu. Nó được báo cáo là có hoạt tính chống viêm như các chất ức chế AchE
khác, đồng thời, cũng có khả năng ngăn chặn một số phản ứng viêm như tăng sinh tế
bào T và sản xuất cytokin [21].
Tuy nhiên, trên thế giới, Huperzin A chưa có nhiều nghiên cứu trên mơ hình
ruồi giấm, mà chủ yếu được nghiên cứu trên chuột. Và kết quả cho thấy Huperzin A
cịn có các tác dụng khác như chống ung thư, chống co giật …[21]. Điều đó có nghĩa
khi thử nghiệm trên ruồi giấm cũng có thể cho kết quả tương tự.
14
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Dược liệu nghiên cứu
Cao chiết cồn 90% từ toàn cây TTRC (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis .) với
hiệu suất chiết 5.18%.
Nguồn gốc: TTRC do khoa Tài Nguyên - Viện Dược liệu thu hái, sau đó được
khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu tách chiết tổng hợp và cung cấp. Mẫu nghiên cứu
được lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản - Khoa Tài Nguyên, Viện Dược Liệu.
2.2. Đối tượng nghiên cứu
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) trong các giai đoạn của chu kỳ phát triển
do giáo sư Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản
cung cấp với 2 chủng:
Canton-S (FBst0064349): chủng ruồi giấm hoang dại được sử dụng làm nhóm
chứng sinh lý.
Rugose (FBst0009801-CG44835): chủng ruồi giấm chuyển gen rugose mang hội
chứng tự kỷ.
Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản với điều kiện phịng thí
nghiệm ở nhiệt độ 25±1oC, chu kỳ sáng tối 12/12 (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ). Các thí
nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ.
2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
2.3.1. Hóa chất
STT
Tên hóa chất
1
Acid propionic
2
Agar
3
Ether
4
Nấm men
5
Natri benzoat
6
Nước cất
7
Nước RO
8
Sữa bột nguyên kem
9
Sucrose
Một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phịng
15
2.3.2. Dụng cụ, thiết bị
STT
Dụng cụ, thiết bị
1
Buồng tam giác và kính
2
Bút lơng để thu ấu trùng
3
Chai, ống, bơ-can thủy tinh để đựng
ăn, ni ấu trùng
4
Chày cối
5
Cân phân tích
6
Đĩa petri 9cm và 15cm, nắp đục lỗ
7
Đồng hồ bấm giờ
8
Kính hiển vi huỳnh quang Olympus
9
Lị vi sóng
10
Máy quay phim
11
Micropipet
12
Miếng lót mềm
13
Ống Eppendorf
14
Hệ thống theo dõi nhịp sinh học trê
giấm
15
Một số dụng cụ, thiết bị khác
2.4. Thiết kế thí nghiệm
2.4.1. Căn cứ để chọn lựa mức liều 2mg/ml và 4mg/ml
Chúng tôi đã tiến hành dò liều trên một dải nồng độ từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml.
Dựa vào khả năng sống sót và mơ hình tương tác cộng đồng của ruồi trưởng thành với
từng nồng độ trên dải, chúng tôi nhận thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là phù hợp để
đưa vào nghiên cứu chính thức.
2.4.2. Nhân dịng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai với tỷ lệ đực cái 1:1 các cặp bố mẹ chủng Rugose để tạo dòng ruồi
tự kỷ và chủng Canton-S để tạo dòng ruồi đối chứng sinh lý. Chủng ruồi lai tạo được
chia thành các nhóm như sau:
Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và ni trong
mơi trường thức ăn cơ bản.
Nhóm mang hội chứng tự kỷ: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và
nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản.
16
Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng
đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm. Tất cả ruồi mang gen nghiên cứu đều được nuôi
ở điều kiện nhiệt độ 25±1oC, chu kỳ sáng tối 12/12 (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ). Các thí
nghiệm hành vi được thực hiện trong thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ. Các chủng ruồi sau
khi lai tạo được kiểm tra ngẫu nhiên kiểu gen và đột biến gen tại Bộ môn Y Sinh học di
truyền, Trường Đại học Y Hà Nội để đảm bảo chủng ruồi dùng triển khai mơ hình là
chính xác.
Thành phần thức ăn (cho 500 ml)
Thành phần
Đường
Nấm men
Sữa bột
Agar
Acid Propionic
Acid Benzoic 20%
hoặc Natri Benzoate
20%
Quy trình chuẩn bị thức ăn
- Cân Natri Benzoate vào ống falcon, thêm nước, dùng máy vortex hoà tan
đến khi dung dịch đồng nhất.
- Cân sữa bột vào cốc thuỷ tinh, hồ thêm một ít nước nguội và đánh đều, tạo
dạng kem.
- Cân Agar vào trong bát sắt, bổ sung ~200 ml H2O, đun nóng đến khi dung
dịch trong.
- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt, thêm ~100 ml H2O, đun sủi
lăn tăn trong 10 phút.
- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít, để nguội về 60 oC, phối hợp sữa vào,
khuấy đều. Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml, khuấy đều.
- Bổ sung Acid Propionic và Natri Benzoate, tiếp tục khuấy đều.
- Chia vào ống nuôi ~5 ml. Bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng (dùng tối đa
trong 1 tháng).
17
