Tài liệu Tinh sạch protein ( xác định kl và siêu ly tam protein) pptx

Tinh sạch protein
( xác định kl và siêu ly tam protein)



VI. Xác định khối lượng của
protein
Phép ghi phổ khối lượng là một kỹ
thuật dùng để phân tích trong hóa học
hữu cơ trong nhiều năm. Tuy nhiên,
cho đến gần đây, khả năng bay hơi
quá thấp của protein đã làm mất tác
dụng của phép ghi phổ khối lượng
trong việc nghiên cứu các phân tử
này. Khó khăn này đã được khắc phục
khi có những kỹ thuật chuyển protein
và những đại phân tử khác thành dạng
khí được đưa vào ứng dụng là matrix-
assisted laser desorption-ionization
(MALDI) và electrospray
spectrometry. Ở đây tập trung vào kỹ
thuật MALDI. Trong kỹ thuật này,
những ion protein được phóng ra và
sau đó được tăng tốc qua một điện
trường. Những ion này sẽ di chuyển
qua một đường ống dài được hút chân
không (flight tube), ion nhỏ nhất sẽ di
chuyển nhanh nhất và đến đầu đọc
trước nhất. Vì vậy, dựa vào thời gian
bay (time of flight - TOF) trong điện

trường ta có thể biết khối lượng của
protein (hay chính xác hơn là tỉ lệ
giữa khối lượng với điện tích). Với
một lượng nhỏ phân tử sinh học, dù
nhỏ đến khoảng vài picomole đến vài
femtomole, vẫn có thể phân tích được
với cách này. Một máy phổ ghi khối
lượng dạng MALDI-TOF dược dùng
phân tích hỗn hợp insulin và β-
lactoglobulin. kết quả khối lượng của
2 protein này lần lượt là 5733.9 và
18,364, so với kết quả tính toán la
5733.5 và 18,388. Thí nghiệm này
cho thấy MALDI-TOF thật sự là một
kỹ thuật chính xác để xác định khối
lượng protein. Kỹ thuật này còn được
ứng dụng trong việc xác định dựa vào
khối lượng của peptide (peptide mass
fingerprinting). kỹ thuật này đã mở
rộng khả năng ứng dụng của điện di
hai chiều. Mẫu cần nghiên cứu được
chiết và phân ra một cách riêng biệt
bằng các phương pháp hóa học hay
enzyme học. Khối lượng của các phân
đoạn protein được xác định bằng
phương pháp khối phổ. Cuối cùng,
khối lượng của peptide được so với
những số liệu đã có được tính trên
máy vi tính. Kỹ thuật này cho kết quả
khá tốt. Ví dụ, trong số 150 protein

của nấm men được phân tách bằng
điện di 2 chiều, kỹ thuật này đã giúp
xác định được 80% protein.
VII. Siêu ly tâm
Siêu ly tâm không chỉ là một phương
pháp có thể phân tách một hỗn hợp
thô các thành phần của tế bào mà còn
rất hiệu quả trong việc phân tách và
phân tích những phân tử sinh học. Với
phương pháp này, chúng ta không chỉ
xác định được khối lượng và tỉ trọng
mà còn biết được cả hình dạng của
một phân tử cũng như phân tích
những tương tác giữa các phân tử. Để
có được những điểm này, chúng ta
cần một diễn tả một cách toán học là
một phân tử bị tác động bởi lực ly tâm
như thế nào. Dưới tác động của lực ly
tâm, một phân tử sẽ di chuyển qua
một môi trường lỏng. Để biết được
tốc độ di chuyển của phân tử ta cần
phải tính hệ số lắng (s) theo công
thức
với m là khối lượng phân tử, v là thể
tích từng phần (nghịch đảo của tỉ
trọng phân tử), p là tỉ trọng của môi
trường và f là hằng số lắng thường
được biểu hiện là đơn vị Svedberg (S)
bằng 10
-3

s. Giá trị S càng nhỏ, phân
tử di chuyển càng chậm.
Vận tốc lắng của một phân tử phụ
thuộc vào khối lượng của nó. Một
phân tử có cùng hình dạng cũng như tỉ
trọng với các phân tử khác nhưng
nặng hơn sẽ lắng nhanh hơn