Tài liệu GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC - phần 1 docx

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1. Khái niệm về Công nghệ Sinh học (CNSH)
Công nghệ Sinh học (Biotechnology) là một thuật ngữ xuất hiện cách đây khoảng
25 năm sau khi có khi có những thành tựu của công nghệ gen (kỹ thuật tái tổ hợp DNA).
Có nhiều định nghĩa khác nhau về CNSH, tuy nhiên định nghĩa theo Liên đoàn Công
nghệ Châu âu được nhiều người chấp nhận nhất:
Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp có sự tham
gia của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các
thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất
của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người.
Như vậy CNSH không phải là một môn khoa học như hoá, lý, sinh học, hay sinh
học phân tử, … mà là một phạm trù sản xuất (công nghệ). Tác nhân sinh học ở mức độ cơ
thể như động vật, thực vật, ở mức độ tế bào như tế bào vi sinh vật và ở mức độ dưới tế
bào như gen, enzyme.
Công nghệ sinh học có tính chất liên ngành, nó ứng dụng những thành tựu của
nhiều ngành khoa học vào sản xuất như di truyền học, hoá sinh học, sinh lý học, vi sinh
vật học, hoá học, tin học, cơ khí, …
Từ định nghĩa trên cho thấy công nghệ gen không phải là CNSH mà nó chỉ là
một thành phần chủ chốt, là cơ sở, là động lực để thúc đẩy sự phát triển cực kỳ nhanh
chóng của công nghệ sinh học.
1.2. Phân loại công nghệ sinh học
Tuỳ theo cách nhìn khác nhau mà công nghệ sinh học được phân loại theo các kiểu
khác nhau. Xét về tác nhân sinh học tham gia vào quá trình CNSH có thể chia thành
các nhóm sau:
- CNSH động vật (Animal Biotechnology)
- CNSH thực vật ( Plant Biotechnology)
- CNSH vi sinh vật (Microbial Biotechnology)
- CNSH enzyme hay CN enzyme (Enzyme Biotechnology)
Ngoài ra còn có các khái niệm khác như CN protein (Protein Engineering), CN
gen (Gene Engineering). CN gen và CN protein luôn luôn xuyên suốt và là công nghệ
chìa khoá nằm trong CN thực vật, CN động vật và CN vi sinh vật.

Dựa trên đối tượng phục vụ người ta cũng có thể chia CNSH thành:
- CNSH nông nghiệp
- CNSH y tế
- CNSH môi trường
- CNSH năng lượng
1
- CNSH vật liệu
- CNSH chế biến thực phẩm
- CNSH hoá học…
Cách đây trên 8000 năm con người đã biết sử dụng vi sinh vật trong sản xuất bia,
phomat, yoghurt, dấm. Do đó một số tác giả lại cho rằng CNSH đã được con người sử
dụng từ rất lâu. Vì vậy CNSH có thể chia thành hai nhóm:
- CNSH cổ điển (Ancient Biotechnology)
- CNSH hiện đại (Mordern Biotechnology)
Trong bài giảng này sẽ được trình bày theo cách phân loại CNSH theo đối tượng
phục vụ.
1.3. Lịch sử phát triển của CNSH
Điểm lại lịch sử cho thấy tổ tiên chúng ta cũng đã biết sử dụng các qui trình
CNSH trong thực tiễn cuộc sống của mình như làm bánh mì, nấu rượu bia, làm phomat...
Tuy nhiên họ không hiểu bản chất của các quá trình công nghệ ấy mà hành động theo
kinh nghiệm và cảm tính.
Đến cuối thế kỷ 19, Pasteure đã chỉ ra rằng vi sinh vật đóng vai trò quyết định
trong các quá trình lên men . Kết quả nghiên cứu của Pasteure là cơ sở cho sự phát triển
của ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, butanol,
isobutanol... vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20.
Dần dần các quá trình lên men sản xuất dung môi hữu cơ được thay thế bằng
ngành công nghiệp sản xuất hoá chất từ dầu mỏ. Cũng trong giai đoạn này đã có những
xu hướng cải tiến công nghệ lên men truyền thống. Ví dụ: trong công nghệ lên men
ethanol nếu bổ sung vào môi trường lên men bisulphite (HSO
3

-
) thì quá trình tích luỹ sẽ
theo hướng tạo glycerol thay vì hướng tích luỹ ethanol. Glycerol rất cần để chế tạo thuốc
nổ.
Giai đoạn phát triển quan trọng thứ hai là quá trình phát triển của CNSH sản xuất
thuốc kháng sinh penicilin. Năm 1928 Alexander Fleming đã phát hiện được khả năng
kháng khuẩn của nấm mốc Penicillum notatum. Tuy nhiên đến năm 1940 sản xuất
penicillin được sản xuất trên qui mô lớn. Thuốc kháng sinh penicillin đã cứu hàng triệu
thương binh trong thế chiến thứ hai. Trong thời kỳ này có một số cải tiến kỹ thuật và thiết
bị lên men vô trùng cho phép làm tăng đáng kể năng suất lên men. Ngày nay ngành công
nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh có doanh thu trên 16 tỷ USD (1994).
2
Sau thế chiến thứ hai, là giai đoạn hoàn thiện các qui trình CNSH truyền thống,
như tối ưu hoá quá trình lên men, chọn lọc và tạo ra các chủng vi sinh vật đột biến siêu
tổng hợp, làm tăng năng suất lên men. Song song với những kết quả này các nghiên cứu
sinh học phân tử, hoá sinh học có bước phát triển nhảy vọt làm cơ sở cho sự hình thành
và phát triển cực kỳ nhanh chóng của CNSH hiện đại. Đầu tiên phải kể đến công trình
của Watson và Crick về mô hình xoắn kép DNA (1953). Sau đó là sự phát hiện hàng loạt
các cấu trúc bậc I của các phân tử protein như insulin của Sanger (1955). Sự phát hiện
của restriction enzyme vào năm 1968 là công cụ quan trọng của kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Năm 1972 đánh dấu một mốc quan trọng của CNSH khi Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) đã
tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp trong in vitro. Từ thành công này mở đầu cho sự phát triển
như vũ bão của công nghệ gen, một cuộc cách mạng thực sự đối với sự phát triển sinh
học và là động lực thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của CNSH, ngành công nghệ của thế
kỷ 21.
1.4. Triển vọng phát triển của CNSH ở thế kỷ 21
Như nhiều nhận định của các nhà khoa học và kinh tế thì thế kỷ 21 sẽ là kỷ
nguyên của CNSH và công nghệ thông tin. Một điều lý thú là hai nghành công nghệ mũi
nhọn của thế kỷ 21 này có mối quan hệ chặt chẽ, tương hỗ cùng thúc đẩy nhau phát triển
không ngừng. Ví dụ: máy tính giúp các nhà sinh học xây dựng nhanh chóng mô hình

phân tử protein, enzyme, thuốc, tìm ra mô hình ưu việt nhất như cho hoạt tính sinh học
cao hơn, chịu nhiệt tốt hơn bằng cách tạo ra cầu nối –S-S-. Máy tính giúp các nhà sinh
học thực hiện nhanh hơn chương trình giải mã bộ gen. Ngược lại CNSH ngày nay đang
mở ra một tiềm năng to lớn cho công nghệ máy tính. Đó là các dự án triển vọng sản suất
các chip sinh học (bọ điện tử). Đó là việc phát hiện ra phân tử protein Bacteriorhodopsine
của vi khuẩn Halobacterium hấp thụ ánh sáng và dẫn đến biến đổi cấu trúc nội tại giống
như lý thuyết nhị phân (có, không) cơ bản của máy tính. Chip sinh học có khả năng lưu
trữ thông tin rất lớn 1 bit/1nm
3
so với 1bit/10
12
nm của máy tính hiện nay. Số lượng bài
toán giải được trong 1s là 10
20
so với 10
12
của máy tính nhanh nhất. Ngoài ra chip sinh
học ít tiêu tốn năng lượng.
Triển vọng tiếp theo của CNSH phải kể đến các chương trình giải mã bộ gen của
người, vi sinh vật, thực vật (GENOMICS). Đáng chú ý nhất là chương trình giải mã bộ
gen người với 3 tỷ nucleotide, chứa hơn 100.000 gen hiện nay đã có những bước tiến
đáng kể và dự tính là đến năm 2010 sẽ giải mã và xác định chức năng của tất cả các gen.
Thành tựu này có ý nghĩa quan trọng trong liệu pháp gen, chữa trị tận gốc các bệnh di
truyền, bệnh ung thư, AIDS và nhiều bệnh khác. Công việc này cũng tiến hành tương tự
với vi sinh vật, thực động vật và sẽ là một trong những thành tựu vĩ đại nhất của con
người trong tìm hiểu sinh giới.
Các triển vọng khác trong nông nghiệp là các động vật chuyển gen (transgenic
animal), thực vật chuyển gen (transgenic plant), tiếp tục được phát triển và nhân rộng.
Đưa các gen kháng thuốc diệt cỏ, các gen tổng hợp thuốc trừ sâu sinh học, gen tạo nốt
sần cố định nito, gen cho năng suất cao, chất lượng tốt, dễ bảo quản cho cây trồng. Đối

với vật nuôi chuyển gen kháng bệnh, tăng chất lượng thịt, tạo dòng vô tính (như cừu
Dolly) để sản xuất ra hàng loạt vật nuôi cho năng suất và chất lượng thịt tốt. Ngoài ra đưa
các gen mã hoá cho hocmon, vaccin, thuốc vào trong thực vật, tuyến sữa của vật nuôi để
con người phòng và chữa bệnh bằng cách ăn chuối hoặc uống sữa.
3
Tài nguyên sinh học và môi trường cũng là một lãnh vực hứa hẹn những phát
triển và ứng dụng của CNSH trong thế kỷ 21. Chúng ta tin tưởng rằng CNSH thế kỷ 21 sẽ
giúp con người phát triển bền vững hơn nữa tài nguyên và môi trường sống của mình.
4
CHƯƠNG II: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNA
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA technology) thường được gọi là kỹ
thuật di truyền ra đời trên cơ sở hàng loạt những thành tựu của sinh học phân tử, hoá sinh
học, vi sinh vật học, di truyền học, … Kỹ thuật tái tổ hợp DNA bao gồm một tập hợp các
kỹ thuật tách, cắt, nối ghép, chuyển và biểu hiện gen như mong muốn.
Sự ra đời của kỹ thuật tái tổ hợp DNA bắt đầu từ những năm 1972-1973 khi nhóm
nghiên cứu của Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) lần đầu tiên tạo được một phân từ DNA tái tổ
hợp từ ba nguồn vật liệu khác nhau là bộ gen của virus SV 40 gây bệnh ung thư ở khỉ,
một phần của bộ gen phage λ và các gen của operon lactose của vi khuẩn E. coli. Đến
năm 1977 có thể coi là một mốc lịch sử của kỹ thuật tái tổ hợp DNA với thành tựu của
Boyer tạo ra hoc môn của não Somatostatin từ E. coli được chuyển gen. Sau đó một năm
cũng Boyer tạo ra insulin (hoc môn tuyến tuỵ) từ E. coli.
Có hai phát hiện quan trọng là công cụ cơ bản của kỹ thuật di truyền là sự phát
hiện restriction enzyme và vector plasmid.
2.1. Các enzyme rectriction endonuclease
Năm 1962 Arber lần đầu tiên đã chứng minh rằng vi khuẩn có những enzyme
đặc biệt có khả năng phân biệt được DNA của mình và DNA lạ. Các enzyme này có khả
năng hạn chế (rectriction) sự phát triển của các phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách
phân huỷ DNA của phage một cách đặc hiệu, do đó các enzyme này được gọi là enzyme
cắt hạn chế (restriction enzyme). Các restriction enzyme có vai trò rất quan trọng trong kỹ
thuật tái tổ hợp DNA.

Các restriction enzyme là một endonuclease nghĩa là chúng cắt liên kết phospho
diester của phân tử DNA ở những điểm đặc hiệu nằm trong chuỗi DNA. Các restriction
enzyme chia làm ba nhóm, nhưng nhóm II là nhóm thường được sử dụng trong kỹ thuật
tái tổ hợp DNA. Các restriction enzyme nhóm II nhận biết DNA mạch kép ở những trình
tự nhận biết và cắt ngay điểm nhận biết hoặc kế cận. Các trình tự nhận biết (recognition
sequences) thường có 4 – 6 cặp nucleotide, đôi khi tới 8 cặp nucleotide. Những trình tự
nhận biết đối xứng đảo ngược nhau gọi là palindrom.
Mỗi một restriction enzyme có trình nhận biết đặc trưng. Nếu vị trí cắt của
restriction enzyme ở giữa trình tự nhận biết thì tạo nên chuỗi DNA đầu bằng (blunt
ends) . Ví dụ:
- Enzyme Hae III (Từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium) có trình tự:
Nếu vị trí cắt nằm cạnh trình tự nhận biết thì tạo ra đầu lệch, còn gọi là đầu dính
(cohesive ends). Khi tạo thành đầu dính vì các base bổ sung nhau nên phân tử DNA dễ
gắn lại với nhau như lúc chưa bị cắt . Ví dụ:
5
---G G C C---- Hae III ----G G C C----
---C C G G---- ----C C G G----
Trình tự nhận biết Đầu bằng
- Enzyme EcoR I ( Từ vi khuẩn E.coli):
- Enzyme Bam HI (Từ Vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens)
Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 500 restriction enzyme với trên
120 trình tự nhận biết khác nhau.
2.2. Thu nhận gen
Ngay từ năm 1969 Becwitt và Shapiro đã phân lập được gen từ operon lactose của
E.coli bằng các phương pháp vật lý và di truyền vi sinh cổ điển. Ngày nay nguồn gen
được thu nhận bằng ba phương pháp:
2.2.1. Tách thu nhận gen từ bộ gen
Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của kỹ thuật tái tổ hợp
DNA. Toàn bộ bộ gen của sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn 15.000 – 20.000

cặp base bằng phương pháp cơ học hoặc bằng restriction enzyme. Sau đó các đoạn
DNA này được gắn vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp. Đây là phương pháp mang tính
chất ngẫu nhiên, mò mẫm vì bộ gen của sinh vật chứa rất nhiều gen nên rất khó phân
lập được gen cần thiết một cách chính xác (Ví dụ: ở người có trên 100.000 gen). Tuy
nhiên phương pháp này hiện nay vẫn sử dụng để thành lập ngân hàng gen của các
sinh vật (bank of genomic DNA).
2.2.2. Tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học
Năm 1969 nhóm của Khorana đã tổng hợp nhân tạo được gen đầu tiên là gen mã hoá
tổng hợp tRNA của alanin của nấm men. Gen này có chiều dài 77 cặp nucleotide,
nhưng do không có trình tự điều hoà nên không hoạt động.
Để tổng hợp nhân tạo gen bằng phương pháp hoá học cần biết được trình tự
nucleotide của gen. Trình tự nucleotide của gen được xác định phương pháp nghiên
cứu trình tự axit amin của protein mà gen mã hoá hoặc bằng các phương pháp xác
định trình tự nucleotide.
Lần đầu tiên vào năm 1977, Itakura và Boyer đã tổng hợp thành công gen mã hoá
cho hoc mon somatostatin của động vật có vú, và gen này đã biểu hiện trong tế bào
E. coli. Sau thành công này nhiều gen đã được tổng hợp nhân tạo như gen mã hoá
cho protein như gen tổng hợp hoc mon tăng trưởng của người somatotropin, hoc mon
trị tiểu đường insulin.
2.2.3. Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng
6
----G A A T T C---- EcoR I ----G A A T T C----
----C T T A A G---- ----C T T A A G----
Trình tự nhận biết của EcoR I Đầu dính .
----G G A T C C---- Bam HI ----G G A T C C----
----C C T A G G---- ----C C T A G G----
Trình tự nhận biết của Bam HI Đầu dính
Đây là phương pháp mà ngày nay kỹ thuật tái tổ hợp DNA sử dụng rộng rãi. Phương
pháp này dựa vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược là
reverse transcriptase. Đây là enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp nên DNA một

mạch từ khuôn mRNA. DNA tổng hợp từ mRNA gọi là c-DNA (complementary
DNA). Từ c-DNA mạch đơn sẽ tổng hợp thành c-DNA mạch kép nhờ enzyme DNA
polymerase và nuclease S1 (hình 2.1).
Hình 2.1: Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Ơ Eukaryote quá trình phiên mã xảy ra khá phức tạp. Sau khi mRNA được tổng
hợp từ gen (tiền mRNA) thì mRNA phải trải qua giai đoạn trưởng thành (splicing) cắt bỏ
những đoạn intron và nối các đoạn exon lại và ra tế bào chất để tổng hợp protein. Như
vậy nếu tách được m RNA trưởng thành để tổng hợp cDNA thì gen sẽ mã hoá một cách
chính xác cho protein.
Để tách mRNA người ta dựa vào tính chất của mRNA có gắn đuôi poly A nên rất dễ
tách nó ra khỏi hỗn hợp RNA bằng cách cho hỗn hợp chảy qua cốt có gắn poly T.
Ngoài ra cơ thể động vật có nhiều tế bào chuyên hoá như tế bào tuỷ xương tổng hợp
hồng huyết cầu do đó trong tế bào này rất giàu mRNA của globin, hoặc tuyến tơ của
tằm chứa nhiều mRNA mã hoá tổng hợp fibroin do đó rất dễ tách mRNA.
Bằng phương pháp này người ta đã tổng hợp được gen globin của người, động vật,
chim, gen mã hoá ovalbumin trứng, fibroin tơ tằm, inteferon của người…
2.3. Các vector chuyển gen
Để chuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác có thể thực hiện biến nạp bằng
DNA hoặc bơm thẳng DNA vào tế bào. Tuy nhiên bằng cách đơn giản này hiệu quả
thấp vì phần lớn DNA lạ xâm nhập vào tế bào sẽ bị phân huỷ, DNA không tái tổ hợp
thì không thể tự sao chép thành nhiều bản, do đó nó sẽ mất dần.
7